Name: 黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶ亜細胞パッチクランプ記録法で黒質ドーパミンニューロンの樹状突起からイオンチャネル機能を解析する技術。この方法は神経細胞の電気生理学的特性を詳細に調べるのに有用である。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私は2番目のAxopatch 200B増幅器の贈り物、GIGA-イメージングのための共焦点顕微鏡とのアドバイスのための優れた技術支援、博士ジャンDefournyとサンドラOrmenese、博士ジャック命運を決めるための彼の一定の支援、のChristelle GillissenとローランMassotteのために博士ヴィンセントSeutinに感謝します批判的に原稿を読み取るための共焦点顕微鏡とIMARISソフトウェアおよび博士スティーブン・フリーマンを共有するためのプラットフォーム。この作品は、ベルギーのFRSからの助成金によってサポートされていました - FNRS（U.N002.13とT.N0015.13）とベルギーの大学財団（PubliéAVECル・コンクール・デ・ラ・財団Universitaire・デ・ベルギー）の支援を発表しました。

著者は彼が競合する金融利害関係がないことを宣言します。

このレポートでは、二重の細胞体樹状突起細胞全体のレコーディングや地元の樹状突起の録音を実現するためのステップバイステップのプロトコルを記述しています。これは、シナプス後電位の時間経過にイオンチャネルの影響（ すなわち、I h）を決定し、それぞれ、黒質DAニューロンの細胞体樹状突起ドメインに沿ってイオンチャネル（I hの ）の分布をマッピングするために有用です。得られた電気生理学的測定は、細胞の形態を回復するためにアドホック組織化学を投稿するために組み合わされます。手順は、腹側被蓋領域DAニューロンまたは他の中脳ニューロンは、黒質に位置するDAニューロンを研究するために使用されたが、隣接する黒質GABAニューロンのために一般化することができます。すべてのステップはまた、重要な変更を加えることなく、黒質ニューロンの樹状突起で発現される他のイオンチャネルを調べるために続くことができる。 事後可視化は、軸索ベアリングとニューロンのために特に適切ですこのような黒質ニューロンのような樹状突起、25,26、海馬oriens-白板の介在ニューロン21またはいくつかのCA1錐体ニューロン67。興味深いことに、この機能を共有するニューロンは、一般的に67考えられていたよりも一般的であるように見えます。形態素解析は、電極と軸索の正確な位置を明らかにする。後者の検出は、免疫組織化学68,69を使用して軸索最初のセグメント（電位依存性Na +チャネルまたはアンキリンG）で発現されたタンパク質を標識によって最適化することができます。 樹状記録とその後の神経細胞のラベリングで収集されたデータの信頼性は、常にスライスの品質に依存します。最大限の努力は、したがって、組織内の細胞の生存率を維持するために適用する必要があります。これは、スライスの準備を通して健康な動物、高品質のツールおよび試薬の穏やかな取り扱い、組織や氷冷温度の十分な酸素を用いて達成されます。安定した記録条件は、健康なニューロンの選択に依存しています。全細胞モードでは、直列抵抗は、最初はできるだけ低くあるべきであり、実験中一定に維持しました。録音の安定性は、ドリフトや振動を欠いている高品質のマニピュレータにさらに依存します。ピペットホルダとの接続を確認し、ヘッドステージには、マイクロマニピュレータケーブルが緩みであることを制御する、温度またはステージ移動の急激な変化を回避し、マニピュレータの機構を確認これらの摂動は、ピペットの安定性を最適化することによって低減することができます。デュアル記録のために、メチル13,15,21は、細胞内液に含まれているが、グルコン酸9,14,25は、代わりに使用することができます。しかし、主な陰イオンは、70,71、膜電位およびいくつかの電圧依存電流72を変更することができます。細胞内液はphysioloを維持するためにATP、GTPおよびクレアチンリン酸を補充することができますニューロンの外科用機能。また、体細胞記録中の樹状突起を可視化するためのピペット溶液（ 例えば 、アレクサ594またはスルホローダミン101 41）内の蛍光色素を添加すると、圧力アプリケーションを配置するには、インスタンスのために有用であることができる（参考文献中の図7。41）または電気刺激ピペット。細胞接着型の記録のためのピペット溶液は、大規模な私の 時間を記録するために、高K +濃度となしのNa +が含まれています 。注目に値するのNa + / K +濃度比は、電流振幅10、現在11の逆転電位とI hの 73のゲーティングに影響を与えます。あるいは、I Hはまた、外部アウト10を用いて記録することができます。しかし、この記録構成では、チャネルの近傍の細胞内環境を摂動することができます。その結果、Iの電圧依存性活性化の違い&lt;比較電流がセル付きパッチと外側アウト10を用いて得られたときに、サブ&gt; Hが観察されます。神経細胞の膨潤が時折パッチクランプ記録中に発生した、と多くの場合、そのような溶液の組成の溶液39またはエラー細胞内および細胞外の間の水の低品質、強力な不均衡浸透圧やpHが明確な原因から生じるされます。電気生理学的記録の品質が回復したニューロンの形態の品質に直接入射しています。細胞内環境14の希釈を最小限にするために細胞接着型の録音後- （参考文献で6,11として、10MΩ。6）と、単一の体細胞の録音のために高抵抗体細胞ピペットは、二重の録画に使用されています。細胞接着型の記録以下の全細胞体細胞記録は、したがって、短い（&lt;10分）に維持されます。体細胞および樹状ピペットの両方からアウトサイドアウトのパッチは、cの適切な閉鎖のために不可欠ですエル膜および細胞形態のその後の回復。セルの構成に加えて、神経化学的コンテンツが記録されたニューロン59,74のために決定されてもよいです。例えば、細胞内タンパク質のチロシンヒドロキシラーゼは、DAニューロン13の明確な識別のために免疫標識することができます。 DAニューロンは、SNに主に集中しているSNに存在するはるかに低い密度で、緻密部は、それらがGABAニューロン75のより多くの数と混合された網様を、扁平部。 DAニューロンの細胞体は、GABAニューロンよりもしばしば大きいが、IR-ビデオ顕微鏡でこれらの細胞の視覚的同定が不明と部分的に緻密部の不透明性により妨げられます。これらの制限を回避するために、DAニューロンの事前選択は、DAニューロンのための神経細胞（TH 65 DATの特定の集団における蛍光マーカーを発現するトランスジェニックマウスを使用することによって促進することができる、GADGABAニューロン）と落射蛍光照明用。あるいは、蛍光色素は、樹状突起の可視化を容易にするために、体の電極の液に含まれてもよいです。蛍光細胞の増加解像度はニポースピニングディスク共焦点14,22,30またはIR-DGC 6に合わせた2光子顕微鏡7によってもたらされます。いくつかの利点がDICと比較してDGCに関連しています。 DICプリズムが必要とされないように、まず、IR-DGC画像は蛍光画像49,52,53,76と重ね合わせることができます。第二に、DGCは、光刺激とし、77光遺伝学組み合わせることができます。 スライス標本の欠点は、ニューロンの完全性の維持です。 DAニューロンは、3つの空間の平面78,79に彼らの樹状突起を伸ばすため、樹枝状の区画の切り捨ては完全にスライス80で回避することはできません。スライスの向きの選択（冠状、水平またはパラ）サジタルトレードオフがあります。神経支配と実験デザインの起源は、スライスの右方向を選択するために考慮しなければなりません。 直接樹状パッチは、細胞の異なるコンパートメントにおける機能的イオンチャネルの分布をマッピングするために使用される技術です。また、この技術は、チャネル20の機能的特性の変動を決定するために提供しています。補体のイオンチャネルの位置および密度は、光及び電子顕微鏡レベル17,23で免疫組織化学を使用して確認することができます。このアプローチは、パッチピペットにアクセスできない小口径構造におけるチャネル密度を決定する可能性を提供しています。しかし、これらのチャネルは、パッチクランプ技術を使用して記録したものと比較して異なる機能状態24、あるいは非アクティブになることがあります。両方の技術は、場所との特性の全体像を取得することが必要です特定の細胞領域17におけるイオンチャネル。電位感受性色素の開発と、電圧画像化は、複数の位置81でのニューロンのAPとEPSPSが増殖を調べるために使用されています。デュアルパッチクランプ記録の代わりに、このアプローチはあってもパッチピペットにアクセスすることはできませんが、信号と平均の正確なキャリブレーションを必要と薄いデンドライトのために実施することができます。 SNと腹側被蓋領域におけるDAニューロンが広く生理学的および病態生理学的文脈における体細胞の録音を経由して調査しているが、それらの樹状突起の機能特性は、両方の条件で大部分が未知のままです。樹状突起からパッチ適用は成功13,25,26といくつかのグループによって黒質ドーパミンニューロンのために実装されており、これらの微細な細胞内構造8の興奮性の特性を分析するための最適な方法のままされています。樹状録音はさらにopportuを提供します無限大は、効率性とシナプス伝達の可塑性と樹状突起の興奮82,83の可塑性を精査します。

