Name: 傾斜孔サイズを有するポリ（乳酸）スキャフォールドを製造するために簡便かつ環境に優しいルート (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: 学ぶ、融解混練と選択的浸出を用いたポリ乳酸スキャフォールド製造法。傾斜孔サイズを持つ三層構造の作製と、生理環境での機械的特性評価について解説します。

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この作業はINSTMによって財政的に支援されました。

1.足場製作<ol><li> 20分間実験室ブレンダー中のNaClを粉砕し、100℃のヒーターでそれを乾燥させます。 </li><li>共振で発生することなく、利用可能な最高周波数で30分間ふるい機で乾燥させたNaClを（一度に45グラム）を入れてください。 500ミクロン〜1000ミクロン（M 500）に至るまで、6塩画分を収集します。 300ミクロンから500ミクロン（M 300）へ。 100μmから200μmの（M 100）。 90ミクロンから100（M 90）へ。 図1に図式のような塩の粒子と45ミクロン〜65ミクロン（M 45）から、最終的にM 10は、45ミクロンよりも小さいサイズ。 </li><li>真空は、処理中に加水分解切断を回避するために、一晩、すべての材料を乾燥させます。ガラス転移 - ポリマーの場合に - 各材料については、克服することなく、乾燥の程度を最大化するために温度を選択します。したがって、PEGのためのPLAのためのT = 90℃、T = 25°C、T = NaClを105℃を選択します。 </li><li>フィード通常、約後、次にそれぞれ20/5/75の重量パーセント組成を有するPLA、PEGおよびNaCl、T = 190°Cで動作するバッチミキサーおよびN = 60回転数とトルクの一定値を達成するまで、それらを処理し、 10分。その後、急速に得られた材料を集めます。 </li><li> 10ミリメートルの直径と3ミリメートルの高さと適切な円筒状の金型でブレンドを入れて、周囲圧力で60秒、3分の180バーでのためにそれらを保つため、210℃で動作する実験用プレスを用いて、単層を準備します。その後、180バールの圧力を維持し、室温でブレンドを冷却します。 </li><li>圧縮成形を介した三層の組立<ol><li> 10mmの直径および1mmの高さを有する同一（1.5）に記載されているような方法が異なる金型を用いて、すなわち、各単層を調製します。最後に、6つのディスクは、6つの異なる粒子サイズを含む、10mmの直径および1mmの高さを有し得る：M 500、M 300、M 100、 </li><li>フォーR 3層足場A（TLS A）を組み立て、M 500、M 300を積み上げるとM 100、円筒状金型内および周囲圧力で60秒間、210℃で動作する実験用プレスでそれらを圧縮成形し、3分でその後、180バーとは、180バールの圧力を維持し、室温で冷却しました。 注：相互M 90上に積層してTSL Bを準備M 45とM 10と同じ金型及びTLS Aに用いたのと同じ手順に従って、圧縮成形作業を行います</li></ol></li><li>円筒型からディスクを削除し、攪拌せずに、沸騰脱塩水浴に入れます。 3時間後、浴から得られた多孔質構造体を除去し、化学フード中、室温で12時間のためにそれらが乾燥してみましょう。 </li></ol> 2.形態素解析<ol><li>走査型電子顕微鏡により、足場の形態を評価します。 <ol><li>取り付け後、液体窒素下で試料を分解し、接着剤カーボンテープを使用したアルミニウムスタブ上のサンプル。最後に、スパッタcoateを金で撮影前にアルゴン雰囲気下で90秒間の試験中に静電放電を回避するために。 </li></ol></li></ol> 3.足場孔径<ol><li>足場の孔径分布を認識することができる画像処理ソフトウェアを用いてSEM分析によって得られた画像を精巧。 注：この研究では、細孔径分布分析は、MATLABベースのソフトウェアを用いて行った以前33に記載</li></ol> 4.気孔率<ol><li>浸出の前にサンプルを秤量し、次式により理論的な多孔性を評価します： <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54595/54595eq1.jpg" /> 注：NaClを 、 メートルPEGおよびm PLAを M、均質なブレンドを仮定することにより、それぞれのNaCl、PEG、およびPLAの理論上の質量です。 T彼は（ρ）のNaCl、PEG及びPLAのは、それぞれ2,16グラム/ cm 3であり、1,12グラム/ cm 3の電子1,24グラム/ cm 3である密度。 </li><li>試料（ρ 骨格 ）の見掛け密度を評価するために浸出し、乾燥後の試料を秤量し、次に足場の見掛け密度との比とすることにより、非多孔質PLAの濃度の逆数として実際の多孔性を評価します式（2）を使用。 注：これは、足場の空のボリュームと（空+フル）足場のフルボリュームとの間の比率を表しています。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/54595/54595eq2.jpg" /></li></ol> 5.機械的性質<ol><li> 1 kNのロードセルを装備した引張機を使用して、圧縮モードでサンプルをテストします。分-1 1mmの一定の歪み速度を設定します。 </li><li>生理学的環境におけるサンプルの機械的性能を調べるために、dynamometeを装備37℃で含有する浴（PBS）、（でpH = 7.4）とrと点5.1で説明したものと同じ設定でテストを行います。 <ol><li>湿潤環境内の各測定の前に、PBSは、全ての孔を埋めるようにするために5分間の真空フラスコ中で、PBSでサンプルを浸します。その後、足場は設定点温度に到達するために15分間37℃でPBS中に残存することを可能にします。 </li></ol></li><li>文献32,34に記載の方法以下の機械的試験機に接続されたカスタムデザインの界面強度試験装置を用いてTL AとTL Bの層の間の界面接着強度（IAS）を決定します。 <ol><li>リグ上の足場を修正して、マシンのロードセルとベースプラテンとの正確な位置合わせを確保します。高粘度の接着剤を用いてアルミニウム試験スタブに足場サンプルを取り付け、テストのための機器に入れます。 </li><li>湿潤状態の試験では、1時間のpri PBS中のサンプルを水和または試験へ。分-1 1mmのひずみ速度で適用される引張荷重の下で、1 kNのロードセルを使用してください。 注：障害がいずれかの層の一つの極限引張強さでため、または界面での剥離の発生する可能性があることを考慮してください。応力 - ひずみ曲線の最大強度としてIASを評価します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

