Name: 植物組織からの有機酸を定量化するためにキャピラリー電気泳動を使用した：テストケースを調べますコーヒーノキアラビカ種子 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学ぼうキャピラリー電気泳動を用いた植物組織中の有機酸定量法。Coffea arabica種子を例に、最小限の前処理と高スループットで食品品質評価や植物生理学研究に応用可能です。

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著者は、このプロジェクトがJ.M. Smucker社から財政的に支援を受けたことに感謝したいと思います。

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

任意の分析技術と同様に、大幅に生成されたデータの品質と信頼性に影響を与えることができるいくつかの重要な要因があります。まず、凍結/融解サイクルの最小値と、効率的にサンプルを処理することが重要です。凍結融解の繰り返しは、処理や分析の前に、試料の化学組成を妥協することができます。第二に、一貫して均等にすべてのサンプルにこのプロトコルのステップを適用することが重要です。一貫性のない試料調製および取り扱いに起因する技術的エラーが大幅に生成されたデータの品質に影響を与え、そしてSCCA測定における増加 &quot;ノイズ&quot;をもたらすことができます。例えば、サンプル後粉砕の粒子サイズは、SCCA抽出の速度と効率に影響を与えます。サンプルを横切って抽出効率を維持し、サンプル間のばらつきを減らすのを助けるように試料は、均一な粒子サイズに粉砕されることを保証することが重要です。シムilarly、標準溶液、試料質量の正確な測定、及び抽出時間を注意深く監視（および正規化）の調製の間を正確に測定し、ピペットは、より均一なデータの生成をもたらします。慎重に、対策を正規化し、これらの各パラメータを記録するために時間を取ることは、データの信頼性を確保し、発...

カルボン酸は、1つ以上の末端カルボキシル官能基を含む有機化合物であり、それぞれが1つ以上の炭素(R-C[O]OH)を含むR基に結合しています。炭素を1〜6個含む短鎖低分子量カルボン酸(短鎖カルボン酸、SCCA)は、細胞呼吸の必須成分であり、細胞の成長と発生に必要ないくつかの生化学的経路で機能します。SCCAは、細胞代謝1、細胞シグナル伝達2、および環境に対する生物の応答(抗菌薬3など)において重要な役割を果たします。このため、SCCAは、細胞代謝、植物のストレス応答4,5、および果実の品質6,7の混乱の有用な指標として役立つ可能性があります。これまで、SCCAは主に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)やガスクロマトグラフィー質量分析法(GC-MS)などのクロマトグラフィー技術によって定量されてきました。これらの方法は、非常に低い検出限界を達成することができますが、高価であり、腐食性試薬および/または毒性試薬を使用した標的SCCAの誘導体化が必要であり、GCまたはHPLCでの長時間の分離ランが含まれます。このため、有機酸を定量するために、サンプルの誘導体化を必要としない遊離帯状キャピラリー電気泳動(CZE)を使用することへの関心が着実に高まっています8。
Free zonal Capillary Electrophoresis(CZE)は、理論段数が多く、速度が速く、比較的使いやすいことから、陰イオン、陽イオン、アミノ酸、炭水化物、短鎖カルボン酸(SCCA)の定量(特に品質管理目的)の分析方法として、GC-MSと高圧液体クロマトグラフィーの両方にますます取って代わるクロマトグラフィー分離法です8,9,10.SCCAを含む低分子のCZEベースの分離は、2つの主要な原理に基づいています:キャピラリーを満たすバッファー全体に確立された電場での荷電イオンの電気泳動運動。そして、毛細血管の一方の端からもう一方の端へ、一般的には負極に向かって、バッファーシステム全体の電気浸透圧運動。このシステムでは、小分子はさまざまな速度で負極に向かって移動し、各分子の速度は分子の正味電荷と分子質量の比によって決定されます。このシステム内の個々の分子の動きは、分子の電荷状態と電気浸透流の全体的な速度(それ自体がキャピラリーを満たすために使用されるバッファーのイオン含有量に基づく)に依存するため、バッファーのpHとイオン組成は、CZEを使用して分子を効率的に分離できる程度に大きく影響します。このため、SCCAは電荷対質量比が比較的高いため、CZEベースの分離の理想的なターゲットです。CZEを用いて分離された代謝物は、UV吸光度、スペクトル吸光度(通常はフォトダイオードアレイ[PDA]を使用して実施)、および/または質量分析法(CE-MSまたはCE-MS/MS)8を含むさまざまな方法を使用して検出できます。CZEが提供する分離および検出方法の多様性により、CZEは非常に柔軟で適応性の高い手法となっています。このため、CZEは、食品の安全性と品質11,12、医薬品研究13、および環境モニタリング13,14の分野で、標準的な分析方法としてますます適用されています。
キャピラリー電気泳動は、ほぼ20年間、短鎖カルボン酸の検出と定量に使用されてきました13。CZE分析の分解能(特に荷電した低分子)、短い実行時間、およびサンプルあたりの低コストにより、CZEはSCCAの分離および定量に理想的な手法です13。この方法は、CZEを利用して植物組織からの有機酸の濃度を測定するためのプロトコルを提供します。このプロトコルを成功裏に実施することで、二次発酵処理後のコーヒー種子中の有機酸レベルの変化を測定するためのサンプルデータが生成されました。このプロトコルでは、CZEベースのSCCA分離の重要なステップと一般的なエラーを詳しく説明し、このプロトコルを成功裏に適用して追加の植物組織中のSCCAを定量する方法について説明しています。