ニューロンは、それらの樹状突起に主にシナプスの情報を受け取ります。興奮性と抑制性シナプスの信号が活動電位（APは）出力信号として誘発された組み込み部位に世代の自分のサイトから広がりました。その途中で、シナプス電位は、樹状突起の構造およびパッシブとアクティブの膜特性の間の相互作用の両方の影響を受けています。これらの高度に可変パラメータの組み合わせは、ニューロン1,2の計算能力を広げます。しかし、樹状突起の小さい直径は、その電気的特性が研究を妨げます。 6,7の樹状突起- （3ミクロンのØ0.7）パッチクランプ法3の継続的な開発は、過去数十年の間に光学系4とスライス標本5のための方法の改良は、非常に薄いからの録音を有効にしています。これらの方法はあった、と、まだ大部分は様々なOで樹状突起の興奮性を調べるために使用されていますFニューロン8。直接の樹状記録は配布9-19と明確な神経区画におけるイオンチャネルの機能特性20-22の相違を決定するために必須です。これらのデータは、光と電子顕微鏡23,24に合わせた免疫組織化学で検出されたイオンチャネルの分布の必要な補数です。デュアル細胞体樹状突起の録音は、詳細な受動的なケーブルモデルを得る、活動電位の伝播9,13-15,21,22,25-27およびシナプス電位のニューロンの細胞体樹状突起ドメインに沿っ13,16,18を拡散を探索するために実装されました28- 30およびニューロンの統合31の時間分解能を調査します。 黒質（SN）は、このような運動の制御など、いくつかの機能に関与する中脳に位置する領域、報酬や習慣的な行動の符号化です。特定によるドーパミンの減少SN中のドーパミン作動性（DA）ニューロンの損失は、パーキンソン病を患っている32人の患者において観察される運動障害と関連しています。ドーパミン作動性及びGABA作動性ニューロン：黒質回路は、2つの主要な細胞型で構成されています。興味深いことに、これらのニューロンは他のニューロンからそれらを区別するいくつかの特定の機能を持っています。 DAニューロンの大部分と、いくつかのGABAニューロンの軸索は樹状突起樹は25,26,33（軸索軸受と軸索欠けている樹状突起）不均一であることを示す樹状サイトに由来します。これらのニューロンの形態は、ニューロンの典型的な組織で、したがって対照的情報伝達はカハールによって放出された動的分極の法則に従うする：樹状突起から、ソーマに、最終的に軸索34に始まります。 DAニューロンは、また、それらの樹状突起35からドーパミンを放出バースト活動36とNMDA受容可塑性37を生成することが知られています。 dissecこれらの現象の化は、それらが開始されているサイトからの直接録音することなく、とらえどころのないです。正確な位置とイオンチャネルの機能特性と黒質ニューロンにおける樹状突起の興奮や情報伝達における役割との関係への洞察を得るために、直接樹状記録が選択される方法です。 このレポートでは、黒質神経細胞の樹状突起と対応する事後ビオサイチンラベリングから、シングルおよびデュアルパッチクランプ記録を得るために使用できる詳細な手順を説明します。体細胞と樹状突起膜にパッチを適用するための基本的な原則は非常に似ています。実際にしかし、樹状の部位からの記録は、体細胞の録音と比較して、特定の最適化を必要とします。成功した樹状記録はスライス、光学系の最適調整、録音のパッチピペットと安定性の穏やかなアプローチの品質に依存しています。

