Name: リパーゼ及びホスホリパーゼ候補者のための基質特異性を定義します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぼう リパーゼとホスホリパーゼの基質特異性を定義する計算的手法。細菌抽出物を用いて酵素活性を最適化し、生理的基質を同定する方法です。脂質代謝と膜リモデリングの研究に応用可能です。

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この作品は、（InvestigaciónエンFronterasのデ・ラ・CienciaでInvestigaciónCientíficaBASICAで82614、153998、253549、および178359だけでなく、118）とDirección一般デからConsejoナショナルデCienciasのyTecnología・メキシコ（CONACyT-メキシコ）からの助成金によってサポートされていましたAsuntosデパーソナルAcadémico-ナショナル大学自治・デ・メヒコ（DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616、IN203612）。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

過去20年間、多くの生物のゲノムが配列決定されており、ゲノム配列データの富が生成されているが、機能的な解釈が遅れ、したがって、ゲノム機能の理解を妨げています。ゲノム中の遺伝子の機能は、多くの場合、既知の機能または保存されたモチーフの発生の遺伝子との類似性に基づいて割り当てられます。しかし、所定の遺伝子の正確な機能はしばしば知られていません。特に、酵素の構造遺伝子は、簡単にほとんどの酵素は二枚の基板と2製品が関与する複雑な反応を触媒するという事実によるOMIC技術によって探索することができないと予測。現在、少なくとも1つの基板が固定されており、ここで、他方は変えることができる酵素のグループのための基質特異性を探索することがより可能と思われます。例えば、真核生物でのタンパク質の中で最もリン酸化モチーフが知られており、キナーゼのコンセンサスペプチドは、ペプチドARを生成するために、固体支持体上にスポットされています光線。このようなアレイおよび放射性標識ATP、基質特異性及び生物の異なるキナーゼの活性レベルを使用することキノームプロファイルの確立を可能にし、基質特異性24を画定決定することができます。加水分解酵素は、のため...

このようなトリアシルグリセロールおよび（グリセロ）リン脂質のグリセロールベースの脂質は、重要な、おそらく最もよく知られている脂質クラス1を構成しています。トリアシルグリセロール（タグは）したがって、ポテンシャルエネルギーや炭素源として油脂、通常、貯蔵脂質として機能する、としています。タグは、頻繁に外部タグを消化し、炭素源としてそれらを使用できるようにするために産生する生物によって分泌されるリパーゼによって分解することができます。また、リパーゼは広く、それらの重要なバイオテクノロジー用途2に長年にわたって研究されてきました。 それらの両親媒性の性質とその近円筒形状、（グリセロ）リン脂質を呈する膜形成特性と、通常二層膜3の主要な脂質成分を構成します。このような細菌、大腸菌 、3つだけの主要な頭部基変種、ホスファチジルグリセロール（PG）、カルジオリピン（CL）、およびphosphatidのような単純な微生物では、一つは、それらの一つ一つがかなりのSNで異なる脂肪酸アシル鎖の数-1またはSNで置換することができることに注意する必要がありますが、ylethanolamine（PE）は、検出された-2位置が異なる分子種4の多数を生じさせます。他の細菌は、他のリン脂質に加えて、またはその代わりを持っている可能性があります。例えば、マメ科植物アルファルファ（ アルファルファ ）と窒素固定根粒共生を形成することが可能であるシノリゾビウム・メリロティ 、土壌細菌は、第二の両性イオン性リン脂質をPEに加えて含んで、ホスファチジルコリン（PC）5。また、リンまたはグリセロールを含まない脂質は両親媒性であると細胞膜の一部を形成するかもしれません。例えば、リン制限増殖条件時、S.でメリロティは 、（グリセロ）リン脂質は、主としてリンを含まない膜脂質、 すなわち、スルホ脂質、オルニチン脂質、およびdiacylglyceryl trimethylhoによって置き換えられていますmoserine（DGTS）6。細菌では、DGTSは2段階経路7にジアシルグリセロール（DAG）から形成されたが、DAGの生成のためのソースが明確ではなかったされています。パルスチェイス実験は、PCは、我々はリン制限条件下で形成され、DAGとホスホコリンにPCを変換できるC（PLCP、SMc00171）ホスホリパーゼを識別することができDGTS 8の前駆体であることと、この原稿に記載の方法を用いて、可能性を示唆しました8。 別の研究では、我々はそのアシルCoAシンテターゼ（FADD）Sの欠損変異体を発見しました成長9の定常期に入るとき根粒かの大腸菌は、遊離脂肪酸を蓄積しました。これらの脂肪酸は、膜脂質に由来すると思われたが、遊離脂肪酸またはそれらの遊離酵素（群）の正確な供給源が知られていませんでした。ここでも、（、2パタチンのような10（ホスホ）リパーゼを、この原稿で概説した戦略を採用S.中の遊離脂肪酸の形成に寄与しSMc00930とSMc01003） 根粒 11は、予測されました。驚くべきことに、SMc01003は、モノアシルグリセロール、最終的にはグリセロールと遊離脂肪酸11に変換する基板としてDAGを使用しました。したがって、SMc01003はDAGリパーゼ（DGLA）です。 アルゴリズムの数を潜在的（リン）を予測するために存在するが12,13は 、リパーゼ、それらの正確な機能と生理的役割は、通常知られていません。ここでは、クローンを作成する、プロトコルの概要を説明し、予測又は電位（ホスホ）リパーゼを過剰発現します。この原稿は、酵素アッセイを開発し、人工的な発色基質を使用することにより過剰発現（ホスホ）リパーゼのために最適化する方法について説明します。私たちは、最適化された酵素アッセイで、実際の（ホスホ）リパーゼ基質に遭遇することができ、どのようにこれらの知見は、微生物生理学の我々の理解を豊かにする方法の例を提供します。

