Name: フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 学ぶ ラット腎臓からのマクロファージをフローサイトメトリーで定量化・表現型解析する手法。細胞染色後の応用により、腎臓の炎症と修復メカニズムの研究に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、FIS/FEDER(Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 and PI14/00883)、スペインアテローム性動脈硬化症学会、スペイン腎臓学会、およびFundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT)からの助成金によって支援されました。FIS/FEDERはPI14/00386とInstituto Reina Sofìa de Investigaciòn NefrològicaからJesús Egidoに資金を提供しています。Fundaciòn Conchita Rabago to Melania Guerrero Hue.Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) から Alfonso Rubio Navarro まで。

このプロトコルは、指令欧州議会の63分の2010 / EUと国家ガイドライン2013分の53以下のローカル施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 試薬およびソリューションの作製<ol><li>無菌条件下で全ての試薬と解決策を準備し、層流フードの下で使用しています。 4℃でのソリューションをしてください。 </li><li>染色バッファー（1×ダルベッコPBS中の2％ウシ胎児血清（FBS））を準備します。 </li><li>生理食塩水の各mlにコラゲナーゼ0.5mgのを追加することで、コラゲナーゼ溶液を準備します。 </li><li> （2：1 v / v）をケタミン/キシラジン麻酔の溶液を調製します。 </li></ol> 2.腎臓灌流および抽出<ol><li>ケタミン/キシラジン（75mgの/ 12ミリグラム/キログラム体重）の腹腔内注射により、ラットを麻酔。慎重に動物が十分に麻酔されていることを確認するために、皮膚の小さな倍をつまみます。その後、麻酔下ながら乾燥を防ぐために、獣医軟膏で目をカバーしています。注：4月第齢のWistarラットを、このアッセイで使用されています。 </li><li>ラットが完全に麻酔された後、仰臥位で手術台の上に置きます。 </li><li>腹部に70％エタノールを適用します。 </li><li>胸膜および腹腔を露出させるために、恥骨から胸郭に、腹部皮膚及び腹膜を介して中央切開を行います。 </li><li>全ての血液は腎臓から除去されるまで灌流システムを使用して腎臓を灌流するために腹部大動脈に生理食塩水（0.9％）を注入します。血液を解放するために役立つ腹部レベルで大動脈をカットします。 </li><li>腎門部（腎静脈、動脈および尿管）から切断することにより、ラットから両方の腎臓を削除してください。腎臓をデカプセル化するには、慎重にカプセル11を分離し 、指を使って腎臓の端を押してください。 </li><li>ハンクス平衡塩溶液中に腎臓を置きます。 </li></ol> 3.腎消化し、細胞懸濁液<ol><li>小片にハサミで腎臓の半分をカットして入れて1.5mlチューブに個。 注：すべての次の濃度は、1サンプル（1/2ラットの腎臓）のために計算されています。 </li><li>コラゲナーゼ溶液1mlを加え、37℃で30分間インキュベートします。コラゲナーゼ溶液は、組織全体にアクセスすることを確認するために、5分毎に転倒混和します。 </li><li>ソリューションを収集し、プランジャーの助けを借りて、ストレーナ（40ミクロン）に通し、そして染色緩衝液10mlでそれを再懸濁します。 </li><li> 15分間400×gで遠心分離します。 </li><li> 1ミリリットルACK（塩化アンモニウムカリウム）ライジングバッファーでペレットを再懸濁します。室温で1分30秒後に、反応を停止する染色緩衝液10mlを加えます。 </li><li> 10分間400×gで遠心分離します。 </li><li>再懸濁染色緩衝液（1ミリリットル）の十分なボリュームでペレットをストレーナ（30μm）を用いて、細胞懸濁液をフィルタリングします。 </li><li>血球計数器で、トリパンブルー排除を用いて細胞の数をカウントし、STA用1.5mlチューブに200万セルを追加ining。 </li></ol> 4.細胞染色およびフローサイトメトリー分析<ol><li> 5分間100×gで遠心分離した細胞。 </li><li> Fc受容体をブロックするために4℃で10分間：ラット血清を100μlでペレットを再懸濁（100 1希釈）。 </li><li> 5分間染色緩衝液および遠心分離100×gでの1ミリリットルを追加することにより洗浄します。 </li><li>生細胞（：千3）を検出すると、ソリューションCD45 APC-Cy7の（1：：：100）、CD163 A647（100 4）各条件のための染色緩衝液100μlの細胞表面染色のための抗体を混ぜます。 </li><li>暗所で4℃で20分間、抗体混合物で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> 5分間100×gで染色緩衝液遠心分離機を1ml添加することにより洗浄します。この手順を繰り返します。 </li><li>暗所で4℃で20分間固定/透過処理溶液を600μlのを追加します。 </li><li> 5分間170×gで1ミリリットル透過化/洗浄緩衝液および遠心分離で2回洗浄します。 </li><li> intracelのために：CD68 FITC抗体（千35）を追加各条件のための透過化/洗浄バッファー100μlにlular染色。 </li><li> CD68抗体溶液中でペレットを再懸濁し、暗所で4℃で50分間インキュベートします。 </li><li> 5分間170×gで1ミリリットル透過化/洗浄緩衝液および遠心分離で洗浄します。 </li><li>再懸濁、透過化/洗浄バッファー100μlでペレットをCD86PE抗体（35：1,000）を追加し、暗所で4℃で20分間インキュベートします。 </li><li> 5分間、100×gで透過化/洗浄緩衝液および遠心機の1ミリリットルを追加することにより洗浄します。 </li><li>透過化/洗浄バッファー100μlでペレットを再懸濁し、チューブ、フローサイトメトリーに渡します。 </li><li>フローサイトメトリーによってサンプルを分析します。側方散乱光/前方散乱光（SSC / FSC）ウィンドウにゲーテッド生細胞におけるCD45染色を決定します。第2段階では、CD68 +細胞におけるCD86およびCD163発現を分析。 </li></ol>