<table><tbody><tr><td>二重蒸留水</td><td>ミリポア</td><td>スーパーQ</td><td>抵抗率>14 M&Omega; cm、理想18.2 M&Omega; cm、25&nbsp;&deg;C、フィルター付き(0.22&micro;m)、https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>マイクロフィルターキャンドル</td><td>ロブ</td><td>ポロシティ 3、6 mm、または直径 13 mm</td><td></td></tr><tr><td>バイブロプローブ付きティッシュスライサー</td><td>ライカ</td><td>VT1200</td><td>切断パラメータ:速度 0.07、振幅 1.40</td></tr><tr><td>ティッシュスライサー</td><td>ドサカ</td><td>DTK-1000</td><td>切断パラメータ:速度 4、周波数 7</td></tr><tr><td>カミソリの刃</td><td>ジレット</td><td>スーパーシルバー</td><td></td></tr><tr><td>解剖ツール</td><td>ブラウン、Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リザーブチャンバー</td><td></td><td></td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>PP ベッカー</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 & マイクロ;m</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤&nbsp;</td><td>UHU</td><td>「セクンデンクレバー」</td><td>液体のり</td></tr><tr><td>記録室&nbsp;</td><td>ルイグス &ノイマン</td><td>スライスミニチャンバー</td><td></td></tr><tr><td>水平ピペットプーラー</td><td>サッターインスツルメンツ</td><td>ブラウンフレーミングP-97</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>ヒルゲンベルク</td><td>1807524</td><td>2 mm o.d./1 mm id. ガラス製キャピラリー、ファイヤーポリッシュ、洗浄済み</td></tr><tr><td>デンタルワックス</td><td>Colt&egrave;ne/Whaledent</td><td></td><td>歯科矯正トレイ ワックスストリップ</td></tr><tr><td>プラチナ ディスクでカスタムメイド 録音チャンバーにスライスを固定する</td><td>プラチナ</td><td></td><td></td> グリッド</tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>ピペットチップをファイヤーポリッシュ</td></tr> 硫酸<tr><td>カリウム</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>分子プローブ</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>圧力計</td><td>GREISINGER 電子</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>ダッド グラジエント コントラスト</td><td>Luigs &ノイマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マニピュ</td><td>レーターLuigs&Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>フレームグラバー</td><td>イメージングソース</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>コンデンサー</td><td>ツァイス</td><td></td><td>高開口コンデンサー オイルと連動</td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>ツァイス</td><td>W プラン アポクロマート 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X 倍率、長距離、高開口数 1.0 水浸客観的</td></tr><tr><td>な4倍チェン</td><td>ジャーLuigs&</td><td>カメラと顕微鏡の間の</td>ノイマン <td></td></tr><tr><td>白黒ビデオモニター</td><td></td><td>ソニーSSM-175CE</td><td>16インチ、850 TVライン、アナログ</td></tr><tr><td>サンプルボトル、琥珀色ガラス、キャップ付き</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>セットアップから組織学室にスライスを転送する</td></tr> 軸<tr><td>索ガイド</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>ブック</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>電気生理学的データの分析</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>使用</td><td>前に441244安全データシートと危険物質指令(EU)を参照</td></tr><tr><td>固定スライスの染色用</td><td>ウェル細胞培養プレート</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>使用前に</td></tr><tr><td>安全データシートと危険物質指令(EU)を参照マウス抗THモノクローナル一次</td><td>抗体 Immunostar</td><td>22941</td><td>使用濃度:1/1,000</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス二次抗体 - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>使用濃度:1/500</td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond 退色防止</td><td>分子プローブ - サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインアビジン</td><td>DCSベクターラボ</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td> http://imagej.nih.gov/ij/ <td></td><td></td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>ImageJ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td> <td>プラグインImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>バイオシチン充填ニューロンの再構築</td></tr><tr><td>ニューロマンティック</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td> <td>バイオサイトチン充填ニューロンの再構築</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>電気生理学的データの解析</td></tr></tbody></table>

