Name: 単離とマウスリンパ球の活性化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶマウスリンパ球の単離と活性化手法。抗CD43磁性マイクロビーズを用いてB細胞を精製し、in vitroおよびin vivo機能アッセイで遺伝子改変リンパ球の生理機能を解析する効率的なプロトコルを解説します。

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研究は、シンガポール（ACRFのTier1-RG40 / 13およびTier2の-MOE2013-T2-2-038）、教育省によってサポートされています。原稿がObrizusコミュニケーションズからのエイミー・サリバンが編集しました。

全てのマウスを交配させ、特定の病原体を含まない条件下で維持し、すべてのマウスプロトコルは、施設内動物管理使用委員会のガイドラインに従って行われています。 緩衝液および試薬の調製<ol><li> 、55μM2-メルカプトエタノールを完全ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地（10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）、2mM L-グルタミン、ペニシリン（100 IU / ml）を/ストレプトマイシン（100μg/ ml）を準備します）。 </li><li>これとは別に、20倍の平衡塩類溶液（BSS）ストック1およびストック2を準備します。 <ol><li> 20倍BSSストック1（1 Lの滅菌水で111 mMのブドウ糖、8.8 mMリン酸カリウム、26.7 mMのリン酸ナトリウム二塩基性）を準備し、最終容量調整前の20倍BSSストック1に40ミリリットルの0.5％フェノールレッドを追加します。 4℃で保存する前に、0.2μmのフィルターを用いて滅菌濾過します。 </li><li> 20X BSSストック2（25.8 mMの塩化カルシウム二水和物、107 mMの塩化カリウム、2.73 MナトリウムCHを準備loride、19.6 mMの塩化マグネシウム六水和物、1 Lの滅菌水で16.6 mMの硫酸マグネシウム）。 4℃で保存する前に、0.2μmのフィルターを用いて滅菌濾過します。 </li><li> 400ミリリットル滅菌水それぞれに、別々に、50ミリリットルBSSストック1と50ミリリットルBSSストック2を希釈し、実験的な使用のために1X BSSを準備します。 、両方の希釈液を組み合わせてpHを7に調整し、20ミリリットルのFBS（2％）を追加します。 0.2μmのフィルターを用いて滅菌水と滅菌フィルターを使用して1 Lまでトップ。 注：濃厚BSSストックの混合が直接析出につながる可能性があるため、BSSストック溶液を別途準備する必要があります。 </li></ol></li><li>赤血球（RBC）溶解バッファー<ol><li> RBC溶解緩衝液を調製するために、使用前に1部株式トリス塩基（滅菌水中の130mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、pHは7.65）に9部ストック塩化アンモニウム（滅菌水中の155 mMの塩化アンモニウム）を混合します。 注：4℃で塩化アンモニウムおよびトリスベースのストア滅菌ストック溶液。溶解bを準備しますRBCの効率的な溶解を確実にするために、新鮮なuffer。 </li></ol></li></ol>脾臓またはリンパ節からリンパ球懸濁液の2世代注：マウスの安楽死の前に、実験に必要な全ての試薬および装置を準備して、高い細胞生存率を維持するために、できるだけ早くリンパ球の単一細胞懸濁液を生成することが重要です。 <ol><li>頸椎脱臼またはCO 2窒息により実験マウスを安楽死させます。 注：これ以降のステップで、すべての実験手順は、無菌的に行うべきです。 </li><li>任意の切開を行う前に、70％エタノールにマウス全体を浸し。無菌的に8脾臓およびリンパ節を削除し、（ステップ1.2.3から）5ミリリットルの氷冷RPMI / FBS（2％FBSを含むRPMI）やBSS / FBSを含む別の15ミリリットルチューブに配置します。 注：BSSは、効率的なRBC溶解を防止するため、脾細胞懸濁液を調製するためのRPMIを使用しAFTE BSSに切り替えますRBC溶解をrは。 </li><li> 2ミリリットルの氷冷RPMI / FBSまたはBSS / FBSを含むペトリ皿に無菌100μmのセルストレーナーメッシュの2枚の間に臓器（複数可）を置き、脾臓またはリンパ節からの単一細胞懸濁液を生成するには。それは非常に細かい部分に引き裂かれるまで1mlシリンジのプランジャーを用いて、器官（複数可）をマッシュ。 </li><li> 15ミリリットルチューブに細胞懸濁液を移し、セルストレーナーを氷冷RPMI / FBSまたはBSS / FBSでメッシュ洗います。 、残りの細胞懸濁液を収集し、同じ15 mlチューブに追加し、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。上清を取り除きます。 注：後続のステップでRBC溶解緩衝液または培地を添加する前に、指でチューブをフリックすることによりペレット化した細胞を再懸濁します。 </li><li>細胞懸濁液の遠心分離中に室温（RT）RBC溶解バッファーを準備し（ステップ1.3を参照してください。）。細胞をペレット化し、上清を除去した後、すべての10 8個の細胞1mlのRBC溶解緩衝液を用いて細胞を再懸濁します。 IncuBATE 3-4分間室温で溶解反応。 </li><li> 14ミリリットルの氷冷BSS / FBSを停止RBC溶解し、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。 </li></ol> B及びT細胞の3精製<ol><li> B細胞の精製<ol><li>血球計数器を用いて細胞を数えます。 300μlのBSS / FBSで最大10 8脾臓細胞を再懸濁し、50μlの抗CD43に磁性マイクロビーズ9,10を追加します。 、死んだ細胞を除去30μlのアネキシンV磁気ビーズを追加します。 30分間、4℃の冷蔵庫中の細胞懸濁液をインキュベートします。 </li></ol></li><li> T細胞の精製<ol><li>血球計数器を用いて細胞を数えます。再懸濁し、標的細胞集団に応じて非T細胞枯渇抗体カクテルで10 8細胞CD19、B220、GR-1、TCR-γδ、CD49b、CD11cの、のCD11b、TER119およびCD4またはCD8に対する（ビオチン化抗体まで/ FBS 4,5200μlのBSSに200：）精製され、1に希釈しました。中の細胞懸濁液をインキュベート15分間、4℃の冷蔵庫。 </li><li>インキュベーション後、細胞を洗浄し、4℃で5分間、453×gでスピンダウンする10ミリリットルBSS / FBSを追加します。上清を除去し、30μlのストレプトアビジンマイクロビーズおよび15μlのアネキシンV磁気ビーズを165μlのBSS / FBS中で細胞を再懸濁します。 30分間、4℃の冷蔵庫中の細胞懸濁液をインキュベートします。 注：、あっても磁性マイクロビーズで標識することを確認し、15分間マイクロビーズを用いて細胞をインキュベートし、その後、15ミリリットルチューブをタッピングにより穏やかに細胞懸濁液を混合し、ステップ3.1.1の間に、別の15分間インキュベートします。または3.2.2。 </li></ol></li><li>細胞精製のための分離カラムの調製<ol><li>細胞のマイクロビーズ標識の中に未使用の分離カラムを準備する（ステップ3.1.1。または3.2.2。）。 RTへ（FBSなし）プリ暖かいBSSと無菌的にカラムを洗浄し、平衡化するために2ミリリットルを使用しています。 BSSで平衡化した後、洗浄し、カラムを乾燥させてはなりません。 注：私たちはLS cを使用しますolumn代わりに推奨されるLDの列の、その再利用性に（ステップ3.4を参照してください。）。 </li><li>磁気ビーズで標識した後、細胞を洗浄し、4℃で5分間、453×gでスピンダウンする14ミリリットルBSS / FBSを追加します。上清を除去し、1-3で細胞ミリリットルRT BSSを再サスペンド。 </li><li>精製のプロセスの間に流量を減らすために、カラムの先端に滅菌21 Gの針を取り付けます。平衡化したカラムに細胞懸濁液をロードし、精製された標的細胞を含有するフロースルーを集めます。 注：ロード中にカラムに気泡を導入することは避けてください。 </li><li> 1ミリリットルBSS / FBSで一回カラムを洗浄し、精製された標的細胞を含有するフロースルーを集めます。再び通る流れでカラムをリロードします。同じ15ミリリットルチューブ内の第二の負荷後のフロースルーを収集します。 </li><li> 1ミリリットルBSS / FBSでカラムを3回洗浄し、精製された標的細胞を含有するフロースルーを集めます。その後、目に5ミリリットルBSS / FBSを追加電子カラムと、プランジャーと、新しい15ミリリットルチューブにカラムから磁気標識された細胞を洗い流します。 </li><li>精製されたBまたはT細胞4,5の表面抗原に結合する抗体を用いたフローサイトメトリーによって収集された細胞の純度を確認してください。 </li></ol></li><li>分離カラムを使用して再 注：LSカラムは、浄化効率に影響を与えることなく、4回まで再利用することができます。 <ol><li>プランジャーを使用して上から水を5mlの蒸留で5 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回カラムを3回洗浄します。 </li><li> 5ミリリットル70％エタノールでカラムを洗浄し、カラムに錆の蓄積を防ぐために空気タップを使用して広範囲にカラムを乾燥。 </li><li>個別の精製実験のために使用されるLSカラムを準備するには、シリンジアダプタを使用して、5ミリリットル、70％エタノールで下から上カラムを洗浄。次に、5ミリリットル一度列の先頭からPBSに続いて5ミリリットル滅菌PBSで2回ボトムアップからカラムを洗浄。 2を追加します。ミリリットルRT BSSは、カラムを平衡化した後、標識された細胞でカラムをロードするに進みます。 </li></ol></li></ol> 4. CFSE標識および刺激注：精製細胞は、in vitroでの様々なおよびインビボ機能アッセイにかけることができます。ここでは、APCは5のT細胞刺激能を決定するために、精製されたT細胞を使用します。 <ol><li> 37°Cの前CFSEをロードする前暖かい標識溶液（PBS中0.1％FBS）。 注：PBS中のFBSの低い割合を使用すると、CFSEのロード中に細胞死を減少させ、遠心分離中の細胞損失を最小限に抑えることができます。しかし、あまりにも多くのFBSはCFSEのロードを妨げる可能性があります。 </li><li>標識溶液で2回精製した細胞を洗浄し、15mlチューブ中の予め温めた標識溶液中で2×10 7細胞/ mlで再懸濁しました。 </li><li>予め温めておいた標識溶液中で：（5 mMのCFSEストック溶液の500倍希釈）10μMのCFSE溶液を調製します。 CFSEソリューションべきたて最適なラベリングを達成するたびに調製すること。 </li><li> CFSEで細胞をロードするには、15 mlチューブで1部10μMのCFSE溶液に1部の細胞懸濁液を追加し、37℃で10分間、暗所でインキュベートします。 5μMのCFSEの最終濃度は、1×10 7細胞/ mlを標識するために使用されます。 </li><li> CFSEのロード中に細胞の均質な混合物を確実にするためにチューブを2分ごとに反転します。 </li><li>反応を停止するには、氷のように冷たい完全RPMI培地の複数のボリュームを追加し、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。成功したCFSEのロード時に、細胞ペレットを、黄色がかった表示されます。 </li><li>ウォッシュCFSEは氷のように冷たい完全RPMI培地で細胞を1より多くの時間をロードされ、in vitroでの培養のためにまたはインビボ刺激に使用する前に、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。 </li></ol> 5. in vitro刺激<ol><li>使用直前に2倍の刺激のストック溶液（2×刺激原液）を調製10となるよう2X刺激原液0μlを96ウェルプレート中のウェルあたり200μlの最終容積に細胞100μlを添加することができます。 </li><li> （B細胞またはT細胞のためのCD3およびCD28のためにIgMまたはCD40）の刺激でコーティングされたプレートが必要な場合は、4℃で一晩PBSで刺激し、プレコート培養プレートを希釈します。代替的に、培養プレートは、実験の当日に1時間37℃でコーティングすることができます。 （プレートは任意の時点で乾燥させないでください）PBSで2回コーティングしたプレートを洗浄します。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> B細胞について </td><td></td></tr><tr><td> 刺激 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> F（ab &#39;）2ヤギ抗マウスIgM </td><td> 0.6から2.4 / mlの</td></tr><tr><td>抗マウスCD40モノクローナル抗体</td><td> 0.5 / mlの</td></tr><tr><td>組み換え体マウスIL-4 </td><td> 25 U / mlの</td></tr><tr><td>リポ多糖類</td><td rowspan="2"> 0.1 / mlの</td></tr><tr><td> E.