植物組織からの有機酸を定量化するためにキャピラリー電気泳動を使用した：テストケースを調べます

本手順の全体的な目的は、植物組織に含まれる有機酸のレベルを定量化することです。この手法は、環境刺激が根の成長、作物の発達、および食品や飲料の品質に与える影響など、植物生化学および生理学における疑問を解決するために利用できます。本手法の主な利点は、サンプルの前処理が最小限で済むこと、ハイスループットであること、そしてキャピラリー電気泳動が質量分析法よりも費用対効果に優れていることです。

この手法は植物の生理学的反応を解明するために用いられますが、有機酸が風味、安全性、および安定性に決定的な影響を与える食品科学や食品品質の分野にも適用可能です。まず、短鎖カルボン酸（SCCA）抽出用のサンプルを準備します。処理後に十分なサンプルが残るよう、コーヒー豆を一度に1gずつ用意してください。

SCCAの抽出効率を最大限に高めるために均一な粒子径を得るには、まず乳鉢と乳棒を液体窒素で予冷します。乳鉢に少量の液体窒素を入れ、そこにサンプルを加えます。その後、レードルを用いて、サンプルが完全に浸るまで十分な量の液体窒素を乳鉢に加えます。

生コーヒー豆などの研磨が困難な試料を液体窒素に加えます。研磨する前に10～30秒間凍結させます。垂直に押し潰す動作で、組織をより小さな断片に砕きます。

次に、円を描くように摩砕して、組織の粉砕を完了させます。凍結と摩砕の手順をさらに2回繰り返し、サンプルを計3回粉砕します。通常、3回連続で粉砕を行うことで、サンプルは小麦粉のような質感の粉末になります。

粉末をガラスバイアルまたは1.5 mlマイクロ遠心チューブに移します。粉砕後、直ちにダウンストリーム処理を開始するか、抽出の準備が整うまでサンプルを80 degrees Celsiusで保存します。目的のSCCAの認証標準物質を準備し、SCCA濃度の定量に使用する外標準溶液および内標準溶液を作成します。

コーヒー試料の場合、分析対象酸としてクエン酸、リンゴ酸、酢酸、乳酸を含め、内標準としてアジピン酸を使用します。10 mLのメスフラスコに100 mgの標準物質を加え、10 mg/mLのストックソリューションを作成します。超純水を用いてメスフラスコの10 mL標線まで満たし、酸を溶解させます。

各ストック溶液を、ポリテトラフルオロエチレンライナー付きキャップを備えた清潔な15 milliliterガラスチューブに移し、プラスチック製パラフィンフィルムで密封する。ストック溶液は、密封したチューブに入れ4 °Cで1週間保存できる。内部標準ストック溶液を超純水で0.05 mg/mLに希釈し、SCCA抽出溶液を50 mL調製する。

内部標準物質ストック溶液 250 µL を 49.75 mL の水に加えることでこれを行います。次に、目的の SCCA の検量線用サンプルを調製します。サンプル中の予想 SCCA 濃度をカバーし、直線応答範囲内の濃度となる少なくとも 5 点以上のポイントを使用してください。

超純水を用いて、各SCCAを決定した濃度まで希釈し、新しいマイクロ遠心チューブで全量を1 mLにします。各濃度ポイントに、4種類すべての酸標準物質と内部標準物質が正しい濃度で含まれていることを確認してください。抽出予定のサンプルを保存場所から取り出し、氷上に置きます。

SCCA抽出用に、サンプルを100 milligrams量り取ります。ばらつきを抑えるため、可能な限り目標質量に近い量でサンプリングしてください。各サンプルの計量後、組織を清潔な1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。

検出されるSCCAの量はサンプル質量を用いて規格化するため、測定した各サンプルの質量を記録しておきます。すべてのサンプルの計量後、各サンプルチューブに抽出液を1 mL加えます。すべての抽出において、組織質量に対する抽出液の比率を一定に保ってください。

ボルテックスミキサーで10秒間十分に撹拌します。サンプルを室温で1時間静置してください。この1時間の間に、15分ごとに10秒間のボルテックス撹拌を各チューブに行います。

1時間の抽出後、サンプルを最後にもう一度混合し、サンプルチューブをマイクロ遠心機に移します。固体物質を沈殿させるため、4 °C、10,000 ×g で10分間、サンプルを遠心分離します。サンプルをろ過するために、各フィルターがシリンジに正しく装着されていることを確認しながら、シリンジ装着型ディスクフィルターを準備します。

標準曲線のサンプルを含め、分析するサンプルごとにディスクフィルターを装着したシリンジを1本ずつ用意します。上清を清潔なマイクロ遠心チューブに直接ろ過します。ろ過後、ろ液の入ったチューブを密閉し、シリンジフィルター装置を廃棄します。

サンプルを各キャピラリー電気泳動（CE）バイアルに1 mLずつ移送します。この際、バイアルのネック部分にサンプルが飛散しないよう注意してください。サンプルの移送後、各バイアルにCEキャップを装着します。テキストプロトコルに従って、SCCA検出ランを設定してください。

製造元の説明書に従い、標準曲線の各点を含むバイアルと、分析するサンプルを含むバイアルを試料導入トレイにセットします。オートサンプラーのプログラミングのため、各バイアルの位置を記録してください。テキストプロトコルに記載されたコンディショニング後、ソフトウェアのControlメニューを開き、Run Sequenceを選択してサンプルの分離を開始します。

フォトダイオードアレイ（PDA）トレイをモニターし、適切な分離が行われているか確認します。最初のトレースを観察し、ベースラインが平坦であること、および個々の酸のピークが明確に分離していることを確認してください。サンプルピークを積分するには、最初のファイルを開き、自動積分ステップを設定して、分析開始後の最初の3分間を除外します。

同じメニューで、ピーク選択基準を最小ピーク幅50ユニット、ピーク面積100ユニットに設定します。これにより適度に高い選択性が得られ、トレース内の背景ノイズから酸のピークを分離することができます。テキストプロトコルに従ってデータ解析を行ってください。ここでは、過負荷サンプルを強調したPDAトレースの比較を示しています。

分析物の濃度が増加するにつれて、個々のピーク形状に非対称性が現れ始める場合があります。0.05 mg/mLのとき、酢酸は明確に定義された左右対称のピークを示します。酢酸の濃度が0.07または0.10 mg/mLに増加すると、ピークは非対称となり、ピークテールが形成されます。

このピークのテーリングは、サンプルが過負荷であることを示す良好な指標となります。ここに、グリーンコーヒーサンプル中の有機酸を示すPDAトレースの例を提示します。グリーンコーヒーサンプルは、CEバイアルに充填する前に1:10に希釈しました。

対象となる酸には、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、および内部標準物質であるアジピン酸が含まれます。この手順を行う際は、再現性を最大化し、実験誤差を最小限に抑えるために、サンプルを均一な一貫性を持つまで粉砕し、注意深くピペッティングすることが重要です。このビデオを視聴することで、キャピラリー電気泳動（CE）を用いて植物サンプルから有機酸を定量する方法について、十分な理解を得ることができます。また、植物サンプルの粉砕、有機酸の抽出、およびその後のCE分析のための植物抽出液の調製ができるようになります。