最初の重要なステップは、効率を篩い分けの最適化です。 NaClの粒径の高い制御は、所望の細孔サイズ分布を有する足場を調製するための基本です。もう一つの重要なステップは、金型からサンプル抽出の際に薄いPLA単層の破壊を回避されています。画像処理解析は、装置全体の代表ではないかもしれません。 引張試験中、サンプルは機器から離れて引き裂くことができます。 ステップをふるい分けする前に、塩をよくのNaCl粒子サイズのより高い制御を得るために乾燥されていることを確かめます。この問題は、その非常に高い吸湿性に起因し、特に最小の塩の粒子サイズのために重要です。圧縮成形工程の前に、金型からのサンプルの除去を容易にするために、金型の上に薄いテフロンスプレーコーティングを施します。画像処理解析を採取異なる画像を考慮して行わなければなりません足場の異なる領域から、彼らは装置全体の代表的なものであることを確認します。最後に、引張試験（湿潤環境で行わ特に）の前に、慎重に密着をサンプリングする接着剤を検証します。 <p class="jove_c...

プラスチック廃棄物に対する懸念の高まりと再生不可能な資源の使用削減により、ここ数年で学界と産業界の両方で生分解性ポリマーへの関心が重要性を増しています1-7。特に、生体適合性および生分解性の合成ポリマーは、薬物制御放出8,9、吸収性縫合糸8,10、バイオプロセス強化11、組織工学12など、いくつかの生物医学的応用分野で広く普及している。
組織工学は、病気や傷ついた組織の正常な機能を回復し維持できるデバイスの開発に焦点を当てています。ほとんどの天然組織は、特定の空間階層にあるさまざまな種類の細胞と細胞外マトリックス(ECM)で構成されています。例えば、関節軟骨(AC)は、コラーゲン繊維とコラーゲン結合タンパク質の種類と向きが異なるさまざまなゾーンで構成されています。さらに、軟骨と骨は大きく異なる階層構造を示しています。これに関連して、各層に工学的特性を有する多層足場の調製は、これらの複雑なシステム13,14のすべての局所微小環境を考慮に入れることにより、不均一な組織を置き換えることを可能にする可能性がある。
足場の細胞的/生物学的および/または物理化学的特性に基づいて、組織工学によって採用される主な戦略は、単相性、二相性、および三相性に分けることができます。二相性および三相性アプローチ(BTA)は、2つまたは3つの異なる細孔構造、材料、またはフィラーを使用して、多層機能デバイスを調製します。さらに、単一の材料を使用して、その物理的特性12に勾配を作り出すことが可能である限り、二相性または三相性デバイスを達成することができる。
細胞の移動は、形態形成、炎症、創傷治癒、腫瘍転移において重要な役割を果たします。細胞の移動は、デバイスの表面からコアまでの化学的物理的特性の勾配の存在によって促進されます。したがって、上記の要件を満たす生体材料は、細胞移動の研究に役立ちます。細胞の移動(走化性)を引き起こす化学的勾配に加えて、細胞培養基質の機械的特性も細胞の移動(機械化性)につながる可能性があります15。
多層構造は、ポリマーマトリックス内に組み込まれた特定の薬物の調整可能な放出を提供することもできます。これは、層の特定の領域またはロードされた薬物の量を変更することによっても可能になります。
過去10年間で、多孔性や細孔サイズなどの形態学的特性の離散的または連続的な勾配を持つ足場を開発するために、いくつかのアプローチが提示されてきました16-31。最新の論文は、粒子浸出12,28,32、ガス発泡技術16、エレクトロスピニング17-19、層ごとの鋳造技術20、ラピッドプロトタイピング21,22、熱誘起相分離(TIPS)22、遠心分離凍結乾燥24,25、三重周期最小表面(TPMS)26、凍結鋳造27-30を採用することにより、BTAの調製に焦点を当てました。
この作業の枠組みの中で、溶融混合、圧縮成形、塩浸出を組み合わせることにより、PLAベースの3層多孔質足場(TLS)を達成するための迅速で簡単な方法を提示します。足場製造に一般的に使用されるほとんどの技術とは異なり、ここで採用される戦略は、環境および生細胞および組織32に対して潜在的に危険な有毒な溶媒を必要としないため、完全に環境に優しいと見なすことができる。 本研究で、作製デバイスの形態学的特徴と機械的挙動の両方を解析することにより確立された基本的な処理-構造-特性の関係は、特定の標的特性を持つ多機能傾斜足場の設計における将来の進歩への指針となります。

<table><tbody><tr><td>ポリ(乳酸)</td><td>ネイチャーワークス</td><td>PLA 2002D</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール)</td><td>Σ</td><td>83797-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>クロライドナトリウム</td><td>Σ</td><td>793566-5KG-D</td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝液</td><td></td><td>Σ P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>ラボミキサー</td><td>Brabender</td><td>PLE 330 - Plasticorder</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Press</td><td>Carver</td><td></td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>Phenom-world</td><td>ProX</td><td></td></tr><tr><td>万能試験機</td><td>Instron</td><td>3365(英国)</td><td></td></tr><tr><td>BioPulsバス</td><td>インストロン、ノーウッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ふるい分け機</td><td>Endecotts</td><td>E.V.F.1。</td><td></td></tr><tr><td>真空オーブン</td><td>ISCO</td><td>NSV9035</td><td></td></tr><tr><td>精密天びん</td><td>ザルトリウス</td><td>AX224</td><td></td></tr></tbody></table>

