黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

この方法は、個々の電位依存性イオンチャネルが特定のニューロンの機能にどのように寄与しているかなど、神経生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、イオンチャネルの機能をニューロンの細胞内レベルでマッピングできることです。この手順は、脳を9センチのシャーレに置き、底をSiliGuardの層で覆うことから始めます。

次に、氷のように冷たいスクロース-ACSFで脳を囲みます。冠状スライスを準備するには、脳の小脳と吻側部分を取り除くために2つのカットを行います。次に、標本トレイにシアノアクリレート接着剤を塗布し、吻側部分がスライス段階を向くようにブレインブロックをトレイに接着します。

続いて、脳に数滴のスクロース-ACSFを塗布し、トレイをゆっくりと切断チャンバーに沈めます。その後、かみそりの刃を水平面を基準にして15度の角度で調整します。黒質に到達する前に、コトル鼻方向に約500マイクロメートルの冠状脳スライスをカットします。

次に、厚さを調整して、関心領域を含む300マイクロメートルのスライスをカットします。かみそりの刃の端に平行なシリンジに取り付けられた非常に細い淫乱針で、スライスを組織ブロックから分離します。その後、スライスを摂氏34度のリザーブチャンバーに1時間移します。

この手順では、脳スライスを記録チャンバーに移します。スライスを記録チャンバーの底にプラチナリングで固定し、スライスが滑らかで均一な表面で高品質であることを確認します。次に、同じ平面上に長距離にわたって伸びる樹状突起を持つニューロンを選択し、対象の樹状突起を明確に定義された体細胞まで追跡できることを確認します。

次に、パッチピペットに電極溶液を充填します。細胞付着モードで樹状突起にパッチを適用するには、樹状突起の一部を特定して焦点を合わせます。ピペットに陽圧を加え、マイクロマニピュレーターを使用してピペットを下げます。

次に、ピペットをメンブレンの近くに置き、圧力を調整して小さなくぼみを作ります。その後、ピペットの先端にかかる圧力を解放し、ピペットの抵抗を制御しながら樹状突起にパッチを当てます。セルに付着した記録では、1ギガオームより大きいシール抵抗、せいぜい3〜10ギガオームを得るようにしてください。

その後、樹状突起の変形を避けるために、ピペットをメンブレンから数マイクロメートル引き込みます。ここで見られる活動電流は、黒体ニューロンの自発的な活動電位を表しています。作用電流を抑制するには、カルシウムとナトリウムのチャネル遮断薬をACSFに適用します。

次に、保持電位が0ミリボルトから90ミリボルトの電圧ステップを印加して、過分極活性化カチオン電流を呼び起こします。録音の最後に、パッチを破裂させて全細胞モードにします。その後、樹状突起ピペットを神経膜からゆっくりと穏やかに引き抜き、アウトサイドアウトパッチを取得します。

全細胞モードで対応する体細胞から記録するには、樹状突起の対応する体細胞を見つけます。5〜10メガオームの抵抗を持つピペットを、カリウムベースの細胞内溶液で細胞体に下げます。次に、ピペットの先端に短い負圧を加えてメンブレンを破裂させ、全細胞モードを実現します。

電流クランプモードのニューロンの同一性を確認するには、長いハイパーおよび脱分極電流ステップを適用し、ピペットからのバイオシチンを樹状突起に沿って拡散させます。10分後、ピペットを引き出して、アウトサイドアウトパッチを取得します。ピペットがスライスの上に来たら、細胞膜を適切に閉じるように、一連の短い横方向の上向きの動きを使用して、記録チャンバーから完全に出ます。

スライスを標準的なACSFでさらに15分間記録チャンバーに保持し、バイオシチンと記録されたニューロンの平衡化を可能にします。次に、組織学用の標準ACSFが入った25ミリリットルの琥珀色のガラス瓶にスライスを静かに移します。この手順では、蛍光で標識されたニューロンをエピフルオレッセンスのスライスに大まかに配置します。

ニューロンの樹状突起アーバーを簡単に調べ、10倍の対物レンズを使用して軸索と軸索のブレブを特定します。次に、共焦点顕微鏡に切り替え、488ナノメートルのレーザーダイオードを選択して、標識されたニューロンを励起します。軸索と樹状突起のZ軸の延長をたどり、連続した画像を記録することで、細胞全体のZスタックを得ることができます。

Z軸の解像度を調整し、低倍率と高倍率でセルの共焦点画像を収集します。最後に、イメージングソフトウェアでニューロンの画像ファイルを開きます。Zプロジェクション画像とIR-DGC画像を目視で比較し、電気生理学的記録中のパッチピペットの正確な位置を特定します。

ここに示されているのは、近位樹状突起上のドーパミンニューロンとピペットのIR-DGC画像です。電流トレースは、セル接続構成で、シール抵抗が5ギガオームの5ミリボルトの電圧コマンドに応答するENリーク電流の容量を示しています。0ミリボルトの膜電位からの超分極電圧ステップは、ゆっくりと活性化する超分極活性化陽イオン電流を誘発しました。

電流トレースは反転され、単一の指数関数で取り付けられ、時定数は632ミリ秒になりました。これは、細胞付着記録中に活動電位を除去するための電圧依存性ナトリウムおよびカルシウム電流遮断剤の存在下で、1秒間の超分極電流パルスに対する細胞全体の記録された体細胞の電圧応答です。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、1日で実行できます。

この手順を試みる際には、健康な組織と安定した記録条件を得ることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、記録されたニューロンの同一性などの追加の質問に答えるために、免疫組織化学などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、神経生理学の分野の研究者が興奮性細胞における電位依存性イオンチャネルの特性と役割の機能を調査する道を開きました。

このビデオを見れば、樹状突起の電位依存性イオンチャネルを流れる電流の分布を記録し、調べる方法について十分に理解できるはずです。