<ol><li>Gansevoort, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+kidney+disease+and+cardiovascular+risk%3A+epidemiology%2C+mechanisms%2C+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention.</a> Lancet. 382, 339-352 (2013).</li>
<li>Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+in+chronic+kidney+disease%3A+the+role+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages.</a> Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+ameliorates+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Exp.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice.</a> Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).</li>
<li>Belliere, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+macrophage+subtypes+influence+the+progression+of+rhabdomyolysis-induced+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).</li>
<li>Kinsey, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+dynamics+in+AKI+to+CKD+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophage dynamics in AKI to CKD progression.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).</li>
<li>Lech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+phenotype+controls+long-term+AKI+outcomes--kidney+regeneration+versus+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41, 14-20 (2014).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).</li>
<li>Ortiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+value+of+animal+models+of+kidney+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Translational value of animal models of kidney failure.</a> Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).</li>
<li>Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+double+negative+alphabeta+T+cells+from+the%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of double negative alphabeta T cells from the.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>Martin-Fernandez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldosterone+Induces+Renal+Fibrosis+and+Inflammatory+M1-Macrophage+Subtype+via+Mineralocorticoid+Receptor+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats.</a> PLoS. One. 11, e0145946(2016).</li>
<li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> J. Vis. Exp. (e52749), (2015).</li>
<li>Komohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+infiltration+and+its+prognostic+relevance+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma.</a> Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).</li>
<li>Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+macrophages+in+the+fibrotic+phase+of+rat+crescentic+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis.</a> Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).</li>
<li>Ndisang, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+heme+oxygenase-adiponectin-atrial+natriuretic+peptide+axis+in+renal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function.</a> Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).</li>
<li>Blackbeard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+rat+spinal+microglial+response+to+peripheral+nerve+injury+as+revealed+by+immunohistochemical+image+analysis+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry.</a> J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).</li>
<li>Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+intracellular+CD68+molecule+expression+in+normal+and+malignant+haemopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis.</a> Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

マクロファージは、腎疾患を含む種々の炎症性疾患において重要な役割を果たしている異種の細胞です。糸球体腎炎、糖尿病性腎症や腎がん14-16で報告されているように、各マクロファージ亜集団は、腎障害の開発に異なる方法で寄与するため、腎疾患におけるマクロファージのサブセットの特性評価への関心が高まっています。急性腎損傷の初期段階では、M1マクロファージの優位性は、尿細管壊死および炎症を促進し、観察されました。しかし、後の段階でM2マクロファージのより高い含有量は、炎症を解決し、組織リモデリングに関与することが観察されます。 M1は、支配的であること、したがって増加し、炎症性腎障害を永続かもしれないが慢性腎臓病では、M1とM2マクロファージの両方が、同時に共存します。したがって、腎疾患におけるマクロファージの亜型の病態生理学的役割についての知識を増加させることが重要です。免疫組織化学的研究は、堅牢な方法17におけるマクロファージのサブセットの割合を決定することはできません。したがって、定量的に異なったマクロファージの表現型を決定するために腎炎症反応のこれらの細胞の役割を理解するための新しい技術を開発する...