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

ドーパミン作動性ニューロンの樹状突起は、受信およびシナプス入力、支援活動電位逆伝搬し、神経伝達物質の放出を伝えます。これらの基本的な機能を理解することは、これらのニューロン内の情報伝達に光を当てるます。樹状パッチクランプ記録は、直接樹状突起とその下の電位依存性イオンチャネルの電気的特性を検査する可能性を提供します。しかし、これらの微細構造は、その小径のパッチピペットへ簡単にアクセスすることはできません。このレポートでは、急性スライスにおけるドーパミン作動性ニューロンの樹状突起からの安定した信頼性の高い記録を収集するためのステップバイステップの手順を説明します。電気生理学的測定は、細胞形態の事後回復と組み合わされます。成功した実験は、スライス、ソリューションおよびピペットの改善された準備、記録された構造と接触しているピペットの光学系と安定性の十分な調整に依存しています。ソムの標準原則ATICパッチクランプ記録は、樹状突起ではなくピペットの穏やかなアプローチが印加されています。これらの用途の広い技術は、樹状突起の興奮特性に関する様々な問題に対処するために実装することができます。

上記のプロトコルは、樹状パッチクランプ記録を用いて、データの収集を容易にすることを目的とします。 事後組織化学と組み合わせたこの技術は、発信または樹状突起の中に広がり、多くの電気信号のメカニズムへの洞察を得るために役立ちます。パッチピペットと樹状突起への直接アクセスは困難であるが、いくつかの方法論的側面への特別な注意は、レコーディングの成功率が向上します。十分に安定した体細胞記録で経験実験者は試みのほとんどに高抵抗（GΩ）シールおよび完全な実験を得ることを期待することができます。 2高品質の樹状記録するための一つは、解剖ごとに収集することができます。 健康的な細胞体と樹状突起を含む高品質の脳スライスの可用性は、これらの微細構造（ 図1）にアクセスするための前提条件です。 criteriこれらのニューロンを選択するためのすべてのセルと最適な調整された光学系（ 図1Aおよび1B）で観察されたコントラストの低い相馬と樹状突起の上に滑らかで均質な表面です。ニューロンを選択すると、あまりにも強く、一般的に不安定な録音（ 図1Cおよび図1C）につながる対比します。したがって、このようなニューロンは避けるべきです。 他のニューロンと比較して、黒質DAニューロンは、特定の形態学的および電気生理学的特性を示します。通常、単一の体細胞をピペットを用いて評価し、これらの機能は、デュアル体（ 図2）、細胞体樹状突起の記録（ 図3）で観察することができます。ロング過分極電流の注入は、「サグ」（ 図2Bおよび5D）と呼ばれる膜電位整流を誘発します。識別されるような軸索、樹状敷地内に、ほとんどの場合、発信しますこれらのニューロンにおける樹状突起区画は異種の（ - 3B 図3A）であることを示す、相補的な基準を13,25,26を使用。 13,25,26 -結果として、APが最初に観察された区画は軸索は、（3D 図3C）を出現する区画に対応しています。軸索は、一般的に64をスライス中に軸索の切断に起因する軸索胞で終了しますが、この構造を系統的に検出されません。 I hの活性化に連続した黒質のDAニューロンで観察された顕著なたるみは、HCNサブユニットの高発現を示唆しています。シナプス信号の統合のI hの影響を判断するには、シナプスのような電流（EPSC）の波形が生成され、細胞体樹デュアル録音55（&lt;時の樹状記録電極を介して注入しました。強い&gt;図4）。これらのシミュレートされたEPSCsの動態は、実際の自発EPSCsの立ち上がりと立ち下がり時間定数に基づいていました。その結果aEPSPは、体の電極で記録しました。 I hの 遮断 ZD 7288のバス・アプリケーションは、シナプスの信号（ 図4B）の時間経過にI hの寄与を示す、aEPSPの持続時間を増加させました。 ZD 7288は、I H（ 図4C）の起動からサグ結果ことを確認し、膜電位の整流を廃止しました。シミュレートされたEPSPを用いて得られた結果は、電気的に誘発のEPSP 65を用いた実験に相関されることがあります。 DAニューロンの細胞体樹状突起領域のチャネルの正確な分布をマップするには、細胞接着型の記録は、（ 図5）実装されました。高抵抗シール（&gt;&gt; 1GΩ）は（ 図5（b）細胞接着型の記録のための絶対必要です</強いです&gt;）。 DAニューロンの樹状突起では、I hは長い過分極電圧ステップでゆっくりと活性化し、定常電流は、先に示した66のように、ミリ秒（ 図5C）の何百もの後に達成されます。この観察は、DAニューロンの樹状突起で発現HCNチャネルは、錐体ニューロンまたは他の細胞タイプ10,16,66のものと比較して異なるサブユニットを有することを示します。チャネルの分布は樹状突起コンパートメント内および樹状コンパートメントが異機種そのものであるとして不均質であるかもしれないとして、樹状突起（軸索ベアリングまたはnonaxon軸受樹状突起）の同一性は、共焦点画像とIR-DGCの画像を比較することによって明らかにされますビオシチン染色（ 図3AおよびB）の後。細胞形態の回復は二重の細胞体樹状突起の録音の両方のために、その後の体細胞ホールセル記録を介した細胞接着型の記録のために必要があります。 赤外線ビデオ顕微鏡を使用した黒質ドーパミン作動性ニューロンの相馬と近位樹状突起の可視化 図1。 （A）ソーマと近位樹状突起と体細胞および樹状ピペットの両方を示す黒質のDAニューロンのIR-DGCイメージ。デュアル細胞体樹記録が正常にこの健康的なニューロンについて行きました。すべての細胞の細胞体樹状突起ドメインにわたって低コントラストと滑らかな表面を観察します。（B）健康DAニューロンの別の例を。（C）DAニューロンを粗くし、凹凸面と強いコントラストで。デュアル記録が得られたが、安定性が最適以下とし、記録時間が原因両方のピペットにアクセス抵抗が徐々に増加する（〜15分）で短かった。強く対比を示すDAニューロンの（D）第二の例ソーマと近位樹状突起。この場合、アクセス抵抗の強い増加は、全細胞モードで中断直後に観察されました。負圧によってアクセス抵抗を減少させる試みは失敗しました。パネルCおよびDにおけるニューロンは、スライス手順の間に損傷している可能性があり、実験のために避けるべきである。（E）記録の開始時に健康DAニューロンにおける同時二重の体細胞記録。（F）と、パネルEと同じニューロン〜17分後に腫れ細胞体。相馬のボール状の外観と健康ニューロンにおいて明らかではない、大きな核の存在、コントラストの完全な欠如に注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> 図2。 </strong&gt; 同時ダブル体細胞の録音DAニューロンから。