<table><tbody><tr><td>クロロホルム</td><td>JT ベイカー</td><td>9180-03</td><td>TLC 分析 &脂質抽出</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>JT Baker</td><td>9070-03</td><td>TLC 分析 &脂質抽出</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>JTベイ</td><td>カー9507-05</td><td>TLC分析&脂質抽出</td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>JT Baker</td><td>9309-02</td><td>TLC 分析 &脂質抽出</td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>Sigma</td><td>32203</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>二蒸留水</td><td>&nbsp;ANY</td><td>&nbsp;NA</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>シグマ</td><td>T-1503</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Baker</td><td>9535-02</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker</td><td>3624-01</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ</td><td>X-100</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>LBブロス</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>細菌増殖、10 g トリプトン + 5 g 酵母抽出物 + 10 g NaCl あたり二蒸留水</td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>のリットル ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー</td><td>211705</td><td>細菌増殖</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー</td><td>212750</td><td>細菌増殖</td></tr><tr><td>TYブロス</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>細菌増殖、8 gトリプトン+ 3 g酵母抽出物+ 66 mg CaCl2&#183;二蒸留水CaCl<sub<<></td></tr><tr><td>>2>&#183;2H2O</td><td>Baker</td><td>1332-01</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>イソプロピル-β;-D-チオガラクトシド (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td>細菌増殖</td></tr><tr><td>ジエタノールアミン</td><td>Σ</td><td>D-8885</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>ホスホリパーゼ A2 snake毒</td><td>Sigma</td><td>P0790</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>ホスホリパーゼ C Clostridium perfringens</td><td>Sigma</td><td>P7633</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>Bis-p-ニトロフェニルリン酸</td><td>Sigma</td><td>07422AH</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>p-ニトロフェニルステアリン酸</td><td>Sigma</td><td>N3627</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>p-ニトロフェニルドデカン酸</td><td>Sigma</td><td>61716</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>p-ニトロフェニルデカン酸</td><td>Sigma</td><td>N0252</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>p-パルミチン酸ニトロフェニル</td><td>Sigma</td><td>N2752</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>p-ニトロフェニル酪酸</td><td>Sigma</td><td>N9876</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>p-ニトロフェニルオクタン酸</td><td>シグマ</td><td>21742</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>酢酸、ナトリウム塩 [1-14C]</td><td>パーキンエルマー</td><td>NEC084</td><td>細菌増殖</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>JT Baker</td><td>9224-01</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>アルミニウム HPTLC シリカゲル 60 プレート。シリカゲルHPTLCプレートサイズ20 x 20 cm、25枚。</td><td>メルク</td><td>105547</td><td>TLC分析&脂質抽出</td></tr><tr><td>分光計 UV/VIS ラムダ 35</td><td>パーキンエルマーNA</td><td></td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>ストーム 820 リン光イメージャー</td><td>分子動力学</td><td>NA</td><td>光刺激性ルミネッセンススキャナー&nbsp;</td></tr><tr><td>多目的シンチレーションカウンター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>NA</td><td>放射能定量化</td></tr><tr><td>フランス圧力セル</td><td>ThermoSpectronic</td><td>NA&nbsp;</td><td>セルの破損</td></tr><tr><td>クロマトグラフィー論文 3MM Chr</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>TLC analysis</td></tr><tr><td>Sinorhizobium meliloti 1021our</td><td>reference 11</td><td></td><td>研究 strain</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS コンピテントセル</td><td>Novagen</td><td>69451</td><td>タンパク質発現株</td></tr><tr><td>pET9a ベクター</td><td>Novagen</td><td>69431</td><td>タンパク質発現ベクター</td></tr><tr><td>pET17b ベクター</td><td>Novagen</td><td>69663</td><td>タンパク質発現ベクター</td></tr><tr><td>滅菌ポリスチレン丸底チューブ (14 ml) Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>352057</td><td>細菌培養物</td></tr>ポリプロピレン<tr><td>微量遠心チューブ (1.5 ml)</td> <td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td>酵素アッセイ</td></tr><tr><td>1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロール</td><td>Sigma</td><td>D9135</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>L-&α;-ホスファチジルコリン、ジパルミトイル</td><td></td><td>ΣP6267</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>DL-&α;-モノパルミチン</td><td></td><td>Σ M1640</td><td>脂質標準</td></tr><tr><td>パルミチン酸</td><td>ΣP0500</td><td>脂質標準</td><td></td></tr></tbody></table>