傾斜孔サイズを有するポリ（乳酸）スキャフォールドを製造するために簡便かつ環境に優しいルート

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

近年、機能的に等級付けされた足場(FGS)は、組織工学のための機器の製造において重要な役割を獲得しています。この新しいバイオマテリアル研究分野の重要性は、ある構造や組成物から別の構造や組成への連続的な変化など、さまざまな組織の複雑な機能を模倣できるインプラントを開発する必要性によるものです。この後者の文脈では、骨-軟骨界面組織のための適切な足場の設計に関する主要な関心事の1つが関係しています。この研究では、ポリ(乳酸)(PLA)、塩化ナトリウム(NaCl)、ポリエチレングリコール(PEG)を溶融混合することにより、細孔径が傾斜した3層の足場が達成されました。細孔径分布は、NaCl粒度法とPEG溶媒和法によって制御されました。足場は、形態学的および機械的な観点から特徴付けられました。調製方法、細孔構造、および圧縮力学的挙動との間に相関関係が見出された。界面接着強度は、カスタム設計の界面強度試験を使用して定量的に評価されました。さらに、人間の生理機能を模倣するために、37°Cのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で機械的試験も行われました。ここで提示する方法は、多孔性、細孔サイズ分布、および機械的性能を高度に制御するため、シンプルで環境に優しいルートをたどることにより、カスタマイズされた特性を持つ3層構造の足場を製造する可能性を提供します。

足場の孔のアーキテクチャ上のNaCl粒子サイズの影響は、それぞれ、試料の形態を調査し、画像解析により細孔サイズ分布を計算することによって定性的および定量的に評価した図2a - 。fは 、得られた単層足場のSEM顕微鏡写真を示します別のNaCl粒子サイズを含む材料の塩浸出から。 より詳細には、M 500（ 図2a）は、おそらく溶融混合中に500ミクロンよりも大きい直径を有する塩粒子の破壊に、500μmの平均直径を有する細孔を示しました。同図から明らかなように見える、細孔構造は、約10μmの壁に囲まれ乏しい相互接続された不規則な気孔、、の数が少ないことを特徴としている。 図2bは、このでM 300の形態を報告しますケースは、細孔は、このように何も粒子破壊が溶融混合プロセス内で発生していないことを確認し、溶融混合（300~5...

この研究では、溶融混合と選択的浸出の組み合わせを使用して、ポリ(乳酸)/ポリエチレングリコール(PLA/PEG)の足場を調製しました。ここで論じた方法は、気孔率と細孔サイズの両方を高度に制御することにより、3層の足場を開発することを可能にした。機械的特性も生理学的環境で評価されました。