（A）IR-DGCの画像DAニューロンから二重の体細胞記録中。（B）過分極と1秒脱分極長い現在の注射（-160 pAの80、80 pAのをインクリメント）し、両方のパッチピペットと同時に記録された電圧の変化に対応します。脱分極電流パルスの間に長い過分極電流ステップとAP後の後過分極大の電圧トレースでたるみの存在に注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> 図3. DAニューロンにおけるデュアルS omatodendritic録音。（A）DAニューロンのIR-DGCイメージ。樹状突起と細胞体の間の距離チックピペットは、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）とコンジュゲートしたアビジンで標識されたパネルAにおけるニューロンの29ミクロン（B）共焦点zの投影像です。ニューロンは、記録時にビオシチンを充填しました。矢印で示すように軸索は細胞体に近い近位樹状突起に由来する。（C）パネルAの細胞体に記録されているAP（黒電圧トレース）と樹状突起（赤電圧のニューロンからの同時デュアル細胞体樹状突起細胞全体の電圧記録黒現在のトレース）と交互に樹状ピペット（右;左の体を介して、1秒長い電流注入ステップ（に応じてトレース）。赤現在のトレース）（D）体細胞および樹状AP拡大タイムスケールで示します。体細胞または樹状電流注入のいずれかで、体細胞AP（黒）は、樹状AP（赤）を先行しました。このニューロンのAP間の遅延はそれぞれ、体細胞と樹状電流注入で120マイクロ秒と210マイクロ秒でした。遅延APの立ち上がり段階の間にAP半最大振幅で測定しました。 APは、軸索は、以前の観察25,26を確認し、出現するに近い区画内に最初に観察されます。この場合には、樹状記録が軸索欠く樹状突起から形成されています。軸索保有樹状突起からの記録の例参考文献である。13（その図1）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> DAニューロンの細胞体樹状突起の軸に沿って人工のEPSPの 図4. 伝播。 （A）DAニューロンのIR-DGCイメージ。樹状細胞および体ピペットとの間の距離は45μmです。両方のパッチピペットは、全細胞電流クランプ記録モードである。（B）現在電流クランプ樹状ピペットを用いて記録し、人工EPSP（上部）を生成するために使用されます。樹状記録ピペット55を介して電流がEPSC状の波形（振幅= 100のpA; = 3ミリ秒τ 減衰 τ 上昇 = 0.6ミリ秒）を注射することにより得られます。底部では、aEPSPsが制御条件（黒）にし、I hの 遮断薬ZD7288（;赤トレース30μM）の浴適用後にソーマで記録伝播。各電圧トレースは、40単一スイープの平均です。 EPSPの時間経過にI hの寄与を示すZD7288の存在下で、EPSP期間の大幅な増加を観察します。制御条件（黒）で、30μMのZD 7288の適用後にソーマから記録（C）電圧トレース（長い（30 PAに応じて赤）; 1秒）過分極電流ステップ。 私の閉塞が&lt;後膜電位整流（サグ）が存在しないことに注意してください。サブ&gt;時間。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> DAニューロンの樹状突起における I h の 図5. 存在 。近位樹状突起上のDAニューロンとピペットの（A）IR-DGCイメージ。（B）細胞接続構成で5 mVの電圧指令時の容量とリーク電流。 。シール抵抗は、この例では5GΩ（C）過分極電圧ステップ（90 mVで、上部）で0 mVでの膜電位から徐々に活性化I Hを誘導しました。現在のトレースが反転し、τ= 632ミリ秒の時定数を与える単一指数関数でフィッティングした。（D）電圧1秒ハイパーへの全細胞記録ソーマ（パネルA）の反応と脱分極電流パルス（120 PAに-160、40 pAの増分）。体全細胞記録は、細胞付着した記録後に行きました。細胞接着型の記録時に自然発火を抑制するためTTXとのCd 2+の細胞外アプリケーションへのAPが存在しないことに注意してください。これらの電位依存性Na +及びCa 2+電流遮断アクション電流を抑制するために添加しました。パネルA - 。。-120 mVの50ミリ秒のプレパルスから0 mVのに試験パルスによって活性化さDと同じニューロンからのものである別のDAニューロンおよび樹状ピペットの（E）IR-DIC画像（F）電位依存性電流アウトサイドアウトパッチでパネルE.保持電位-80 mV単位ニューロンの近位樹状突起から切除。現在の時間依存的不活性化に注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">拡大表示はこちらをクリックしてください</a>この図のバージョン。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>物質</td><td>グラム/モル</td><td>濃度</td><td> 1 L用</td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 58.443 </td><td> 125 mMの</td><td> 7.305グラム</td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84.007 </td><td> 25 mMの</td><td> 2.100グラム</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 74.551 </td><td> 2.5 mMの</td><td> 0.186グラム</td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1.25 mMの</td><td> 0.172グラム</td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 198.17 </td><td> 25 mMの</td><td> 4.95グラム</td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M（ソリューション） </td><td> 1 mMの</td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M（ソリューション） </td><td> 2 mMの</td><td> 2 mLの</td></tr><tr><td colspan="4">浸透圧：〜310ミリオスモル/ L（最適範囲- 325ミリオスモル/ L）でpH = 7.4 314 </td></tr></tbody></table> 表1： 人工脳脊髄液（ACSF）。