植物組織からの有機酸を定量化するためにキャピラリー電気泳動を使用した：テストケースを調べますコーヒーノキアラビカ種子

この記事では、無料の帯状キャピラリー電気泳動を用いて植物材料からの有機酸の検出および定量するための方法を提示しています。コーヒー種子中の有機酸濃度の二次発酵の効果を決定するこの方法の潜在的なアプリケーションの例が提供されます。

この手順の全体的な目標は、植物組織中に存在する有機酸のレベルを定量化することです。この方法は、根の成長、作物の発育、食品や飲料の品質に対する環境刺激の影響など、植物の生化学や生理学の質問に答えるために使用できます。この方法の主な利点は、サンプル調製が最小限であること、この方法がハイスループットであること、およびキャピラリー電気泳動が質量分析よりも費用対効果が高いことです。

この方法は植物の生理学的応答を解明するために使用されますが、有機酸が風味、安全性、安定性に重大な影響を与える食品科学や食品の品質にも適用できます。まず、短鎖カルボン酸(SCCA)抽出用のサンプルを組み立てます。一度に1グラムのコーヒーシードを準備して、十分なサンプルが処理後に残るようにします。

SCCA抽出効率を最大化するために均一な粒子サイズを達成するには、まず乳鉢と乳棒を液体窒素で予冷します。モルタル内の少量の液体窒素にサンプルを追加します。取鍋を使用して、サンプルを完全に沈めるのに十分な液体窒素をモルタルに加えます。

生のコーヒーの種などの挽きにくいサンプルを液体窒素に加えます。粉砕する前に、10〜30秒間凍結させます。垂直方向の粉砕動作を使用して、組織を小さな断片に分解します。

次に、円を描く研削動作を使用して組織研削を完了します。凍結と粉砕のステップをさらに2回繰り返して、サンプルが合計3回粉砕されるようにします。通常、3回連続して粉砕すると、サンプルは小麦粉のような粘稠度の粉末に減少します。

粉末をガラスバイアルまたは1.5mlのマイクロ遠心チューブに移します。粉砕後すぐに下流処理を開始するか、サンプルの抽出準備が整うまでサンプルを摂氏80度で保存します。関心のあるSCCAの真正な標準を組み立てて、SCCA濃度の測定に使用する外部および内部の標準溶液を作成します。

コーヒーサンプルの場合、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、乳酸を対象酸として、アジピン酸を内部標準として含めます。10ミリリットルのメスフラスコに100ミリグラムの標準物質を加えて、10ミリグラム/ミリリットルのストック溶液を作成します。10ミリリットルラインまでメスフラスコを超純水で満たし、酸を溶かします。

各ストック溶液をポリテトラフルオロエチレンで裏打ちされたキャップ付きのきれいな15ミリリットルガラス管に移し、プラスチックパラフィンフィルムで密封します。ストック溶液は、4°Cの密閉チューブに1週間保存できます。内部標準原液を超純水で0.05ミリグラム/ミリリットルに希釈し、SCCA抽出液50ミリリットルを調製します。

これを行うには、250 マイクロリットルの内部標準ストック溶液を 49.75 ミリリットルの水に加えます。次に、目的のSCCAの標準曲線サンプルを調製します。サンプル中の予想されるSCCA濃度にまたがる線形応答範囲の濃度を持つ少なくとも5つのポイントを使用します。

新しいマイクロ遠心チューブで、超純水を使用して各SCCAを決定された濃度に希釈し、1ミリリットルの容量にします。各濃度ポイントに 4 つの酸標準物質と内部標準物質がすべて正しい濃度で含まれていることを確認します。抽出するサンプルを保管場所から取り出し、氷の上に置きます。

SCCA抽出のために100ミリグラムのサンプルを秤量します。ばらつきを減らすために、サンプルの量をできるだけ目標質量に近づけて測定します。各サンプルを秤量した後、組織を清潔な1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。

検出されたSCCAの量はサンプル質量を使用して正規化されるため、測定された各サンプルの質量を追跡します。すべてのサンプルを秤量した後、各サンプルチューブに1ミリリットルの厳密溶液を追加します。抽出液と組織質量の比率は、すべての抽出で同じに保ちます。

10秒間ボルテックスしてよく混ぜます。サンプルを室温で1時間放置します。この時間の間に、10秒間ボルテックスして、各チューブを15分ごとに混合します。

抽出から1時間後、最後にもう一度サンプルを混合し、サンプルチューブをマイクロ遠心分離機に移します。サンプルを摂氏 4 度、 10 、 000 倍 G で 10 分間遠心分離し、固体材料を沈殿させます。サンプルをろ過するには、シリンジに取り付けられたディスクフィルターを準備し、各フィルターがシリンジに正しく取り付けられていることを確認します。

ディスクフィルター付きのシリンジを、標準曲線サンプルを含む分析対象サンプルごとに1本用意します。上清を直接ろ過して、きれいなマイクロ遠心チューブに入れます。ろ過後、濾液の入ったチューブを閉じ、シリンジフィルター装置を廃棄します。

1ミリリットルのサンプルを各キャピラリー電気泳動(CEバイアル)に移し、サンプルがバイアルのネックに飛び散らないように注意します。サンプルを移した後、各バイアルにCEキャップを取り付けます。テキストプロトコルの説明に従って、SCCA 検出実行を設定します。

標準曲線ポイントを含むバイアルとアッセイするサンプルを含むバイアルを、製造元の指示に従ってインレットサンプルトレイにロードします。オートサンプラープログラミングのための各バイアルの位置に注意してください。テキストプロトコルで説明されているようにコンディショニングを行った後、ソフトウェアのControlメニューを開き、Run Sequenceを選択してサンプル分離を開始します。

フォトダイオードアレイまたはPDAトレイを監視して、適切な分離を確認します。最初のトレースを観察し、ベースラインが平坦であることを確認し、個々の酸ピークをクリーンに分離します。サンプルピークを波形解析するには、最初のファイルを開き、自動波形解析ステップを設定して、分析の最初の 3 分間を除外します。

同じメニューで、ピーク選択基準を最小ピーク幅 50 単位、ピーク面積 100 単位に設定して、適度に高い選択性を実現し、トレース内のバックグラウンドノイズから酸ピークを分離します。テキストプロトコルで説明されているようにデータ分析を実行します。ここに示されているのは、オーバーロードされたサンプルを強調表示するPDAトレースの比較です。

分析種の濃度が上昇すると、個々のピーク形状が非対称になり始めることがあります。0.05ミリグラム/ミリリットルの酢酸は、明確に定義された左右対称のピークを示します。酢酸の濃度が0.07ミリグラム/ミリグラム/ミリリットルまたは0.10ミリグラムに増加すると、ピークは非対称になり、ピークテールが形成されます。

このピークテーリングは、サンプルが過負荷になっていることを示す良い指標です。ここに示されているのは、グリーンコーヒーサンプル中の有機酸を示すPDAトレースの例です。グリーンコーヒーのサンプルは、CEバイアルにロードする前に1:10に希釈しました。

対象酸には、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、および内部標準であるアジピン酸が含まれます。この手順を試行する際には、サンプルを均一な濃度に粉砕し、サンプルを慎重にピペットで動かして、再現性を最大化し、実験エラーを最小限に抑えることを忘れないでください。このビデオを見れば、キャピラリー電気泳動(CE)を使用して植物サンプルから有機酸を定量する方法を十分に理解できるはずです。植物サンプルの粉砕、有機酸の抽出、および下流のCE分析のための植物抽出物の調製ができる必要があります。