核酸のポリアニリンベースのセンサ

この手順の全体的な目標は、ラベルフリーの方法で核酸を検出するために使用できる水分散ポリアニリンを合成することです。この手法は、核酸を検出するための費用対効果の高い方法です。それを採用するラボは、それが簡単で、堅牢で、敏感であることに気付くでしょう。

この技術の主な利点は、ラベルフリーであり、酵素操作を必要とせずにRNAやDNAを直接検出するために使用できることです。この技術は、新しい診断技術の可能性を秘めており、ラベルを使用しないため、ほとんど操作せずに患者サンプルの処理に使用できます。視覚的なデモンストレーションは、センサーのわかりやすく説明するのに役立ちます。

このプラットフォームには、非常にエキゾチックに見えますが、実際には非常に簡単に実装できるポリマー科学と生物学が含まれています。アニリンを60mlのクロロホルムに完全に溶解し、250mlの丸底フラスコに入れます。600 RPMで5分間撹拌した後、氷で摂氏0度から5度まで冷却します。

これには通常15〜20分かかります。次に、600 RPMで攪拌しながら、丸底フラスコのアニリン溶液にドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを加えます。過硫酸アンモニウムを20mlの水に溶かし、反応の過熱を避けるために30分間かけて滴下します。

摂氏0度から5度で24時間反応を行います。反応混合物は、最初は15分後に乳白色に変わり、次に2時間後には暗褐色に変わり、最後に24時間後には濃い緑色に変わるのを観察します。その後、さらに24時間室温に戻します。

PANIドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム溶液をブフナー漏斗でろ過します。濾液を80mlのクロロホルムと120mlの水と分離漏斗で混合します。溶液を室温で24時間インキュベートし、分離漏斗から濃い緑色のPANIを回収し、未反応のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムとAPSを水性上清に残します。

PANI溶液をクロロホルム水で10倍希釈し、希釈したPANI200マイクロリットルと6.4マイクロモルのプローブDNAオリゴヌクレオチドをマイクロチューブ内で15分間穏やかに振とうして混合します。PANI DNA溶液に1200マイクロジュール/1平方センチメートルのUVを架橋剤で2分間照射します。UV曝露は指示された量に制限することが重要です。

UVに長時間さらされると、PANIの蛍光変化が損なわれますが、これはおそらくPANIとDNAの共有結合クロスリークによるものです。17, 000 x gで6分間遠心分離することによりペレット複合体を調製し、リン酸緩衝生理食塩水またはPBSで洗浄します。2回目のペレット化後、PBSに再懸濁します。

200マイクロリットルのPANIプローブ複合体に、8マイクロリットルの100マイクロモルの相補的DNAオリゴヌクレオチドまたは標的核酸を添加します。溶液混合物を摂氏40度で15分間振とうしてハイブリダイゼーションを行います。PANI複合体を17,000 x gで6分間遠心分離してペレット化した後、PBSで洗浄し、水に再懸濁します。

さまざまな処理のPANIを96ウェルマイクロプレートに加え、250ナノメートルで励起することにより、270〜850ナノメートルの範囲の発光蛍光を測定します。PANIの発光ピークは、約500ナノメートルで観察されます。ハイバーダイズしたデュプレックスの蛍光顕微鏡測定を行うには、ホウケイ酸ガラスカバーにPANIをドロップコートし、スリップして摂氏40度で48時間乾燥させます。

乾燥したPANIフィルムに8マイクロリットルの100マイクロモルプローブを加え、UV光を2分間照射します。放射線照射後、PANIプローブフィルムをPBSで洗浄し、摂氏40度で48時間乾燥させます。目的の核酸を添加して15分間ハイブリダイゼーションを行います。

これは、生物学的サンプルまたは制御された標的オリゴヌクレオチドである可能性があります。続いてPBSウォッシュを行います。500ナノメートルのロングパスフィルターを使用して、40倍の倍率で蛍光画像を取得します。

ここに示されているのは、UV照射によって増強されたPANIプローブとDNAプローブの静電相互作用です。標的核酸のハイブリダイゼーションは、二本鎖形成を引き起こし、構造確認を変化させ、その結果、プローブ標的がPANI表面から解離します。この図は、溶液中と固体コーティング媒体の両方において、プローブの存在下または存在下でのPANI蛍光の変化を示しています。

蛍光の増加は、負に帯電したDNAからの電子フラックスによるもので、ポリマーの電子密度が増加します。相補的標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、プローブが剥離し、バジル蛍光の回復が促進されます。逆に、単一のミスマッチ標的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、このバジル蛍光の回復をもたらさない。

この手法の主な目新しさは、正確な相互作用のためにマイルドなUVを使用し、それが実際に非特異的な相互作用と軽い相互作用を区別するのに役立つことです。この技術を習得すると、感覚時間とコーティングの乾燥時間を除いて、最大2時間かかる場合があります。この手順を試す際には、DNAが水に溶け込み、酸性のお茶が実際にPANIの電子特性を変化させることを覚えておくことが重要です。

このビデオを見た後、視聴者は水に分散したポリアニリンを合成し、その蛍光特性を使用して核酸を検出する方法をよく理解しているはずです。彼らはプローブDNAを固定化し、ハイブリダイゼーションを実行してターゲットを検出することができます。モノマーを扱う場合、この合成は危険であり、安全メガネ、手袋、白衣などの保護具を装着したフード内で行う必要があることを覚えておくことが重要です。