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>物質</td><td>グラム/モル</td><td>濃度</td><td> 1 L用</td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 58.443 </td><td> 87 mMの</td><td> 5.084グラム</td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84.007 </td><td> 25 mMの</td><td> 2.1001グラム</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 7.551 </td><td> 2.5 mMの</td><td> 0.18637グラム</td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1.25 mMの</td><td> 0.17248グラム</td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M（ソリューション） </td><td> 7 mMの</td><td> 7ミリリットル</td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 198.17 </td><td> 10 mMの</td><td> 1.9817グラム&lt;/ TD&gt; </tr><tr><td>スクロース</td><td> 342.29 </td><td> 75 mMの</td><td> 25.672グラム</td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M（ソリューション） </td><td> 0.5 mMの</td><td> 0.5 mLの</td></tr><tr><td colspan="4">浸透圧：〜326ミリオスモル/ L、pHは= 7.4 </td></tr></tbody></table> 表2： スクロースACSFスライスを準備します。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>物質</td><td>グラム/モル</td><td>濃度</td><td> 100 mLのための</td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150.2 </td><td> 120 mMの</td><td> 1.8024グラム</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 74.56 </td><td> 20 mMの</td><td> 0.14912グラム</td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M（ソリューション） </td><td> 2 mMの</td><td> 200μlの</td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551.1 </td><td> 2 mMの</td><td> 0.1102グラム</td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523.2 </td><td> 0.5 mMの</td><td> 0.02661グラム</td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255.1 </td><td> 5 mMの</td><td> 0.1275グラム</td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380.4 </td><td> 0.1 mMの</td><td> 3.803ミリグラム</td></tr><tr><td>ヘペス</td><td> 238.31 </td><td> 10 mMの</td><td> 0.23831グラム</td></tr><tr><td>ビオシチン</td><td> 1mg / mlの</td><td></td><td> 0.1グラム</td></tr><tr><td colspan="4">浸透圧：〜302ミリオスモル/ L、pH値= 7.2 KOHで調整</td></tr></tbody></table> 表3： デュアル録音のための細胞内液。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>物質</td><td>グラム/モル</td><td>濃度</td><td> 100用mLの</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 74.56 </td><td> 120 mMの</td><td> 0.8947グラム</td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M（ソリューション） </td><td> 2 mMの</td><td> 200μlの</td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M（ソリューション） </td><td> 1 mMの</td><td> 100μlの</td></tr><tr><td>ヘペス</td><td> 238.31 </td><td> 10 mMの</td><td> 0.23831 </td></tr><tr><td> TEA-Clを</td><td> 165.7 </td><td> 20 mMの</td><td> 0.3314グラム</td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94.11 </td><td> 5 mMの</td><td> 0.04705グラム</td></tr><tr><td> BaCl 2 </td><td> 244.26 </td><td> 1 mMの</td><td> 0.02443グラム</td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> 183.32 </td><td> 0.02 mMの</td><td> 0.3666ミリグラム</td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mMの</td><td> 200 nMの</td><td> 20μlの</td></tr><tr><td colspan="4">浸透圧：〜290ミリオスモル/ L、D-グルコース（参考文献16）で調整。 pH値= 7.4 </td></tr></tbody></table> 表4： 細胞接着型の記録用電極ソリューション。

