研究のための方法論 B。枯草菌バイオフィルム

細菌のバイオフィルムは人間の健康にとって重要であり、環境破壊や抗菌剤から細菌の居住者を保護します。この手順の目標は、バイオフィルム形成に対する低分子阻害剤の影響を評価するためのモデルシステムを開発することでした。これらの方法は、バイオフィルム形成を特異的に標的とする低分子阻害剤を選択するために、バイオフィルム分野に不可欠なツールセットを確立するのに役立ちます。

これらの方法論の主な利点は、一貫性のある堅牢な実験フレームワークから出発し、バイオフィルム特異的阻害剤の作用機序について定量的および定性的な洞察が得られることです。これらの方法は、枯草菌のバイオフィルムに関する洞察を得ることができますが、緑膿菌や植物病原体であるXanthomonas citriなどの他のバイオフィルム形成細菌にも適用できます。走査型電子顕微鏡は、細胞外マトリックスの観察を可能にし、単一細胞の分解能が得られるため、バイオフィルム形成に対する低分子の影響を分析するために不可欠です。

まず、適切な単一コロニーを選択し、それを3ミリリットルのLBブロスに移します。このスターター培養物を摂氏37度で4時間振とうするインキュベーターに入れます。インキュベーション後、1.5ミリリットルのスターター培養物を取り、4分間遠心分離します。

上清を慎重に取り除き、ペレットを1.5ミリリットルのMSgg培地に再懸濁します。ペリクルを成長させるには、各ウェルに3ミリリットルのMSggを加えて12ウェルの細胞培養プレートを調製します。これらのウェルの一部に、低分子阻害剤を含むMSggを濃度範囲内に添加し、ディッシュの周囲に異なる濃度の位置を分散させることで、エッジ効果を回避します。

再懸濁したスターター培養物の600ナノメートルでの光学密度を測定します。カルチャは 0.6 から 1 の間である必要があります。これは、システムの堅牢性にとって重要です。

培養プレートの各ウェルに、再懸濁したスターター培養物3マイクロリットルを無種にします。次に、プレートを23°Cで静的条件下で3日間インキュベートします。その後、インキュベーターからプレートを取り出し、ペリクルを観察します。

バイオフィルムを成長させるには、テンプレートを使用し、8.5 cmの乾燥1.5%寒天MSggプレート上に、1.5 μLの未洗浄スターター培養液を4滴ずつ左右対称にスポットします。プレートを移動する前に、液滴が媒体に吸収されるようにします。プレートを摂氏30度で3日間インキュベートします。

照明を均一に照射した双眼鏡を使用して、バイオフィルムのコロニーが発達し、立体的なしわのある構造を形成していることを確認します。まず、きれいなカミソリの刃を取り、テンプレートの助けを借りてバイオフィルムコロニーを2等分します。きれいなヘラでコロニーの半分を慎重に持ち上げ、500マイクロリットルのPBSを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。

コロニーの後半を取り、500マイクロリットルの50%エタノールを含むマイクロ遠心チューブに移します。これらは、滅菌剤に対する耐性を評価するために使用されます。その後、同様にD-リジン処理コロニーの前半を取り出し、PBSに入れます。

次に、このコロニーの後半を取り、エタノールに移します。バイオフィルムハーフを含むすべてのチューブを室温で10分間インキュベートします。そして、それらを18, 000倍gで5分間遠心分離します。

ピペットを使用して、上清を慎重に取り除きます。300マイクロリットルのPBSを加え、次にマイクロチップ超音波処理器を使用して、低い設定で細胞を超音波処理します。さらに700マイクロリットルのPBSを追加して、最終容量を1ミリリットルにします。

次に、PBSで10から負の7までの段階希釈を行います。希釈液の1つを100マイクロリットル取り、1.5%寒天LBプレートに接種します。サンプルごとに他の2つの希釈について、この手順を繰り返します。

ガラスビーズを使用してイノキュラムを広げ、プレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。プレートを検査し、コロニー形成単位(CFU)をカウントします。ミリリットルあたりのCFU値を計算した後、PBS処理とエタノール処理の生存者の割合を計算します。