から（LPS） 大腸菌血清型055：B5 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> T細胞のための </td><td></td></tr><tr><td> 刺激 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td>抗CD3（プレートコーティングされました） </td><td> 2-10 / mlの</td></tr><tr><td> （50μL/ウェルコーティング用） </td><td></td></tr><tr><td>抗CD28（プレートコーティングされました） </td><td> 2 / mlの</td></tr><tr><td>組換えIL-2 </td><td> 40 U / mlの</td></tr><tr><td> PDBu（ホルボールエステル） </td><td> 5-50 ng / mlで</td></tr><tr><td> A23187（カルシウムイオノフォア） </td><td> 250 ng / mlで</td></tr></tbody></table> 表1： インビトロ培養中のリンパ球を刺激するために使用される刺激の濃度。<ol start="3"><li> CFSE標識B細胞の場合は、3×10 5細胞/ウェルで96ウェルの72時間平底プレート三連で完全RPMI培地と培養3×10 6細胞/ mlに再懸濁します。 </li><li> CFSE標識T細胞を、0.5~3×10 5細胞で三重で完全RPMI培地及び培養中の0.5-3×10 6細胞/ mlに再懸濁/ウェルで48または72時間、96ウェル丸底プレート。 </li></ol> 6. インビボ刺激<ol><li> in vivoでの刺激、各MHC適合レシピエントマウスに養子移入（200μlのPBS中の静脈内（IV））マウスあたり4×10 6 CFSE標識T細胞について。 注：このプロトコルでは、CFSE標識T細胞は、養子意志家など脾臓およびリンパ節などのリンパ器官へのこれらの細胞のように尾静脈または眼窩後注射を使用して転送することができます。 </li><li> 1日後に抗原とレシピエントマウスに挑戦。 注意：OVA特異的T細胞受容体（TCR） - トランスジェニックT細胞を養子レシピエントマウスに移したため、この例では、我々は、抗原としてオボアルブミン（OVAタンパク質を50μg/マウス）を使用します。滅菌PBSでOVAタンパク質を準備し、各レシピエントマウス5に、皮下注射（SI）を経由して、OVAタンパク質/ PBSまたはPBS対照の100μLを注入します。 </li><li>収穫し、3日間OVAタンパク質またはPBSで免疫した後、レシピエントマウスのリンパ器官（リンパ節および脾臓）からの単一細胞懸濁液を生成します。腸間膜、膝窩、鼠径部、腰部、および尾部リンパ節を含んで腋窩、上腕および表在性頸部リンパ節を含んで近位リンパ節（PLN）、）および遠位リンパ節（DLN）への個別のリンパ節、。 T細胞の増殖を確認するために、適切なFACS抗体を用いて染色細胞。 注：このCFSE細胞追跡実験において、PBSを注射した対照マウスからのCFSE標識T細胞は非 - ジのベースライン蛍光を確立します細胞をviding。増殖の細胞分裂は、抗原刺激、CFSE標識細胞は、蛍光ピーク12,13を測定することによって可視化されます。 PBSコントロールで、増殖の細胞分裂の数は、CFSE標識T細胞は、12,13を決定することができます。 </li><li>サンプル間の細胞分裂またはピーク数を比較することによって、CFSE標識細胞増殖データを分析した （ 図1及び2）。 注：例えば、養子OVA抗原を受けたレシピエントマウスに移しCFSE標識、OVA特異的T細胞は、PBS注射コントロールマウス5,12に比べて活発な増殖を受けます。また、ホーキンスら14により示されるようにCFSE細胞増殖データを分析するための多くの方法が存在することを指摘することは注目に値します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルでは、我々は、リンパ器官からのリンパ球を精製するための手順を示します。磁気ビーズ選別を用いた細胞の精製は、実行可能な、高度に精製された標的細胞をもたらす迅速かつ簡単な方法です。 プロトコル内の重要なステップ 細胞生存率および細胞収量 in vitroで造血系細胞の生存率を維持することに成功し、再現性のある実験を確保するために重要です。化学的および生物学的試薬は、準最適な実験条件または摘出臓器の不適切な保存条件は、全ての細胞生存率に影響を与えることができます。マウスから切除時に、リンパ器官を氷とできるだけ早く調製単一細胞懸濁液上に格納する必要があります。細胞懸濁液の高速遠心分離も避けるべきです。さらに、細胞ペレット、上清を除去した後に指でチューブをフリックすることによって緩めなければなりません。そうではないピペッティングにより媒体の大量の直接への再懸濁ペレット推奨。 <p class="jove_con...

成熟リンパ球は、個人に既存の感染や炎症がない場合、一般的に静止状態で存在します。したがって、単離プロセス中にリンパ球のナイーブな状態を保持することが、in vitroまたはin vivoの機能アッセイを行う前に重要です。一貫性と再現性のある結果を確保するための鍵は、細胞の不要な操作を制限することです。