細胞内パッチクランプ記録は、樹状突起の機能的特性を調査する可能性を提供します。しかし、これらの微細な構造物は、直径が小さいため、簡単にはアクセスできません。ここで説明するプロトコルは、in vitroでスライス中のドーパミンニューロンの樹状突起からの安定した信頼性の高い記録の収集を容易にすることを目的としています。

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

この手法は、個々の電位依存性イオンチャネルが特定のニューロンの機能にどのように寄与しているかなど、神経生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、ニューロン内のサブセルラーレベルでイオンチャネルの機能をマッピングできることです。まず、底面をSiliGuardでコーティングした9 centimeterのペトリ皿に脳を置いて、この手順を開始してください。次に、脳を氷冷したスクロース含有ACSFで満たします。冠状断面のスライスを調製するため、2回切断して小脳と脳の吻側部を除去します。その後、試料トレイにシアノアクリレート接着剤を塗布し、吻側部が切断ステージに向くように脳ブロックをトレイに固定します。続いて、脳にスクロース含有ACSFを数滴滴下し、トレイをゆっくりと切断チャンバーに浸します。その後、カミソリの刃を水平面に対して15度の角度に調整します。黒質に達する前に、吻側方向へ約500 µmの冠状断脳切片を作成します。次に、厚さを調整して、目的領域を含む300 µmの切片を切り出します。シリンジに取り付けた非常に細い穿刺針をカミソリの刃の端に平行に沿わせ、切片を組織ブロックから切り離します。その後、切片を34 °Cの保存チャンバーに移し、1時間置きます。本手順では、脳切片を記録室へ移します。白金リングを用いて切片を記録室の底に固定し、切片の表面が平滑かつ均一で、質が良いことを確認してください。次に、同一平面上で長い距離にわたって伸びている樹状突起を持つニューロンを選択し、目的の樹状突起が明確な細胞体まで追跡できることを確認します。次に、パッチピペットに電極溶液を満たします。セルアタッチ法で樹状突起をパッチする場合、樹状突起の一部を特定してピントを合わせます。ピペットに正圧をかけ、マイクロマニピュレーターを使用して接近させます。次に、ピペットを膜に近づけ、圧力を調整して小さなディンプルを作成します。その後、ピペットチップの圧力を解放し、ピペット抵抗を制御しながら樹状突起にパッチを形成します。細胞膜固定法（cell-attached recording）では、シール抵抗が1gigaohm以上、できれば3〜10gigaohmの間になるように調整してください。その後、樹状突起の変形を避けるため、ピペットを膜から数µm後退させます。ここで観察される活動電流は、黒質ニューロンの自発的な活動電位を表しています。活動電流を抑制するには、ACSFにカルシウムおよびナトリウムチャネル遮断剤を添加してください。次に、0 mVの保持電位から90 mVの電圧ステップを印加し、過分極活性化陽イオン電流を誘発させます。記録の終了時にパッチを破裂させ、ホールセルモードにします。その後、樹状突起ピペットをニューロン膜からゆっくりと慎重に引き抜き、outside-outパッチを作成します。ホールセルモードで対応する細胞体から記録を行うには、樹状突起に対応する細胞体を特定します。5〜10 MΩの抵抗値を持つ、カリウムベースの細胞内液を満たしたピペットを細胞体に近づけます。その後、ピペット先端に短時間の陰圧をかけ、細胞膜を破砕してホールセルモードに移行させます。電流クランプモードで、長い時間の過分極および脱分極電流ステップを印加し、ニューロンの同定を行います。同時に、ピペットからバイオシチンを樹状突起に沿って拡散させます。10分後、ピペットを引き抜き、outside-outパッチを作成します。ピペットがスライスの上方に達したら、短い横方向の上方運動を繰り返すことで細胞膜を適切に閉鎖させ、記録室から完全に脱出させます。バイオサイチンと記録したニューロンを平衡化させるため、スライスを標準ACSFが入った記録室にさらに15分間保持します。その後、スライスを組織学用の標準ACSFが入った25ミリリットルの遮光ガラス瓶に慎重に移します。この手順では、エピ蛍光顕微鏡を用いて、スライス内の蛍光標識されたニューロンのおおよその位置を確認します。10倍対物レンズを用いて、ニューロンの樹状突起を簡潔に観察し、軸索および軸索ブレブの位置を確認します。次に、共焦点顕微鏡に切り替え、488 nmレーザーダイオードを選択してラベル化されたニューロンを励起させます。Z軸方向に沿って軸索と樹状突起の伸展を追い、連続的に画像を記録して、細胞全体のZスタックを取得します。Z軸の解像度を調整し、低倍率および高倍率で細胞の共焦点画像を収集します。最後に、イメージングソフトでニューロンの画像ファイルを開きます。電生理学的記録中のパッチピペットの正確な位置を特定するため、Z投影画像とIR-DGC画像を視覚的に比較します。ここに示すのは、ドーパミン作動性ニューロンと近位樹状突起上のピペットのIR-DGC画像である。電流トレースは、セルアタッチ法において、シール抵抗5 GΩの条件下で、5 mVの電圧コマンドに応答したEN漏洩電流の容量を示している。膜電位0 mVからの過分極電圧ステップにより、緩徐に活性化する過分極活性化陽イオン電流が誘導された。現在のトレースを反転させ、単一指数関数でフィッティングした結果、時定数は632 millisecondsとなりました。以下は、細胞固定記録中の活動電位を除去するために電位依存性ナトリウムおよびカルシウム電流遮断剤を添加し、細胞体から記録した1秒間の過分極および脱分極電流パルスに対するホールセル電圧応答です。この手法に習熟すれば、適切に実施することで1日で完了させることができます。この手順を行う際は、健全な組織を採取し、安定した記録条件を確保することが重要です。本手順に続いて、記録したニューロンの同一性の確認など、さらなる疑問を解消するために、免疫組織化学などの他の手法を実施することが可能です。この技術の開発により、神経生理学分野の研究者が、興奮性細胞における電位依存性イオンチャネルの特性や機能、およびその役割を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、樹状突起における電位依存性イオンチャネルを流れる電流の分布を記録し、解析する方法について十分に理解できるはずです。