リパーゼ及びホスホリパーゼ候補者のための基質特異性を定義します

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

微生物は、生物のための外部の基板を利用できるようにするために分泌される（ホスホ）リパーゼの広いスペクトルを生成します。代替的に、他の（ホスホ）リパーゼは、物理的に産生する生物は、内因性の脂質の代謝回転を引き起こし、しばしば細胞膜のリモデリングを生じると関連付けることができます。電位（ホスホ）リパーゼは、遺伝子/タンパク質配列が利用可能である多くのアルゴリズムを用いて予測することができますが、酵素活性、基質特異性、および潜在的な生理機能の実験的証明は頻繁に得られていません。本稿では、未知の基質特異性とどのようにそれぞれの（ホスホ）リパーゼの天然基質の検索でこれらの最適化された条件を採用することで将来の（ホスホ）リパーゼのためのアッセイ条件の最適化について説明します。このようなp個の -nitrophenyl誘導体のような人工的な発色基質を、使用して、マイナーを検出するのを助けることができます標準的な条件下での予測（ホスホ）リパーゼのための酵素活性。このようなマイナーな酵素活性を検出しましたが、酵素アッセイの異なるパラメータは、人工基質のより効率的な加水分解を得るために変えることができます。酵素がうまく機能する条件を決定した後、潜在自然種々の基材は、その分解、明確なクロマトグラフィー法を用いて追跡することができるプロセスについてアッセイされるべきです。新しい酵素の基質特異性の定義は、頻繁にして実験的に試験することができ、これらの酵素の潜在的な生理的役割のための仮説を提供します。これらのガイドラインに続いて、我々は成長のリン制限条件に菌シノリゾビウム・メリロッティ内膜のリモデリングのための重要なステップで、ホスホコリンおよびジアシルグリセロールするホスファチジルコリンを分解するホスホリパーゼC（SMc00171）を識別することができました。 2についてpatatin-を予測同じ生物のホスホリパーゼ（SMc00930とSMc01003）のように、我々はそれらの基質特異性を再定義し、SMc01003は、ジアシルグリセロールリパーゼであることを明らかにすることができました。

