リパーゼ及びホスホリパーゼ候補者のための基質特異性を定義します

この手順の全体的な目標は、潜在的なリパーゼおよびホソフォリパーゼの生理学的基質の検出を加速することです。この方法は、ホスホリパーゼが生体膜の脂質リモデリングにどのように寄与するかなど、昆虫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、酵素活性の最適化と酵素の天然基質の検索を独立して実行できることです。

この方法は、細菌のリパーゼやホスホリパーゼの基質特異性に関する洞察を得ることができますが、他のモデル生物の加水分解酵素を研究するために改変することもできます。この方法のアイデアを思いついたのは、内因性膜脂質であるホスファチジルコリン、イノリゾビウム・メリロチを分解する酵素活性を探したときでした。無細胞タンパク質抽出物を調製するには、細菌細胞懸濁液を解凍し、氷上に保存します。

次に、セル懸濁液を20, 000ポンド/平方インチの冷圧セルに3回通します。インタクト細胞と細胞破片を、摂氏4度で5, 000倍gで30分間遠心分離して除去します。遠心分離後、その後の分析のために上清から100マイクロリットルおよび500マイクロリットルのアリコートを調製します。

以前に最適化した酵素アッセイを、テキストプロトコールに表されているピペッティングスキームを使用してセットアップします。明確な酵素活性を最初にカバーするには、パラニトロフェノールやPNP誘導体など、加水分解時に着色生成物を生成する人工基質を使用します。30°Cの分光光度計で5分間にわたってPNPが形成されるため、405ナノメートルでの吸光度が増加する時間経過をたどります。

最後に、テキスト プロトコルで説明されているように計算を実行します。脂質のラジオ標識には、目的の培養培地5ミリリットルで目的の生物を一晩前培養し、摂氏30度で増殖させます。培養前から、100mm培養フラスコに20mmの新鮮培地に接種し、620nmで0.3の初期光学濃度を得るための培養を行う。

次に、無菌条件下で、培養物の1ミリリットルのアリコートを14ミリリットルの滅菌ポリスチレン丸底チューブに移します。1ミリリットルの培養物に114°Cのアセテートのマイクロキュリーを1つ加えます。次に、30°Cの撹拌下で液体培養物を24時間インキュベー

インキュベーション期間の終わりに、培養物を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、室温で12, 000回gで5分間遠心分離します。ペレットを100マイクロリットルの水に再懸濁します。この時点で、細胞懸濁液をマイナス20°Cで保存するか、すぐに極性脂質の抽出を続行します。

極性脂質の抽出を行うには、100マイクロリットルの水性細胞懸濁液に、2〜1メタノールの375マイクロリットルをクロロホルム溶液に加えます。サンプルを30秒間ボルテックスした後、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、室温で12, 000回gで5分間遠心分離します。

次に、上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。次に、上清に125マイクロリットルのクロロホルムと125マイクロリットルの水を追加します。30秒間ボルテックスした後、室温で12, 000倍gでサンプルを1分間遠心分離します。

下部クロロホルム相を新しいチューブに移します。次に、窒素ガスの流れで溶液を乾燥させます。乾燥脂質を100マイクロリットルのクロロホルムにメタノール溶液に溶解します。

薄層クロマトグラフィーによる中性極性脂質の分離のためには、脂質サンプルの3マイクロリットルのアリコートを、プレートの端から2センチメートルから始まる高性能薄層クロマトグラフィーシリカゲルアルミニウムシートに適用します。複数のサンプルを1次元クロマトグラフィーで分析する場合は、異なるサンプルアプリケーションスポット間で少なくとも1.5cmの距離を保ちます。移動相をTLC現像チャンバーに移し、内部にクロマトグラフィーペーパーでコーティングします。

ガラスプレートで覆い、チャンバーを30分間飽和させます。HPTLCシリカゲルアルミニウムシートと乾燥脂質サンプルをチャンバーに移します。プレートを取り外す前に、密閉チャンバー内でプレートを30分間発達させます。

その後、フローフードで溶剤を2時間乾燥させます。開発したTLCシートが乾いたら、閉じたカセットで光刺激性発光スクリーンと3日間インキュベートします。次に、インキュベートしたスクリーンをPSLスキャナーにさらし、分離した放射性標識脂質の虚像を取得します。

ジアシルグリセロール、またはDAGリパーゼ活性を測定するには、まず5, 000 CPMの14 C標識DAGを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに加えます。また、チューブにTriton X-100の溶液を加え、ボルテックスで混合します。窒素の流れの下で溶液を乾燥させます。

最終的な100マイクロリットルアッセイでは、Tris-HClバッファー、塩化ナトリウム溶液、および二蒸留水を加えます。5秒間渦巻きます。溶液に5マイクロリットルの酵素を加えて反応を開始します。

溶液を摂氏30度で4時間インキュベートします。このビデオで前述したように、脂質を抽出する前に、250マイクロリットルのメタノールと125マイクロリットルのクロロホルムを添加して反応を停止します。1DTLCによる中性極性脂質の解析を進め、その後のPSLイメージングを従来通り

予測されたホソホリパーゼSMc01003は、人工パラニトロフェノールアシルエステルによる活性を示していますが、その活性は、外来遺伝子が発現していない大腸菌の無細胞抽出物に存在するバックグラウンド活性の2倍または3倍にすぎません。これは、パラニトロフェニルアシルエステルがSMc01003の良好な基質ではないように見えることを示しています。大腸菌の無細胞抽出物はジアシルグリセロールを分解できませんが、予測されたホスホリパーゼSMc01003が発現していた株の抽出物は、ジアシルグリセロールの分解を引き起こしました。

SMc01003はホスホリパーゼであると予測されていましたが、実際にはジアシルグリセロールをモノアシルグリセロールと1つの脂肪酸に分解するジアシルグリセロールリパーゼです。次に、モノアシルグリセロールをさらにグリセロールと別の脂肪酸に分解します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば数週間で完了します。

このビデオを見れば、リパーゼとホスホリパーゼの酵素活性を最適化する方法と、それらの生理学的基質の探索を続ける方法についてよく理解できるはずです。この手順の決定的な利点は、酵素活性の最適化を天然の酵素基質の探索から分離できることです。有機溶剤や放射性物質の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に必要な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。