<table><tbody><tr><td>セラミックモアターと乳棒</td><td>クアーズテック</td><td>60310</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン・コールター P/ACE MDQ CEシステム</td><td>ベックマン・コールター</td><td>各種</td><td></td></tr><tr><td>ガラスサンプルバイアル</td><td>フィッシャー社</td><td>033917D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量遠心チューブ&nbsp;</td><td>フィッシャー株式会社</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td>LC/MSグレードの水</td><td>フィッシャー社</td><td>W6-1</td><td>ミリQ水 (18.2&nbsp;M&オメガ;&#183;cm)も許容されます</td></tr><tr><td>15 mlガラス管/テフロン裏地付きキャップ&nbsp;</td><td>フィッシャー株式会社</td><td>14-93331A</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム エム</td><td>・フィッシャー</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>CElixirOA検出キット pH 5.4&nbsp;</td><td>MicroSolv</td><td>06100-5.4</td><td></td></tr><tr><td>BD Safety-Lokシリンジ</td><td>フィッシャー株式会社</td><td>14-829-32</td><td></td></tr><tr><td>17 mm ターゲット シリンジ フィルター、PTFE</td><td>Fisher Inc.</td><td></td><td></td>3377154</tr><tr><td>32 Karat, V. 8.0 制御ソフトウェア</td><td>ベックマン・コールター</td><td>285512</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリー電気泳動 (CE) サンプルバイアル&nbsp;</td><td>ベックマン・コール</td><td>ター144980CE</td><td></td></tr><tr><td>バイアル用キャップ&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>144648</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>液体窒素は、ほとんどの施設サービスから入手可能です</td></tr></tbody></table>

植物組織からの有機酸を定量化するためにキャピラリー電気泳動を使用した：テストケースを調べます<em&gt;コーヒーノキアラビカ</em&gt;種子

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

カルボン酸は、一つ以上の末端カルボキシル（COOH）官能基を含む有機酸です。短鎖カルボン酸（SCCAs; 3〜6個の炭素を含有するカルボン酸）、そのようなリンゴ酸やクエン酸などは、それらが細胞呼吸で機能し、細胞の健康の指標として役立つことができる多くの生物学的システムの適切な機能に重要です。食品中に、有機酸の含有量は、酸味又は「酸」味をもたらす増加SCCAレベルと、味に大きな影響を与えることができます。このため、有機酸濃度の迅速な分析のための方法は、食品及び飲料産業に特に重要です。しかし、残念ながら、SCCAの定量化のために使用されるほとんどの方法は、高価で、クロマトグラフィーおよび/または質量分析解析に続いて、危険な試薬を用いたサンプルの誘導体化を必要とする時間のかかるプロトコルに依存しています。この方法は、組織の検出および定量化のための別の方法を詳述しますフリーゾーンキャピラリー電気泳動（CZE）を用いて植物材料と食品試料からANIC酸は、単に、キャピラリー電気泳動（CE）と呼ばれます。 CZEは、検出の下限（0.005ミリグラム/ ml）でSCCAsを測定するための費用対効果の高い方法を提供します。この記事では、植物試料からSCCAsの抽出と定量化について詳しく説明します。提供される方法は、コーヒー豆からSCCAsの測定に焦点を当てているが、提供される方法は、複数の植物をベースとする食品材料に適用することができます。