磁気細胞選別は、抗体とマイクロビーズを利用して細胞を標識し、目的の細胞集団を豊かにします。このアプローチでは、正の濃縮と負の枯渇という2つの精製戦略があります。ポジティブエンリッチメントは、標的細胞に結合する抗体を使用して、目的の細胞集団を濃縮します。一方、負の枯渇は、非標的細胞を枯渇させ、目的の細胞集団を残します。私たちの研究室では、標的細胞への抗体の結合が細胞の特徴や挙動を変化させる可能性があるため、正の濃縮よりも負の枯渇を好みます。実際、特定の細胞集団の単離に適した多くの確立された細胞表面マーカーは、機能的な受容体でもあります。
磁気セルソーティングは、生存可能な標的細胞の高純度の集団をもたらすだけでなく、蛍光活性化セルソーティング(FACS)で使用される高圧の流れによって引き起こされる細胞ストレスも少なくて済みます。不要な細胞集団を標識し、磁気分離カラムを使用してそれらを枯渇させることにより、標的細胞集団の生存率を損なうことなく、迅速な細胞分離を行うことができます。このプロトコルでは、ナイーブB細胞またはT細胞を精製するための負の枯渇戦略の使用を実証します。

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (L-グルタミンなし)</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td></td><td></td><td>Heat inactivated&nbsp;</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ギブコ</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15140114</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>ギブコ</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>抗CD43磁気マイクロビーズ</td><td>ミルテニ バイオテック</td><td>130-049-801</td> よく<td>混ぜる</td></tr><tr><td>事前に ストレプトビジンマイクロビーズ</td><td>ミルテニイ バイオテック</td><td>130-048-101</td> よく<td>混ぜる 事前に使用</td></tr><tr><td>抗アネキシンV磁気ビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-201</td><td>よく使用前に混合</td></tr><tr><td>MACS LD&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルU底無菌培養プレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルF底滅菌培養プレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m細胞ストレーナーメッシュ</td><td></td><td></td><td>紫外線を使用して滅菌するには 使用前に</td></tr><tr><td>0.2 &mu;m&nbsp;滅菌済み使い捨てフィルターユニット</td><td>Nalgene</td><td>567-0020</td><td>任意の滅菌フィルターデバイスで代用可能</td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>CTV (略称)、CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Yellow</td><td>Invitrogen</td><td>C34567</td><td>CTY (略称)、CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td>CTFR (略称)、CFSE</td></tr> <tr><td>の代替Cell Proliferation Dye eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840</td><td>CPD670 for short; alternative to CFSE</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td>PKH26, alternative to