腎臓病は世界的な健康問題であり、有病率の増加と罹患率と死亡率の上昇に関連しています1。腎障害の進行と発症に関与する最も重要なメカニズムの1つは、主にマクロファージによって引き起こされる炎症です。マクロファージは、腎障害2を含む多くの炎症性疾患において極めて重要な役割を果たしています。したがって、急性腎障害(AKI)または慢性腎臓病(CKD)の患者の生検では、浸潤するマクロファージの存在が増加していることが報告されています3,4。最近の研究では、腎疾患の長期的な転帰はマクロファージによって制御できることが示唆されています5,6。局所的な微小環境に応答して、マクロファージは多様な生物学的機能を果たす異なる表現型に分化することがあります7。2つの明確に分化したマクロファージ表現型が確立されています:古典的に活性化されたマクロファージ(M1マクロファージ)と代替的に活性化されたマクロファージ(M2)8。M1マクロファージは炎症を促進しますが、M2マクロファージは抗炎症作用を持ち、組織修復に関与しています9。したがって、マクロファージの不均一性に関するより良い知識は、マクロファージの調節と腎臓病理への寄与を理解し、新しい治療アプローチを開発するために必要です。
どちらも、マウスとラットのモデルは、腎障害に関与する分子的および細胞的メカニズムを理解するために広く使用されています10。ただし、これらのげっ歯類間でマクロファージの表現型を特定するために使用される多様なマーカーには大きな違いがあります。したがって、F4/80やLy6Cなどのいくつかのマウスマーカーはラットでは使用されず、これらの種間の所見の外挿が制限されます。さらに、ラットのマクロファージ表現型を説明するマーカーの数は限られており、マウスと比較してこれらの動物のマクロファージの不均一性を分析する研究が乏しいことを説明しています。したがって、ラットの腎疾患モデルにおけるマクロファージの役割を理解するためには、マクロファージサブセットの特性評価のための新しい戦略が必要です。
この原稿は、フローサイトメトリーによるラット腎臓からのマクロファージの表現型および定量的分析のためのプロトコルを説明しています。この手法に続いて、細胞選別やmRNAまたはタンパク質発現研究など、いくつかのアッセイを行い、腎疾患におけるマクロファージの役割を詳細に評価することができます。

<table><tbody><tr><td>層流フード</td><td>Faster</td><td></td><td>または同等の機器</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettich</td><td></td><td>または同等の機器</td></tr><tr><td>フローサイトメーター (FACSAria)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>BioWest</td><td>S1820-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>LONZA</td><td>BE17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12/1/9001</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリーストレーナー</td><td>BD Biosciences</td><td>340626</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 細胞ストレーナー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリーチューブ</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>5 ml ポリスチレン丸底チューブ</td></tr><tr><td>遠心分離チューブ</td><td>コーニングcentristar</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Memmert GmbH + Co. KG</td><td>WNE 7</td><td>37 &#176;C</td></tr><tr><td>固定/透過処理液または透過処理/洗浄緩衝液</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Rompum (キシラジン)</td><td>Bayer</td><td></td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ケタラー (ケタミン)</td><td>ファイザー</td><td></td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ハンクスの平衡塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>ブラウン</td><td></td><td></td>622415</tr><tr><td>抗CD45 (クローン:OX-1) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>202216</td><td>1:100</td></tr><tr><td>希釈 抗CD68 (クローン:ED1) FITC</td><td>Bio-RAD</td><td>MCA341F</td><td>希釈 35:1,000</td></tr><tr><td>抗CD86 (クローン:24F) PE</td><td>バイオレジェンド</td><td>200307</td> 希釈 <td>35:1,000</td></tr><tr><td>抗CD163 (クローン:ED2) Alexa Fluor 647</td><td>Bio-RAD</td><td>MCA342R</td> 希釈 <td>4:100</td></tr><tr><td>生死染色&nbsp;</td><td>分子プローブ</td><td>L34955</td><td>3:1,000</td></tr></tbody></table> 希釈

フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

炎症、そしてその後のマクロファージが腎疾患の発症と進行に重要な役割を果たすことを示唆する証拠が増えています。マクロファージは、腎障害に関与している不均一な細胞です。マクロファージは、2つの異なる表現型に分類できます:古典的に活性化されたマクロファージ(M1マクロファージ)は、炎症誘発性サイトカインを放出し、線維化を促進します。免疫調節および組織リモデリング機能に関連する代替的に活性化されたマクロファージ(M2マクロファージ)。これらのマクロファージ表現型は、腎障害への寄与を判断するために識別および分析する必要があります。しかし、炎症性腎疾患モデル、特にラットにおけるマクロファージのサブタイプに関する一貫した表現型および機能的情報を報告した研究はほとんどありません。この事実は、マウスとは対照的に、ラットで使用されるマクロファージマーカーが限られていることに関連している可能性があります。したがって、これらの浸潤細胞の腎含有量を信頼性の高い方法で定量化し、特徴付けるための新しい戦略が必要です。この原稿では、腎臓消化のプロトコルと、フローサイトメトリーによるラット腎臓からのマクロファージのさらなる表現型および定量分析について詳しく説明します。簡単に説明すると、腎臓をコラゲナーゼとインキュベートし、生細胞におけるCD45(白血球共通抗原)とCD68(PANマクロファージマーカー)の二重の存在に従って総マクロファージを同定しました。続いて、CD86(M1マーカー)とCD163(M2マーカー)の表面染色を行いました。ラット腹膜マクロファージは、フローサイトメトリーによるマクロファージマーカー検出のポジティブコントロールとして使用されました。私たちのプロトコルは、細胞死亡率を低く抑え、さまざまな細胞内および表面タンパク質マーカーの特性評価を可能にしたため、他のプロトコルで観察される細胞の完全性の損失を制限しました。さらに、この手順により、細胞選別やmRNAまたはタンパク質発現研究などのさらなる技術にマクロファージを使用することができます。

私たちは、腎臓に浸潤マクロファージの存在の増加に関連した腎障害の炎症実験モデルにおけるマクロファージの不均一性を分析しました。以前に12報告されているように、このモデルでは、腎臓の損傷は、Wistarラットでの3週間の飲料水中アルドステロン（1ミリグラム-1キロ-1日）に加えて、塩（塩化ナトリウム1％）の投与によって誘発しました。 実験のスケジュールは、図1に示されている。まず、腎臓細胞をコラゲナーゼ（ 図1A）との機械的方法、さらに酵素消化を用いて単離しました。その後、赤血球を溶解し、腎臓マクロファージは、フローサイトメトリーを用いて検出しました。細胞は膜の検出および細胞内染色のためのCD68（ 図1B）のためのCD45、CD86及びCD163のための抗体と共にインキュベートしました。...

この原稿は、表現型とフローサイトメトリーによるラット腎臓からの常駐マクロファージの定量分析のための詳細なプロトコルを記述しています。得られた染色された細胞はまた、このように実験モデルで得られた情報を増加させる、細胞選別、遺伝子発現分析または機能的研究を含む他の用途に使用することができます。

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

本手順の目的は、フローサイトメトリーを用いてラット腎臓の常在性マクロファージを定量し、その特性を明らかにすることである。この手法により、腎損傷において各タイプのマクロファージがどのような寄与をしているかという重要な疑問に答えることができる。本技術の主な利点は、異なるタンパク質マーカーを用いて腎臓の細胞特性を分析できる点にある。これにより、細胞の完全性を維持したまま解析が可能となる。本手順の実演は、コンプルテンセ大学のA.P.A.S.D.学生であるElena OlivaresとMelania Guerreroが行う。

腎臓の灌流および摘出にあたり、まず皮膚を小さくつまみ、ラットが適切な鎮静レベルに達していることを確認する。その後、眼に獣医用眼軟膏を塗布する。動物を手術台の上に仰向けに配置し、腹部を70%エタノールで消毒する。次に、恥骨から肋骨まで腹壁の皮膚と腹膜を切開し、胸腔および腹腔を露出させる。灌流システムを用いて0.9%生理食塩水を腹大動脈に注入し、腎臓を洗浄する。その際、腹部の大動脈を切断して血液の排出を促進させる。腎臓からすべての血液が除去されたら、腎門を切断する。その後、各腎臓の縁を押し、慎重に被膜を除去する。摘出した腎臓を新鮮なHBSSに移す。