このプロトコルは、正常緑色コーヒー種子のSCCA量の種子処理の影響を測定するために利用されています。この実験では、6の処置であった： ロイコノストック飽和微生物懸濁液は、歪みの増殖培地中GCP674（1）水にGCP674微生物の水性懸濁液（2）、酢酸および乳酸の水溶液（0.15と0.4 pseudomesenteroides MG /）は、それぞれML（3）使用済みのM1増殖培地処理（4）をdH 2 O水（5）、および未処理対照（種子に添加していない物質）（6）。処置を適用し、24時間発酵させました。 4つの独立した反復は、各治療のために評価しました。分析は、内部標準としてアジピン酸を用いてクエン（C）、リンゴ酸（M）、酢酸（A）および乳酸（L）酸レベルを行いました。 各SCCAと内部標準の場合、標準曲線はトンに及びます彼は、濃度の範囲は、生成されたコーヒーサンプル（5、10、20、40、60、...

この記事では、無料の帯状キャピラリー電気泳動を用いて植物材料からの有機酸の検出および定量するための方法を提示しています。コーヒー種子中の有機酸濃度の二次発酵の効果を決定するこの方法の潜在的なアプリケーションの例が提供されます。

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

本手順の全体的な目的は、植物組織に含まれる有機酸のレベルを定量化することです。この手法は、環境刺激が根の成長、作物の発達、および食品や飲料の品質に与える影響など、植物生化学および生理学における疑問を解決するために利用できます。本手法の主な利点は、サンプルの前処理が最小限で済むこと、ハイスループットであること、そしてキャピラリー電気泳動が質量分析法よりも費用対効果に優れていることです。この手法は植物の生理学的反応を解明するために用いられますが、有機酸が風味、安全性、および安定性に決定的な影響を与える食品科学や食品品質の分野にも適用可能です。まず、短鎖カルボン酸（SCCA）抽出用のサンプルを準備します。処理後に十分なサンプルが残るよう、コーヒー豆を一度に1gずつ用意してください。SCCAの抽出効率を最大限に高めるために均一な粒子径を得るには、まず乳鉢と乳棒を液体窒素で予冷します。乳鉢に少量の液体窒素を入れ、そこにサンプルを加えます。その後、レードルを用いて、サンプルが完全に浸るまで十分な量の液体窒素を乳鉢に加えます。生コーヒー豆などの研磨が困難な試料を液体窒素に加えます。研磨する前に10～30秒間凍結させます。垂直に押し潰す動作で、組織をより小さな断片に砕きます。次に、円を描くように摩砕して、組織の粉砕を完了させます。凍結と摩砕の手順をさらに2回繰り返し、サンプルを計3回粉砕します。通常、3回連続で粉砕を行うことで、サンプルは小麦粉のような質感の粉末になります。粉末をガラスバイアルまたは1.5 mlマイクロ遠心チューブに移します。粉砕後、直ちにダウンストリーム処理を開始するか、抽出の準備が整うまでサンプルを80 degrees Celsiusで保存します。目的のSCCAの認証標準物質を準備し、SCCA濃度の定量に使用する外標準溶液および内標準溶液を作成します。コーヒー試料の場合、分析対象酸としてクエン酸、リンゴ酸、酢酸、乳酸を含め、内標準としてアジピン酸を使用します。10 mLのメスフラスコに100 mgの標準物質を加え、10 mg/mLのストックソリューションを作成します。超純水を用いてメスフラスコの10 mL標線まで満たし、酸を溶解させます。各ストック溶液を、ポリテトラフルオロエチレンライナー付きキャップを備えた清潔な15 milliliterガラスチューブに移し、プラスチック製パラフィンフィルムで密封する。ストック溶液は、密封したチューブに入れ4 °Cで1週間保存できる。内部標準ストック溶液を超純水で0.05 mg/mLに希釈し、SCCA抽出溶液を50 mL調製する。内部標準物質ストック溶液 250 µL を 49.75 mL の水に加えることでこれを行います。次に、目的の SCCA の検量線用サンプルを調製します。サンプル中の予想 SCCA 濃度をカバーし、直線応答範囲内の濃度となる少なくとも 5 点以上のポイントを使用してください。超純水を用いて、各SCCAを決定した濃度まで希釈し、新しいマイクロ遠心チューブで全量を1 mLにします。各濃度ポイントに、4種類すべての酸標準物質と内部標準物質が正しい濃度で含まれていることを確認してください。