subcellular-patch-clamp-recordings-from-somatodendritic-domain-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、我々はラット脳スライスにおける全細胞の構成で記録されたドーパミン作動性ニューロンへのコンダクタンスを適用する方法を示します。この手法は、ダイナミッククランプと呼ばれています。...

ダイナミッククランプ法を用いたラット中脳ドーパミン作動性ニューロンにおけるNMDA受容体のコンダクタンスのアプリケーション

アンペロメトリック技術は自発的ドーパミンの酸化によって生成される酸化電流を検出することにより、単一細胞からのドーパミン放出を測定します。同時電圧クランプとアンペロメトリー方法論はドーパミントランスポーターおよびドーパミンの逆輸送上のこの活動の調節の役割の全体的な...

同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測

このビデオでは、樹状膜表面からのパッチクランプ記録の手法を示しています。これは、ドーパミン作動性ニューロンの樹状突起とその下にある電位依存性イオンチャネルの電気的特性を直接調べるのに役立ちます。...

脳スライスにおけるドーパミン作動性ニューロンの樹状突起からのパッチクランプ記録

このビデオは、全細胞パッチクランプ技術を使用してニューロンの発火パターンを分析するために、脊髄切片のゼラチノーサ(SG)ニューロンで電気生理学的記録を実行する手順を示しています。この方法により、脊髄のSGニューロンの刺激に対する神経応答の研究が可能になります。...

脊髄切片のゼラチノーサニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録

このビデオは、パッチクランプ技術を使用してレオベースと膜電位を測定し、増分電流注入に対するニューロンの応答を分析する後根神経節の感覚ニューロン興奮性の調査を示しています。...

Intact Rat背根神経節の全細胞パッチクランプ記録

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。...

一チャネルセル付パッチクランプ法

このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。...

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

この原稿は、パッチクランプ録音のための無傷の後根神経節の準備方法を説明しています。この調製物は、ニューロンおよびサテライトグリア細胞の微小環境を維持し、解離したDRGニューロンを使用して見られる表現型および機能的変化を回避します。...

成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

このプロトコルは、フラットマウント調製物から網膜ニューロンの全細胞パッチクランプ記録を実行する方法を示しています。...

Deafferentatedマウス網膜のフラットマウントの準備中のスターバーストアマクリン細胞のパッチクランプ記録

このプロトコルでは、重要なステップとパッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行に必要な注意事項をについて説明します。この手法は、あらかじめ決められた一連のホールセルパッチク...

パッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆のトランスクリプション ポリメラーゼ連鎖反応

ここでは、内耳の前庭神経節および螺旋神経節ニューロンからの解剖、解離、培養、およびパッチクランプ記録の詳細な手順を提供する方法を示します。...

パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

学ぶ亜細胞パッチクランプ記録法で黒質ドーパミンニューロンの樹状突起からイオンチャネル機能を解析する技術。この方法は神経細胞の電気生理学的特性を詳細に調べるのに有用である。

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

さらに動画を探す