フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴
2016年10月18日
この原稿は、表現型とフローサイトメトリーによるラット腎臓からの常駐マクロファージの定量分析のための詳細なプロトコルを記述しています。得られた染色された細胞はまた、このように実験モデルで得られた情報を増加させる、細胞選別、遺伝子発現分析または機能的研究を含む他の用途に使用することができます。
この手順の全体的な目標は、フローサイトメトリーによってラット腎臓由来の常在マクロファージを定量化し、特性評価することです。この方法は、腎臓の損傷における各黄斑のタイプの寄与が何であるかなど、流動性における重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、異なるタンパク質マーカーの腎臓カテーテル法を可能にすることです。したがって、手順を実証するの細胞の完全性を制限するのは、コンプルテンセ大学のA.P.A.S.D.の学生であるエレナ・オリバレスと、腎臓の灌流と抽出のためにA.P.A.S.D.の学生であり、ラットが適切な鎮静レベルに達したことを確認するために皮膚の小さなひだをつまむことから始めます。そして獣医軟膏で目を覆います。動物を仰臥位で手術台に置きます。そして腹部を70%エタノールに浸します。次に、腹部の皮膚と腹膜から恥骨から胸郭まで中央を切開して、胸膜と腹腔を露出させます。灌流システムを使用して、0.9%生理食塩水を腹部大動脈に注入し、腎臓を洗い流します。腹部の大動脈を切って血液を放出するのを助けます。腎臓からすべての血液が除去されたら、腎門を切断します。次に、各腎臓の端を押して、臓器のカプセル化を慎重に解除します。そして、抽出した腎臓を新鮮な腎臓に移 H.B.S.S.To、単一の腎臓細胞懸濁液を生成し、はさみを使用して1つの腎臓の半分を小さな断片に切ります。組織片を1.5 mLのチューブに移し、新たに調製したコラゲナーゼ1 mLをチューブに加え、37°Cで30分間インキュベートします
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概要
本稿では、フローサイトメトリーを用いたラット腎臓における組織常在性マクロファージの表現型および定量的解析の詳細なプロトコルについて解説します。得られた染色細胞はさまざまな用途に利用でき、実験モデルから得られる情報を高めることが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- 細胞生物学
背景
- マクロファージは、腎臓の健康と疾患において重要な役割を果たしています。
- フローサイトメトリーを用いることで、細胞集団の詳細な解析が可能です。
- マクロファージの挙動を理解することは、治療戦略の策定に役立ちます。
- 腎機能の研究には、一般的にラットモデルが用いられます。
研究目的
- 腎臓マクロファージの単離および解析のためのプロトコルを開発すること。
- 腎臓におけるマクロファージ機能のさらなる研究を促進すること。
- 関連分野の研究者にリソースを提供すること。
使用された手法
- 細胞解析のためのフローサイトメトリー。
- マクロファージ同定のための染色手法。
- 細胞ソートおよび遺伝子発現解析のためのプロトコル。
- マクロファージ活性を評価するための機能研究。
主な結果
- ラット腎臓からの組織定住マクロファージの分離に成功。
- マクロファージ表現型の詳細な特性解析。
- 遺伝子発現および機能研究への応用の可能性。
- 腎臓の健康におけるマクロファージの役割に関する理解の深化。
結論
- 本プロトコールは、マクロファージ解析のための信頼性の高い手法を提供します。
- 得られた結果は、腎疾患に関する今後の研究に役立てることができます。
- 本研究は、フローサイトメトリー以外の他のアプリケーションへも展開可能です。
よくある質問
業界における重要性
腎疾患モデルにおけるマクロファージサブセットの正確な表現型解析は、炎症主導の腎病理におけるターゲットバリデーションのリスクを低減させるために極めて重要です。このフローサイトメトリープロトコルにより、ラット腎臓における前炎症性（M1）および免疫調節性（M2）マクロファージ表現型の定量的な識別が可能となり、線維化および免疫調節に関するメカニズムの理解を支援します。腎損傷へのマクロファージの寄与を評価する信頼性の高い手法を提供することで、本アプローチは前臨床段階におけるターゲット選択およびパスウェイ解析の予測的な信頼性を高めます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：腎障害モデルにおけるM1/M2マクロファージ比を定量化することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値：CD45/CD68のデュアルゲーティングとCD86/CD163の表面染色を用いることで、高い特異性をもってマクロファージのフェノタイプを定義する。
- 予測的価値：マクロファージの分極状態を線維化および免疫調節経路に関連付けることで、ターゲットのデリスキングを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況：マクロファージの頻度およびマーカー発現に関する、標準化された定量的なフローサイトメトリー出力を生成します。
- 再現性：細胞死が低く完全性が保持されていることを示しており、実験間で一貫した表現型リードアウトを可能にします。
- ダウンストリームでの有用性：単離されたマクロファージは、細胞ソート、mRNA、およびタンパク質解析に利用可能な生存状態を維持しており、マルチオミクスの後続解析をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性：マクロファージの表現型が病態を駆動する炎症性腎疾患モデルに直接適用可能です。
- トランスレーショナルな連続性：ソートされたマクロファージから得られた表現型データは、前臨床研究におけるバイオマーカーの探索および機能的妥当性の検証に寄与します。
- リスク調整後の意思決定：免疫調節化合物のマクロファージ分極に対する効果を客観的に評価することが可能になります。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲット検証から前臨床評価に至る創薬のコンティニュアムに適合し、腎疾患モデルにおけるリード最適化および作用機序研究に寄与する免疫学的リードアウトを提供します。
- ディスカバリーバイオロジー：表現型の定量化を通じて、腎損傷におけるマクロファージ駆動経路の仮説検証を促進します。
- スクリーニング：アッセイのバリデーションや化合物スクリーニングキャンペーンに適した、再現性のある定量的なマクロファージデータを提供します。
- アナリティクス：マルチパラメトリックフローサイトメトリーによるリードアウト（M1についてはCD45+/CD68+/CD86+、M2についてはCD45+/CD68+/CD163+）を提供し、群間比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患関連システムにおけるマクロファージの表現型解析を、下流の機能アッセイや遺伝子発現プロファイリングへと結びつけます。
- エンタープライズ再利用：複数の腎疾患モデルや治療領域に適用可能な、標準化された免疫表現型解析ワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 精緻な表現型の識別を可能にすることで、マクロファージが介在する腎損傷におけるメカニズムの曖昧さを低減します。
- 運用的価値： コアフローサイトメトリー施設と互換性のある、標準化された低ばらつきのマクロファージ分離および染色法を提供します。
- 戦略的価値： ターゲットの調節をマクロファージ分極の測定可能な変化に結びつけることで、go/no-go判断の精度を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 前臨床モデルにおけるマクロファージ表現型の調節に基づき、免疫調節候補物質のリスク調整済み優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- フローサイトメトリーのコンペンセーション、ゲーティング戦略、およびマクロファージマーカーのバリデーションに関する専門知識が必要です。
- コラゲナーゼ消化装置および無菌的な細胞処理インフラへのアクセスに依存します。
- 再現性のあるM1/M2定量化のためには、施設間での抗体パネルおよび蛍光コントロールの標準化が必要です。
- 他の組織に適用する場合、解離酵素およびマーカーパネルの最適化が必要になる場合があります。
- マウスの広範なレパートリーと比較して、ラット特異的なマクロファージマーカー（CD86、CD163）の利用可能性に制限があります。