CFSE</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号strong<</td><td>strong>コメント</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Merck Millipore</td><td>S7653</td><td>他の供給源から使用できます</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>シグマアルドリッチ&nbsp;</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>(5-(および6-)カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)</td><td>分子プローブ</td><td>C-1157</td>は<td>DMSO</td></tr><tr><td>ホルボール12,13-ジブチレート(PBDU、ホルボールエステル)</td>で再構成しますシ<td>グマアルドリッチ</td><td>P1269</td><td></td></tr><tr><td>A23187(カルシウムイオノフォア)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C7522</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>抗体および組換えタンパク質</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11bビオチン(クローンm1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td>T細胞枯渇カクテル</td></tr><tr><td>CD11cビオチン(クローンN418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>T細胞枯渇カクテル</td></tr><tr><td>Gr-1ビオチン(クローンRB6-8C5)</td><td>バイオレジェンド</td><td>108404</td><td>T細胞枯渇カクテル</td></tr><tr><td>Ter119ビオチン(クローンTer119)</td><td>バイオレジェンド</td><td>116204</td><td>T細胞枯渇カクテル</td></tr><tr><td>TCR-&γ;&デルタ;ビオチン(クローンGL-3)</td><td>バイオレジェンド</td><td>118103</td><td>T細胞枯渇カクテル</td></tr><tr><td>CD19ビオチン(クローン6D5)</td><td>バイオレジェンド</td><td>115504</td><td>T細胞枯渇カクテル</td></tr><tr><td>B220ビオチン(クローンRA3-6B2)</td><td>バイオレジェンド</td><td>103204</td><td>T細胞枯渇カクテル</td></tr><tr><td>CD49bビオチン(クローンDX5)バイオ</td><td>レジェン</td>ド<td>108904</td><td>T細胞枯渇カクテル</td></tr><tr><td>CD4ビオチン(クローンGK1.5)</td><td>バイオレジェンド</td><td>100404</td><td>T細胞枯渇カクテル</td></tr><tr><td>CD8ビオチン(クローン53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>T細胞枯渇カクテル</td></tr><tr><td>F(ab')2 ヤギ抗マウスIgM(プレートコーティング)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>115-006-075</td><td>50 & マイクロ;コーティング用l /ウェル(96ウェル)</td></tr><tr><td>抗マウスCD40 mAb(プレートコーティング)</td><td>Pharmingen&nbsp;</td><td>553722</td><td>50 & マイクロ;コーティング用l/well (96ウェル)</td></tr><tr><td>組換えIL-4</td><td>ProSpec&nbsp;</td><td>Cyt-282</td><td></td></tr><tr><td>LPS from E. coli Serotype 055:B5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-4005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (clone clone