抽出予定のサンプルを保存場所から取り出し、氷上に置きます。SCCA抽出用に、サンプルを100 milligrams量り取ります。ばらつきを抑えるため、可能な限り目標質量に近い量でサンプリングしてください。各サンプルの計量後、組織を清潔な1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。検出されるSCCAの量はサンプル質量を用いて規格化するため、測定した各サンプルの質量を記録しておきます。すべてのサンプルの計量後、各サンプルチューブに抽出液を1 mL加えます。すべての抽出において、組織質量に対する抽出液の比率を一定に保ってください。ボルテックスミキサーで10秒間十分に撹拌します。サンプルを室温で1時間静置してください。この1時間の間に、15分ごとに10秒間のボルテックス撹拌を各チューブに行います。1時間の抽出後、サンプルを最後にもう一度混合し、サンプルチューブをマイクロ遠心機に移します。固体物質を沈殿させるため、4 °C、10,000 ×g で10分間、サンプルを遠心分離します。サンプルをろ過するために、各フィルターがシリンジに正しく装着されていることを確認しながら、シリンジ装着型ディスクフィルターを準備します。標準曲線のサンプルを含め、分析するサンプルごとにディスクフィルターを装着したシリンジを1本ずつ用意します。上清を清潔なマイクロ遠心チューブに直接ろ過します。ろ過後、ろ液の入ったチューブを密閉し、シリンジフィルター装置を廃棄します。サンプルを各キャピラリー電気泳動（CE）バイアルに1 mLずつ移送します。この際、バイアルのネック部分にサンプルが飛散しないよう注意してください。サンプルの移送後、各バイアルにCEキャップを装着します。テキストプロトコルに従って、SCCA検出ランを設定してください。製造元の説明書に従い、標準曲線の各点を含むバイアルと、分析するサンプルを含むバイアルを試料導入トレイにセットします。オートサンプラーのプログラミングのため、各バイアルの位置を記録してください。テキストプロトコルに記載されたコンディショニング後、ソフトウェアのControlメニューを開き、Run Sequenceを選択してサンプルの分離を開始します。フォトダイオードアレイ（PDA）トレイをモニターし、適切な分離が行われているか確認します。最初のトレースを観察し、ベースラインが平坦であること、および個々の酸のピークが明確に分離していることを確認してください。サンプルピークを積分するには、最初のファイルを開き、自動積分ステップを設定して、分析開始後の最初の3分間を除外します。同じメニューで、ピーク選択基準を最小ピーク幅50ユニット、ピーク面積100ユニットに設定します。これにより適度に高い選択性が得られ、トレース内の背景ノイズから酸のピークを分離することができます。テキストプロトコルに従ってデータ解析を行ってください。ここでは、過負荷サンプルを強調したPDAトレースの比較を示しています。分析物の濃度が増加するにつれて、個々のピーク形状に非対称性が現れ始める場合があります。0.05 mg/mLのとき、酢酸は明確に定義された左右対称のピークを示します。酢酸の濃度が0.07または0.10 mg/mLに増加すると、ピークは非対称となり、ピークテールが形成されます。このピークのテーリングは、サンプルが過負荷であることを示す良好な指標となります。ここに、グリーンコーヒーサンプル中の有機酸を示すPDAトレースの例を提示します。グリーンコーヒーサンプルは、CEバイアルに充填する前に1:10に希釈しました。対象となる酸には、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、および内部標準物質であるアジピン酸が含まれます。この手順を行う際は、再現性を最大化し、実験誤差を最小限に抑えるために、サンプルを均一な一貫性を持つまで粉砕し、注意深くピペッティングすることが重要です。このビデオを視聴することで、キャピラリー電気泳動（CE）を用いて植物サンプルから有機酸を定量する方法について、十分な理解を得ることができます。また、植物サンプルの粉砕、有機酸の抽出、およびその後のCE分析のための植物抽出液の調製ができるようになります。

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化学

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