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

組織工学は、疾患や損傷を受けた組織において、正常な機能を回復および維持させることが可能なデバイスの開発に焦点を当てています。天然組織の多くは、特定の空間的階層構造を持つ異なる種類の細胞と細胞外マトリックスで構成されています。例えば、関節軟骨は、コラーゲン線維やコラーゲン結合タンパク質の種類と配向が異なる複数の領域で構成されています。組織工学で採用される主な戦略は、単相性、二相性、および三相性のアプローチに分けることができます。二相性および三相性のアプローチでは、2種類または3種類の異なる細孔構造、材料、あるいは充填剤を用いて、多層構造の機能性デバイスを作製します。また、1つ以上の物理的特性に勾配を付けることが可能であれば、単一の材料を用いて二相性または三相性のデバイスを実現することもできます。本研究では、ポリ乳酸ベースの3層多孔質スキャフォールドを構築するための、迅速かつ簡便な手法を提示します。他の多くのスキャフォールド製造技術とは異なり、本手法は環境や組織内の生細胞にとって危険な毒性溶媒を一切必要としないため、環境に配慮した戦略であると言えます。具体的には、提案する経路は、溶融混合、圧縮成形、および塩浸出法を組み合わせたものです。作製したデバイスのプロセス、構造、および特性の関係に特に注目し、構造の形態学的解析と機械的挙動の両方を調査しました。塩化ナトリウムをラボ用グラインダーで20分間粉砕しました。その後、塩化ナトリウムをヒーターで100 °Cで乾燥させ、共振が発生しない最高周波数で、ふるい機を用いて30分間分級しました。選択した6つの分画は、1,000 micronsから500 microns、500 micronsから300 microns、200 micronsから100 micron、100 micronから90、および65から45であり、最後の分画は塩粒子のサイズが45 microns未満のものでした。加工中の加水分解による切断を避けるため、すべての材料を一夜中真空乾燥させました。乾燥温度は、polylactic acidが90 degrees C、polyethylene glycolが25 degrees C、sodium chlorideが105 degrees Cでした。溶融混練の前に、polylactic acidを20 weight percent、polyethylene glycolを5 weight percent、sodium chlorideを75 weight percentの割合でビーカーに入れ、機械的に混合しました。その後、これらの材料をバッチミキサーに投入しました。温度を190 °Cに、ローター速度を60 RPMに設定した。トルク値が一定になるまで材料を処理し、通常は約10分後に完了した。その後、ブレンド物を送り出し、液体窒素で急冷した。各層を準備するために、ブレンド物を実験室用プレス機を用いて210 °Cで圧縮成形しました。サンプルは、直径10 millimeter、高さ3 millimeterの適切な円筒形金型で成形しました。材料を、周囲圧および210 °Cで60秒間予熱しました。その後、圧力を180 barsまで上げ、3分間保持しました。次いで、圧力を180 barsに維持したまま、ブレンド物を室温で冷却しました。異なる塩粒子径を用いて調製したポリマー塩化ナトリウムブレンドを、直径10 mm、高さ3 mmの適切な円筒形型に注入した。その後、材料をさらに5分間圧縮成形した。より詳細には、2種類の異なる3層構造スキャフォールドを調製した。ある例では、塩化ナトリウムの粒子径が1,000 µmから500 µm、500 µmから300 µm、および200 µmから100 µmの範囲であるブレンドを積層させることで、3層構造を得ました。別の3層スキャフォールドでは、塩化ナトリウムの粒子径が100 µmから90 µm、65 µmから45 µmの範囲のブレンドを積層させ、最層に45 µm未満の塩粒子を含むブレンドを積層させて作製しました。その後、これらのブレンドを円筒形モールドから取り出して重量を測定し、撹拌せずに沸騰脱塩水に3時間浸漬しました。得られた構造体は、その後、ドラフトチャンバー内で室温で12時間乾燥させた。さらに、連続性と吸水性を評価するため、乾燥前後の試料の重量を測定した。各試料の理論的空隙率は、以下の式に従って評価した。混合物の組成は、理論的な気孔率が70.8%となるスキャフォールドを得るように設計されました。設問2で算出された気孔率は、すべてのスキャフォールドタイプにおいて理論値に非常に近く、すべてのポロゲン剤がデバイスから抽出されたと結論付けるのは妥当であると考えられます。スキャフォールドの形態は、走査電子顕微鏡を用いて評価しました。