サンプルの固定を開始するには、まず、必要な数のバイオフィルムコロニーに対して十分な新鮮な固定液を調製します。各ペトリ皿に5ミリリットルの固定剤を慎重に加え、コロニーに直接ピペッティングすることは避けてください。コロニーは寒天から分離し始め、浮遊します。

プレートをパラフィルムで慎重に密封し、ロータリーシェーカーで室温で2時間インキュベートします。プレートを摂氏4度の保管に一晩移します。真空に接続されたパスツールピペットで固定液を静かに取り出します。

10ミリリットルの100ナノモルカコジル酸ナトリウム、5ミリモルの塩化カルシウム緩衝液を加えてバイオフィルムを洗浄し、5分間インキュベートします。バイオフィルムコロニーの中心を寒天プレートからパスツールピペットで慎重に取り外します。コロニーを風乾するには、セルロース濾紙を四分の一に切り、次に1つのセクションを100%エタノールに浸します。

1つの浮遊バイオフィルムコロニーを紙に慎重に移します。乾いた濾紙で裏打ちされたペトリ皿に紙を置きます。次に、皿に蓋をし、化学フードに入れて一晩乾かします。

バイオフィルムコロニーの形態を維持するためには、浮遊バイオフィルムをセルロース紙で完全に下敷きすることが重要です。一度紙に付着したバイオフィルムは再調整できません。電子顕微鏡スタブにカーボンテープをコーティングし、ピンセットを使用してバイオフィルムコロニーをスタブに慎重に移します。

各コロニーをスタブに接続した後、カーボンテープの細いブリッジを追加して、スタブをデシケーターに24時間または必要になるまで保管します。この段階ではバイオフィルムは非常に壊れやすく、簡単に破砕されるため、このステップには安定した正確な手が必要です。課題は、バイオフィルムのかなりの部分を亀裂なくマウントすることです。

検査当日は、コロニーを金-パラジウムスパッタコーターに入れます。サンプルを60度の角度で2分間コーティングします。この手順を 2 回繰り返し、その間にサンプルを 120 度回転させます。

最後に、サンプルを上から3分間1回コーティングします。これで、サンプルをSEMでイメージングする準備が整いました。これらの画像は、バイオフィルム誘導MSgg培地で成長したB.subtilisのペリカル形成を示しています。

低分子阻害剤D-リジンを添加すると、ペリクルの発生が減少します。そして、阻害剤の濃度が増加するにつれて、ペリクル形成は相関する減少を示します。このグラフは、エタノールへの曝露がバイオフィルムコロニー内の細胞の生存に及ぼす影響、D-リジン阻害剤で処理された細胞、または未処理のまま放置された細胞の影響を示しています。

D-リジンで処理し、50%エタノールに10分間曝露したコロニーは、未処理の画分と比較して生存率の劇的な減少を示した。トップダウンの両眼画像は、D-リジンの存在下で成長したコロニーは、未処理のコロニーよりも全体的に小さく、しわが目立たないことを示しています。臨界点乾燥バイオフィルムコロニーの走査型電子顕微鏡画像は、変化したバイオフィルムの発達をさらに明らかにします。

細胞外高分子物質マトリックス(EPS)は、未処理のサンプルではクモの巣のように見え、処理されたサンプルは組織化が不十分でした。最後に、個々の細菌細胞の分解能で調べると、処理された細胞は外観が細長く、EPSで覆われておらず、未処理の細胞ほど隣接する細胞と密接に結合していないことが示されています。この手順を試行する際、バイオフィルム阻害剤を研究するための一貫したフレームワークを設定することが、再現性のある結果を得るために不可欠であることを覚えておくことが重要です。

バイオフィルム阻害のための低分子スクリーニングは、一度習得すれば、適切に実施されれば1週間未満で行うことができます。この手順に続いて、単一バイオフィルム細胞における遺伝子発現の調査などの他の方法を実施して、低分子阻害剤の標的に関するさらなる洞察を得ることができます。このビデオを見れば、特定のバイオフィルム阻害剤がバイオフィルムの発生と抗生物質耐性に及ぼす全体的な影響を分析する方法について、十分に理解できるはずです。