OKT3) (プレートコーティング)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0037-85</td><td>50 & マイクロ;コーティング用l/well (96ウェル)</td></tr><tr><td>Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0281-85</td><td>50 & マイクロ;コーティング用l/well (96ウェル)</td></tr><tr><td>組換えIL-2</td><td>ProSpec</td><td>Cyt-370</td><td></td></tr><tr><td>鶏卵白アルブミン、オボアルブミン</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A7641</td><td></td></tr></tbody></table>

単離とマウスリンパ球の活性化

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B細胞とT細胞は、非常に多様な抗原受容体レパートリーを持ち、侵入する病原体1,2に対して特異的な免疫応答を発現する能力を持っています。当然のことながら、このような複雑な能力は、さまざまな細胞プロセスに関与する多数の分子によって制御され、タイムリーで空間的に制御された免疫応答を確保します3。ここでは、磁気細胞選別技術を用いて高度に精製されたマウスリンパ球を迅速に単離するための実験手順について説明します。得られた精製リンパ球は、その後、イムノブロッティング4による刺激によるリンパ球シグナル伝達能力の測定や、3H-チミジン取り込みまたはカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)標識5-7による増殖能の調査など、さまざまなin vitroまたはin vivoの機能アッセイに供することができる.制御リンパ球と遺伝子改変リンパ球の機能能力を比較するだけでなく、移植されたCFSE標識OT-I T細胞を用いた代表的な結果に示されているように、in vivoでの抗原提示細胞(APC)のT細胞刺激能力も決定できます。

リンパ球の磁性細胞精製は、ユーザが比較的短い時間で、標的細胞集団を精製することができます。我々の枯渇のプロトコルを用いて、精製した後、94.2％（に72.8％（前の精製）から（組換え活性化遺伝子1（RAG-1）欠損マウスにおけるOT-I）CD8 T細胞の割合を増加させることができました。 図1A）4,5。これらの精製されたリンパ球は、その後、リンパ球増殖およびシグナル伝達4,5を決定するために、下流の機能的アッセイのために使用することができます。例えば、我々は、APCのインビボでの T細胞刺激能を検討することができ 野生型（WT）および適当な抗原5で免疫化した変異体（MT）マウスにCFSE標識した、抗原特異的T細胞を転送することによって。 当社の代表的な実験では、我々は、精製され、CFSE標識、オボアルブミン（OV...

リンパ球は、適応免疫応答の主要なプレーヤーです。ここでは、in vitroおよびin vivoでのリンパ球活性化における所望の分子の生理学的機能を決定するためのリンパ球精製プロトコルを紹介します。記載された実験手順は、コントロールと遺伝子組み換えリンパ球との間の機能的能力を比較するのに適している。

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

この実験の全体的な目的は、さまざまなin vitroおよびin vivo機能アッセイを用いて、精製されたマウスリンパ球の機能的能力を研究することです。この手法は、免疫学および分子生物学の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。例えば、遺伝子欠損リンパ球における目的タンパク質の機能を調査することなどが挙げられます。この手法の主な利点は、操作や環境ストレスを最小限に抑えながら、リンパ球を迅速に精製できることです。B細胞を精製するには、最大1×10⁸個の赤血球溶血済み脾臓全細胞を、FBSを添加したバランス塩溶液（BSS）300 µLに再懸濁します。次に、anti-CD43磁気マイクロビーズを50 µL添加します。死細胞を除去するため、Annexin five磁気ビーズ30 µLを加え、4 °Cで30分間インキュベートします。細胞が均一に標識されるよう、15分おきに細胞懸濁液を軽く叩いて混ぜ合わせます。インキュベーション後、FBSを添加したBSS 14 mLで標識細胞を洗浄します。遠心分離後、上清を除去し、チューブを軽く叩いて、FBSを添加した室温のBSS 1～3 mLでペレットを再懸濁します。遠心分離の間に、分離カラムをマグネットラックにセットし、流速を抑えるためにカラムの先端に滅菌済みの21ゲージ針を装着します。