単離とマウスリンパ球の活性化

この実験の全体的な目標は、さまざまなin vitroおよびin-vivo機能アッセイを使用して、精製されたマウスリンパ球の機能的能力を研究することです。この方法は、免疫学および分子生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、遺伝子欠損リンパ球における目的タンパク質の機能の調査など。

この技術の主な利点は、最小限の操作と環境ストレスでリンパ球を迅速に精製できることです。B細胞を精製するには、300マイクロリットルのバランスの取れた塩溶液またはFBSを添加したBSSで、赤血球をスライスした全脾臓細胞を最大1回、10回から8回まで再懸濁します。次に、50マイクロリットルの抗CD43磁気マイクロビーズを追加します。

死んだ細胞を除去するには、30マイクロリットルのアネキシン5磁気ビーズを摂氏4度で30分間追加します。細胞懸濁液を15分間隔でフリックして、細胞が均一に標識されるようにします。インキュベーションの最後には、B標識細胞に14ミリリットルのBSSをFBSを添加しました。

遠心分離後、上清を取り除き、チューブをフリックし、FBSを添加した室温BSSの1〜3ミリリットルにペレットを再懸濁します。遠心分離中に、分離カラムを磁気ラックにロードし、カラムの先端に滅菌済みの21ゲージ針を取り付けて流量を減らします。カラムを2ミリリットルの室温BSSで平衡化します。

ペレットを室温の1〜3ミリリットルに再懸濁した後、BSSは収集チューブを針の下に置き、B標識細胞を平衡化カラムにロードします。15ミリリットルの円錐形チューブに流れを集めます。次に、FBSを添加した1ミリリットルの新鮮なBSSでカラムをすすぎます。

回収した標的細胞と洗浄液をプールし、アルエットを含む標的細胞をカラムに再ロードし、同じ15ミリリットルのチューブに流れを収集します。そして、FBSを添加した1ミリリットルのBSSでカラムを3回洗浄し、標的細胞懸濁液で洗浄液をプールし続けます。3回目の洗浄後、カラムを磁石から取り外し、FBSを添加した5ミリリットルのBSSをロードします。

カラムプランジャーを使用して、磁気標識された非標的細胞を新しい15ミリリットルチューブに洗い流します。次に、分離した細胞の純度をフローサイトメトリーで確認します。分離カラムを再利用するには、磁気ビーズ標識細胞を洗浄した後、カラムを上から5ミリリットルのPBSで3回洗浄し、1回の洗浄で5ミリリットルの蒸留水で3回洗浄します。

次に、同様にカラムを5ミリリットルの70%エタノールで洗浄し、エアタップを使用してカラムを完全に乾燥させてから保管します。新しい精製実験でカラムを再利用するには、5 ミリリットルの 70% エタノールでカラムを下から上に再洗浄し、続いて 5 ミリリットルの PBS 洗浄を 2 回行います。次に、カラムの上部に5ミリリットルのPBSをロードして、最後の洗浄を行います。

そして、カラムを2ミリリットルの室温BSSで平衡化します。その後、カラムに実験細胞集団をロードできます。B精製細胞をCFSEで標識するには、15ミリリットルの円錐管に新たに調製した標識溶液で細胞を2回洗浄します。

第2のペレットを新鮮な37°Cの標識溶液中で1ミリリットルあたり10〜7番目の細胞濃度の2倍で再懸濁する。毎回、サンプルを遠心分離機にかけ、上清を取り除き、チューブをフリックします。次に、1部の細胞懸濁液で細胞を1部に新たに調製した10マイクロモルCFSE溶液の比率で、暗所で摂氏37度で10分間標識します。

2分ごとにチューブを反転させ、染料が均一に分布するようにします。細胞ペレットが標識溶液に完全に懸濁していることを確認するように注意する必要があります。細胞凝集は、CFSE標識の均一性に影響を与える可能性があります。

インキュベーションの最後に、RPMI培地を加えてCFSEを急冷し、数容量の氷冷完全RPMI培地で細胞を2回洗浄します。細胞が正常に標識された場合、ペレットの色は黄色になります。次に、適切な刺激でコーティングされた96ウェルの平底板をPBSで2回洗浄します。

CFSE標識B細胞の場合、6番目のB細胞/ミリリットルを10倍に再懸濁し、RPMI培地を完了し、1ウェルあたり100マイクロリットルのB細胞をコーティングされたプレートに72時間三重に播種します。この枯渇法により、ビーズ単離されたOT1-CD8 T細胞の純度を72.8%から94.2%に向上させることができる。その後、細胞を実証したばかりのCFSEで標識し、生体内増殖の分析のためにレシピエント動物に養子として移植することができます。

さらに、抗CD45.1抗体標識を使用して、レシピエントマウスのリンパ器官における養子移植されたドナーCD-45.1陽性OT1-CD8 T細胞としてのCFSE発現細胞の同一性をさらに確認することができる。あるいは、精製されたT細胞をin vitroで刺激し、その増殖をトリチウム化されたチミジンの取り込みによって評価することができます。この方法により、脾臓B細胞の純度の大幅な増加も達成されます。

精製されたB細胞の下流の機能解析のための同様の機会を促進します。一度習得すれば、このテクニックは2時間で完了することができます。この手順を実行することにより、精製およびCFSEラベリング中を除いて、CI懸濁液を常に氷上に保持することが重要です。

精製リンパ球は、遺伝子組み換えリンパ球の末端シグナル伝達能力に対する免疫ブロッティングなどの他の機能アッセイにも使用できます。このビデオを見れば、B細胞およびT細胞の精製方法や、さまざまなin vitroおよびin vivo機能アッセイに細胞を使用する方法について、より理解できるはずです。