シーケンシャル燻蒸インキュベーション・プロシージャを使用した土壌中の不安定な有機炭素の評価

この逐次燻蒸インキュベーション手順の全体的な目標は、不安定な炭素と土壌中の潜在的な炭素代謝率を推定することです。この方法は、土壌微生物が土壌中の栄養素を変換するために使用する基質の量など、土壌微生物学分野の重要な事柄に答えることができます。この手法の主な利点の 1 つは、比較的使いやすく、安価であることです。

収集する前に、収集サイト内の土壌特性と植生の違いを特定します。適切な変動係数を使用して、必要なサンプル数と変動距離を決定します。不均一な土壌条件の場合、各トランセクト上のサンプルポイント間の距離が実験ユニット内の変動距離よりも小さいグリッドサンプルパターンを指定します。

サンプルポイントの土壌表面から有機物を取り除きます。オーガーを使用して、各土壌サンプルを収集します。グリッドのトランセクトごとに、サンプルを1つの容器に混合します。

各複合サンプルは、収集後すぐにアイスパック付きのクーラーボックスに入れます。フィールドワークが完了したら、土壌サンプルをふるいにかけます。各サンプルをふるいにかけた後、メッシュを水で洗浄します。

複合土壌サンプルごとに、3つの個別の100グラムのサンプルをビーカーに入れます。ビーカーを実験用フィルムで覆い、ビーカーを摂氏25度で10日間事前にインキュベートします。次に、サンプルごとにフィルムをはがし、事前に計量したアルミニウム製計量ボートに1グラムの土壌を置きます。

湿った土の合計重量を記録し、ボートの重量を量ります。計量ボートで各サンプルを摂氏105度で48時間乾燥させます。最初の24時間は8時間ごとに体重をチェックし、その後は体重が減らなくなるまで6時間ごとに体重を確認します。

計量ボートの既知の重量を使用して、乾燥した土壌の重量を決定します。乾燥土壌と湿潤土壌の重量比を計算します。燻蒸を開始するには、湿らせたペーパータオルを磁器プレート付きの2つのガラス製真空デシケーターのそれぞれの下部に置きます。

燻蒸用のデシケーターを1つ指定します。各サンプルについて、それぞれ30グラムの土壌を含む3つの細いガラスバイアルを準備します。各バイアルを実験室用テープに鉛筆でラベル付けします。

各セットについて、2つのバイアルを燻蒸デシケーターに入れ、3番目のバイアルを他のデシケーターに入れます。燻蒸デシケーターをヒュームフードに入れます。100ミリリットルのビーカーの底を沸騰石で覆います。

ヒュームフードで、50ミリリットルのエタノールフリークロロホルムをビーカーに注ぎます。ビーカーを燻蒸デシケーターの中央に置き、デシケーターを閉じます。燻蒸デシケーターを真空ポンプに接続します。

真空ポンプのスイッチを入れ、クロロホルムを30秒間沸騰させます。次に、ポンプの電源を切り、デシケーターに空気を入れるために切断します。この手順をさらに 2 回繰り返します。

クロロホルムを4回目に2分間煮沸します。次に、デシケーターを閉じて真空を維持します。真空ポンプの電源を切り、外します。

もう一方のデシケーターを閉じて密封します。両方のデシケーターを暗い場所に室温で24時間保管してください。次に、燻蒸デシケーターをヒュームフードに入れます。

デシケーターを通気し、ペーパータオルを取り外します。土の入ったバイアルをデシケーターに入れ、デシケーターを閉じ、真空ポンプを接続し、真空を開いて土壌サンプルからクロロホルムガスを除去します。バキュームを5分間運転してから、デシケーターを通気します。

このステップをさらに4回実行し、土壌で満たされたバイアルをデシケーターから取り出して、インキュベーション手順の準備をします。インキュベーション容器を調製するには、燻蒸したサブサンプルと燻蒸していないサブサンプル用の広口ポリプロピレンボトルをラベル付けします。後で滴定するための土壌制御がないため、さらに3本のボトルにラベルを付けます。

ラベルの付いたボトルごとに、サイズ10のゴム栓の中央に穴を開け、長さ15センチメートルのガラス棒を穴に挿入します。40ミリリットルのガラスバイアルを輪ゴムでガラスロッドに取り付けます。次に、元のインキュベート前にインキュベートした土壌サンプルから1グラムの土壌を3つのサブサンプルのそれぞれに加えます。

燻蒸土壌のラベルが貼られたボトルの1つに1ミリリットルの脱イオン水を入れます。燻蒸した土壌のバイアルをボトルに入れます。1ミリリットルの2モルの水酸化ナトリウムをストッパーアセンブリのガラスバイアルにピペットで移します。

ボトルを慎重に栓し、ラボ用フィルムでボトルを密封します。残りの土壌サンプルに対してこのプロセスを繰り返します。同じ方法で、土壌サンプルなしで土壌なしの容器を準備します。

インキュベーションチャンバーを暗所に室温で10日間保存します。インキュベーション後、インキュベーション容器から水酸化ナトリウムのバイアルを慎重に取り出します。2ミリリットルの1モル塩化バリウムをバイアルにピペットで入れます。

バイアルにフェノールフタレインを1滴加えます。.バイアルにマグネチックスターバーを追加し、スタープレート上で混合物の攪拌を開始します。ビュレットを使用して、溶液の外観が赤から無色に変わるまで、0.1の通常の塩酸をゆっくりと加えます。

添加した塩酸の量を記録します。すべてのインキュベーションチャンバーについて滴定を繰り返し、土壌なしの値を別々に確認します。滴定データと乾湿土壌重量比を使用して、土壌サンプルのインキュベーション中にミネラル化された二酸化炭素を計算します。

これから、サンプルの各セットの微生物バイオマス炭素を計算します。燻蒸したサンプルに対してさらに7ラウンドの燻蒸とインキュベーションを行い、各サイクル後の鉱化二酸化炭素を計算します。このデータを使用して、非線形回帰によって、各燻蒸サンプルの不安定な有機炭素の量と潜在的な回転時間を決定します。

逐次土壌燻蒸およびインキュベーション法は、不安定な有機炭素(LOC)の違い、および異なる植生条件間の潜在的な炭素代謝率の違いを特定します。大豆の条件はLOC値が最も高く、これは大豆収穫時のバイオマス沈着と関連していました。ロブロリーの松のプランテーションは、潜在的な炭素代謝率が最も高く、これは酸性の松の糞が土壌有機物の主要な供給源であることと関連していました。

ロブロリーパインとスイッチグラスアレーの作付システムは、サンプリングサイト条件が最も広く、スイッチグラス牧草地はサンプリングサイト間で土壌テクスチャのばらつきが最も大きかった。これらの条件は両方とも、LOC値と潜在的な炭素代謝率の両方に広い範囲を示しました。この手法を習得すると、各サンプルの実行にかかる時間80日間で、サンプルごとに約30分かかります。

この手順を正確に実施するために覚えておくべきことのいくつかは、デシケーターとインキュベーションチャンバーがしっかりと密閉されていることを確認し、水酸化ナトリウムを含むバイアルに近づきすぎないようにすることです。この手順と並行して、またはこの手順に従って、土壌微生物の機能をよりよく理解するために土壌で実施できるいくつかの異なる酵素アッセイがあります。このビデオを見れば、逐次燻蒸インキュベーション手順を使用して不安定な炭素分析を行う方法について十分に理解できるはずです。

クロロホルムの使用は非常に危険であることを忘れないでください。これらの手順を安全に実施するには、個人用保護具とドラフトが必要です。