単一腎細胞懸濁液を作成するため、ハサミを用いて腎臓の半分を小さく断片化する。組織片を1.5 mLチューブに移し、1 mLの調製直後のコラゲナーゼを加え、37℃で30分間インキュベートする。

phenotypic-characterization-macrophages-from-rat-kidney-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ラット肝細胞の初代培養からマクロファージを取得するための新しい方法が記載されている。このメソッドは、プラスチック製の皿に選択的付着によって培養フラスコ及び精製の揺れが続く文化におけるマクロファージの増殖を、利用しています。この手法は、効率的に複雑な装置やスキルがなくても肝臓のマクロファージを提供します。...

成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

ここで、我々は、肺に先天性免疫細胞を常駐し、無水物ナノ粒子との共培養に応答して活性化を検討しているマウスの肺胞マクロファージを採取するためのプロトコルについて説明します。...

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

マクロファージは、防御免疫およびホメオスタシスにおいて決定的な役割を果たす造血系のプラスチック細胞である。この報告では、寛容原性条件下で移植臓器に蓄積する移植片浸潤調節マクロファージの表現型および機能的特徴付けのための最適化されたインビトロ技術を記載する。...

グラフト反応性免疫を阻害する調節性マクロファージの機能的特徴付け

腎臓免疫細胞の分離に信頼性と効率性を備えた技術が、下流のアプリケーションのために必要とされています。これには、少数の腎臓免疫細胞の表面抗体標識が必要です。ここでは、この目標を達成すると思われる腎臓免疫細胞の単離のための簡潔な方法について説明します。...

腎、免疫細胞の信頼性と高効率抽出

このプロトコールは、成体マウス中枢神経系におけるマクロファージ亜集団のフローサイトメトリーによる分析を提供し、これらの細胞によって発現される複数のマーカーの研究に有用である。...

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

この記事では、脂肪組織とフローサイトメトリーを使用して後続の解析から免疫細胞の分離による脂肪組織の免疫細胞の内容を分析する方法について説明します。...

フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション

本研究は、フローサイトメトリー、FcγR の活性化から生じる活性酸素種 (ROS) 生産を検出するための使用方法を示します。このメソッドは、抗菌および酸化還元シグナル免疫複合体、微生物のオプソニン、または直接 FcγR...

FcγR 架橋への応答におけるマクロファージの活性酸素産生の流れフローサイト メーターによる測定

このプロトコルは、単球、ミクログリア、マクロファージ、樹状細胞を含む特定の眼単核貪食集団を同定するために、多パラメータフローサイトメトリック分析を目的として、目全体を単一細胞懸濁液に消化する方法を提供する。...

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

このプロトコルは脂肪細胞から良質のRNAを得る方法論および流れのcytometryによって分析のための多数の膜区切られたマーカーの汚損によってSVFマクロファージの表現型化を含む単一のプロセスの人間の内臓の脂肪からの生存可能な脂肪細胞そして間質の管の部分SVFのセルの隔離に有効なコラゲナーゼの消化力方法を提供する。...

RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

プロトコルは、ヒトCD59 /インターメディリシン細胞アブレーションツールを使用して、腎臓マクロファージの再生を研究するための選択的アブレーションのためのここで報告されています。この方法は、腎臓、肝臓、および脂肪組織における他の細胞集団の機能と再生の研究にも適用できます。...

ヒトCD59/インターメディリシン細胞アブレーションツールを用いた腎マクロファージの急速な枯渇

この研究では、単離されたラットマクロファージによる異種(ヒト)および同種(ラット)赤血球の食作用率を定量化および比較するための標準化された in vitro...

in vitroでのラットマクロファージによる同種および異種赤血球の食作用の定量的評価

学ぶ ラット腎臓からのマクロファージをフローサイトメトリーで定量化・表現型解析する手法。細胞染色後の応用により、腎臓の炎症と修復メカニズムの研究に貢献します。

フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴

さらに動画を探す