サンプルは液体窒素下で破断させました。次に、 specimenを導電性カーボンテープを用いてアルミニウムスタブに固定しました。生理学的環境下での圧縮試験を行う前に、真空フラスコを用いてサンプルにリン酸緩衝生理食塩水を充填しました。この方法により、溶液をスキャフォールドの空隙体積全体に浸透させることができます。最後に、層間に生じる界面接着強度を評価するために、引張試験を実施しました。走査電子顕微鏡分析により、塩化ナトリウムの粒子径がスキャフォールドの多孔質構造に強い影響を与えることが確認されました。図1aおよびfは、異なる粒度の塩を満たした材料を浸出させて作製したスキャフォールドの走査電子顕微鏡像を示しています。孔径の測定により、スキャフォールドの平均孔径は、ポリマーマトリックスに充填された塩化ナトリウムのサイズによって強く制御されていることが明らかになりました。特に、1,000から500ミクロンの範囲で分級された塩を含むブレンドから得られたスキャフォールドでは、平均直径500ミクロンの孔が観察されました。これは、溶融混練中に直径500ミクロンを超える塩粒子が破壊されたためと考えられます。また、同じ図から明確に見て取れるように、孔構造は、不規則な形状の孔が少数存在し、相互接続性が低く、約10ミクロンの壁に囲まれていることが特徴です。図1bは、500から300 µmの範囲の塩を用いた場合に得られたスキャフォールドの形態を示しています。この場合、細孔の平均径は、溶融混練時に充填した塩粒子の範囲内であることが分かり、溶融混練プロセスにおいて粒子の破砕が起こらなかったことが確認されました。細孔周囲の壁は、前回のものよりも薄く、約5 µmであることが分かりました。200から100 µmの範囲の塩を使用したことで得られたスキャホールドは、より小さな孔に囲まれた100から200 µmの大きな孔からなる不均一なネットワークを特徴とする、バイモーダルな多孔質構造を示しました。この孔構造により、孔同士の相互接続性と単位体積あたりの孔の量が高まりますが、一方で壁厚の著しい減少を招きます。100から90 µmの範囲の塩を使用して得られたスキャホールドの形態は、ポリマーマトリックス全体に均一に分布した、概ね立方体状の孔を示しました。ポリエチレングリコールの溶媒和により、実際には非常に粗い外観を持つ壁面内部に微細孔が存在することが分かりました。45〜65 µmの範囲の塩を用いた足場材料の走査電子顕微鏡写真では、単位体積あたりの孔数が多く、その直径は45〜765 µmの範囲でした。最終的に、45 µm未満の塩を用いて作製した足場材料において、単位体積あたりの孔数が最大となりました。孔構造は、平均孔径約20 µmであり、高い相互接続性と1 µm未満の非常に薄い壁を有していました。組み立てられたスキャフォールドの形態は、3つの異なる平均孔径を示す、明確に区別される3つの層によって特徴付けられました。予想通り、各層は組み立ておよびリーチング工程後も、同様の孔構造を維持していました。明確に見て取れる通り、デバイス全体に内部亀裂はなく、異なる層の間でマトリックスの不連続性も認められませんでした。圧縮試験では、平均孔径が減少するにつれて、サンプルの弾性係数が低下することが観察されました。湿潤条件下での試験では、弾性係数が約10%低下しました。とはいえ、デバイス全体の機械的挙動に変化はありませんでした。3層構造のデバイスは、それぞれの最も脆弱な層と同等の弾性率を示しました。試験の結果、3層構造デバイスの破断は約半分まで脆弱な層の中央部分で発生しており、剥離プロセスは観察されませんでした。収集したデータにより、界面密着強度は最も脆弱な層の強度の10倍以上であることが確認され、走査電子顕微鏡分析による観察結果が裏付けられました。結論として、本研究では、溶融混合、圧縮成形、および選択的浸出を組み合わせることで、不連続な細孔径勾配を持つポリ乳酸ベースの分解性スキャフォールドを開発しました。走査電子顕微鏡分析により確認された通り、これらのデバイスは、溶融混合段階での塩化ナトリウムの粒度を制御することで、約70%の空隙率を持つ相互連結した細孔構造と、予測可能な細孔径を実現しています。形態学的分析により、3層構造のスキャフォールドは、異なる細孔径を持つ各層が強固に固定されていることが示されました。界面密着強度試験により、剥離のないI層の密着性が明らかになりました。

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Research

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Bioengineering

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