ビス のp -nitrophenylリン酸 とPC固有ホスホリパーゼC SMc00171の活動 E.から得られた無細胞抽出物大腸菌 BL21（DE3）をsmc00171が発現していたpLysSをし、xは、 形成されたp -NPを測定し、分光光度酵素アッセイを用いて、ビスのp -nitrophenylリン酸エステルを加水分解する能力について調べました。いいえ加水分解活性は、Eから得られた無細胞抽出物中に存在しませんでしたp個の -nitrophenylリン酸を基質として使用したビス-時（データは示していない） 大腸菌 BL...

多くの予測された(リン酸化)リパーゼは、その基質特異性と生理学的機能に関して十分に特徴付けられていません。ここでは、酵素活性を最適化し、天然基質を探索し、これらの酵素の生理学的機能を提案するためのプロトコルを提供します。

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

この手順の全般的な目的は、潜在的なリパーゼおよびホスホリパーゼに対する生理学的基質の検出を加速させることです。この方法は、ホスホリパーゼが生物学的膜における脂質リモデリングにどのように寄与するかなど、昆虫学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、酵素活性の最適化と、その酵素に対する天然基質の探索を独立して行えることです。本手法により、細菌性リパーゼおよびホスホリパーゼの基質特異性に関する知見を得ることができますが、他のあらゆるモデル生物のヒドロラーゼを研究するために改良することも可能です。我々が本手法を考案したきっかけは、Rhizobium melilotiにおいて固有の膜脂質であるホスファチジルコリンを分解できる酵素活性を探索していたことでした。無細胞タンパク質抽出液を調製するには、細菌細胞懸濁液を解凍し、氷上で保存してください。次に、細胞懸濁液を20,000 pounds per square inchの冷圧細胞破砕機に3回通します。4 °Cで5,000 ×gにて30分間遠心分離し、未破砕細胞および細胞残渣を除去します。遠心分離後、上清から後続の分析用に100 µLおよび500 µLの分注液を調製します。テキストプロトコルに記載されたピペッティングスキームに従い、あらかじめ最適化した酵素アッセイを準備します。さまざまな酵素活性を初期的に網羅するため、加水分解によって有色生成物を生成するパラニトロフェノールまたはPNP誘導体などの人工基質を使用してください。30 °Cに設定した分光光度計を用い、PNPの生成による405 nmにおける吸光度の増加を5分間にわたって追跡します。最後に、テキストプロトコルに従って計算を行います。脂質の放射性標識を行うには、目的の生物を5 mLの適切な培養培地で一晩前培養し、30 °Cで育成します。前培養液から、100 mmの培養フラスコに入れた20 mLの新鮮な培地に接種し、培養液の620 nmにおける初期光学的密度を0.3にします。次に、無菌条件下で、培養液の1 mL分注液を14 mLの滅菌済みポリスチレン製ラウンドボトムチューブに移します。1 mLの培養液に1 µCiの14 C acetateを添加します。その後、液状培養物を30 °Cで24時間、振とうしながらインキュベートします。培養期間の終了後、培養物を1.5 mLマイクロ遠心管に移し、室温で12,000 ×gにて5分間遠心分離します。ペレットを100 µLの水で再懸濁してください。この時点で、細胞懸濁液を-20 °Cで保存するか、直ちに極性脂質の抽出に進みます。極性脂質を抽出するには、100 µLの水性細胞懸濁液に、メタノールとクロロホルムを2:1の割合で混合した溶液を375 µL加えます。サンプルを30秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。インキュベート後、室温で12,000 ×gにて5分間遠心分離します。