室温のBSS 2 mLでカラムを平衡化します。ペレットを室温のBSS 1〜3 mLで再懸濁した後、回収チューブを針の下に配置し、Bとラベル付けされた細胞を平衡化したカラムにロードします。通り抜け液を15 mLコニカルチューブに回収します。その後、FBSを添加した新鮮なBSS 1 mLでカラムを洗浄します。洗浄液を回収した標的細胞と合わせて、標的細胞を含むアルエット（aluet）をカラムに再充填し、通り抜け液を同じ15 mLチューブに回収します。その後、FBSを添加したBSS 1 mLでカラムを3回洗浄し、洗浄液を標的細胞懸濁液に合わせ続けます。3回目の洗浄後、カラムをマグネットから外し、FBSを添加したBSS 5 mLをロードします。カラムプランジャーを使用して、磁気標識された非標的細胞を新しい15 milliliterチューブに洗い流します。その後、フローサイトメトリーで分離した細胞の純度を確認します。分離カラムを再利用する場合は、磁気ビーズ標識細胞を洗い流した後、カラム上部から5 milliliterのPBSで3回、次いで5 milliliterの蒸留水で3回洗浄してください。次に、同様の方法でカラムを5 mLの70%エタノールで洗浄し、エアタップを使用してカラムを十分に乾燥させてから保存します。新しい精製実験でカラムを再利用する場合は、再度カラムを下から上に向かって5 mLの70%エタノールで洗浄し、続いて5 mLのPBSで2回洗浄します。その後、最終洗浄として5 mLのPBSをカラム上部から注入します。室温のBSS 2 mLを用いてカラムを平衡化します。その後、実験に使用する細胞集団をカラムにロードできます。B精製細胞をCFSEで標識するには、15 mLコニカルチューブ内で、調製したばかりの標識溶液を用いて細胞を2回洗浄してください。2番目のペレットを、新鮮な37 °Cの標識溶液を用いて2 × 10⁷ cells/mLの濃度で再懸濁します。その都度、サンプルを遠心分離し、上澄みを除去してチューブを軽く叩きます。次に、細胞懸濁液と調製したばかりの10 µM CFSE溶液を1:1の比率で混合し、37 °Cで10分間、暗所で細胞を標識します。2分ごとにチューブを転倒混和し、色素を均一に分散させます。細胞ペレットがラベル化溶液に完全に懸濁するように注意してください。細胞の凝集は、CFSEラベル化の均一性に影響を及ぼす可能性があります。インキュベーション後、RPMI培地を加えてCFSEを停止させ、氷冷した完全RPMI培地を数回分用いて細胞を2回洗浄します。細胞の標識が成功していれば、ペレットは黄色になります。次に、適切な刺激物質でコーティングした96ウェル平底プレートを、PBSで2回洗浄します。CFSE標識したB細胞を、complete RPMI培地を用いて3 × 10⁶ cells/mLに再懸濁し、コーティング済みプレートの各ウェルに100 µLずつ3連で播種して72時間培養します。この除去法により、ビーズで分離したOT1-CD8 T細胞の純度を72.8%から94.2%まで向上させることができます。その後、上述した方法で細胞をCFSE標識し、レシピエント動物に養子移殖して、in-vivoでの増殖能を解析することが可能です。さらに、抗CD45.1抗体による標識を用いることで、レシピエントマウスのリンパ組織において、CFSE発現細胞が養子移入されたドナーのCD-45.1陽性OT1-CD8 T細胞であることをさらに確認できます。あるいは、精製したT細胞をin vitroで刺激し、トリチウム標識チミジンの取り込みによってその増殖能を評価することも可能です。また、本手法により、脾臓B細胞の純度を大幅に向上させることができます。これにより、精製したB細胞を用いた下流の機能解析に同様の機会を提供します。この手法を習得すれば、2時間で完了させることができます。本手順を実施する際は、精製およびCFSE標識の間を除き、CI懸濁液を常に氷上で保持することが重要です。精製されたリンパ球は、遺伝子改変リンパ球の最終シグナル伝達能を評価するイムノブロッティングなどの他の機能解析にも利用可能です。このビデオを視聴することで、B細胞およびT細胞の精製方法、ならびにこれらの細胞をさまざまなin vitroおよびin vivo機能解析に活用する方法について、より深く理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

このビデオでは、我々は、CD40 -活性化と免疫の誘導を研究するためにモデル抗原提示細胞（APC）として使用することができますC57BL /...

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単離とマウスリンパ球の活性化

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