次に、上清を新しい1.5 milliliterのマイクロ遠心チューブに移します。続いて、上清に125 microlitersのクロロフォームと125 microlitersの水を加えます。30秒間ボルテックスした後、室温で12,000 ×gで1分間、サンプルを遠心分離します。下層のクロロホルム相を新しいチューブに移します。次に、窒素ガスを流して溶液を乾燥させます。乾燥させた脂質を100 µLのクロロホルム・メタノール溶液に溶解させます。薄層クロマトグラフィーによる中性極性脂質の分離を行うには、高性能薄層クロマトグラフィー用シリカゲル・アルミニウムプレートの端から2 cm離れた位置から開始し、脂質サンプルを3 µLずつスポットします。一次元クロマトグラフィーで複数のサンプルを分析する場合、各サンプルのスポット間には少なくとも1.5 cmの間隔を空けてください。移動相を、内部にクロマトグラフィー用ろ紙を貼付したTLC展開槽に移します。ガラスプレートで蓋をし、チャンバー内を30分間飽和させます。脂質試料を乾燥させたHPTLC Silica Gelアルミニウムプレートをチャンバーに移します。密閉したチャンバー内で30分間展開させた後、プレートを取り出します。その後、フローフード内で2時間放置して溶媒を乾燥させます。展開したTLCプレートが乾燥したら、密閉カセットに入れ、光刺激ルミネッセンス（PSL）スクリーンとともに3日間インキュベートします。次に、インキュベートしたスクリーンをPSLスキャナーで露光し、分離された放射性標識脂質の仮想画像を取得します。ジアシルグリセロール（DAG）リパーゼ活性を測定するため、まず1.5 mLマイクロ遠心チューブに5,000 CPMの14C標識DAGを加えます。さらに、Triton X-100溶液をチューブに加え、ボルテックスで混合します。その後、溶液を窒素気流下で乾燥させます。最終容量100 µLのアッセイにするため、Tris-HCl緩衝液、塩化ナトリウム溶液、および二重蒸留水を加えます。5秒間ボルテックスします。溶液に5 µLの酵素を加えて反応を開始させます。溶液を30 °Cで4時間インキュベートします。250 µLのメタノールと125 µLのクロロフォームを添加して反応を停止させ、本ビデオの前半で述べた方法で脂質を抽出します。その後、同様に1DTLCおよびそれに続くPSLイメージングを用いて中性極性脂質の分析を行います。予測されるホスホリパーゼSMc01003は、人工的なパラニトロフェノールアシルエステルに対して活性を示しましたが、その活性は、外来遺伝子を発現させていないEscherichia coliの無細胞抽出液に見られる背景活性の2倍から3倍に過ぎませんでした。このことは、パラニトロフェニルアシルエステルがSMc01003にとって好適な基質ではないことを示唆しています。一方、E.Coliの無細胞抽出液ではジアシルグリセロールを分解できませんでしたが、予測されるホスホリパーゼSMc01003を発現させた株の抽出液では、ジアシルグリセロールの分解が認められました。SMc01003はホスホリパーゼであると予測されていましたが、実際にはジアシルグリセロールをモノアシルグリセロールと1分子の脂肪酸に分解するジアシルグリセロールリパーゼです。その後、モノアシルグリセロールをさらにグリセロールと別の脂肪酸へと分解します。この手法を習得すれば、適切に実施することで数週間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、リパーゼおよびホスホリパーゼの酵素活性を最適化する方法と、それに続いて生理学的基質を探索する方法について十分に理解できるはずです。この手順の極めて重要な利点は、酵素活性の最適化を天然の酵素基質の探索から切り離して行えることです。有機溶媒や放射性物質を取り扱う操作は非常に危険であるため、本手順を実施する際は常に必要な予防措置を講じることを忘れないでください。

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