Name: 多発性硬化症のマウスモデルで進行性の神経障害を測定します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶロタロッド性能試験による多発性硬化症マウスモデルの進行性神経障害評価法。TMEV感染マウスの運動機能を客観的に定量化し、治療薬の有効性評価に有用な標準プロトコルを解説します。

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著者は、これらの研究に使用されたマウスの専門的なケアに対して、ダートマスの比較医学研究センター（CCMR）のスタッフに感謝します。著者はまた、エミリー・クラフの優れた管理サポートに感謝しています。

全ての動物の作業はダートマスで医学のガイゼル学校で検討し、施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルを利用しています。 1.マウスモデル<ol><li> TMEV誘導性脱髄性疾患の誘導 <ol><li>快適な作業スペースにラックから4〜6週齢の雌SJL / JHanマウスを含むケージを移動します。臨床および組織学的疾患の個々の評価を可能にするために（耳タグまたは耳パンチと、例えば ）マウスをマークします。 </li><li> 29ゲージのインスリン注射器と針にPBS中、TMEV感染株式（PFU 2×10 6プラーク形成単位）の30μLを描画します。 </li><li>麻酔ガスマシンを準備します。手順の期間中、酸素およびイソフルランの適切な量の存在を確実にするためにシステムをチェック。 </li><li> 1L /分に流量計の電源をオンにします。誘導室に動物を置き、上部を密封します。 VAをオンにします3.5％にporizerとリカンベントまで、動物を監視します。 </li><li>チャンバーから動物を削除し、適切な麻酔を確保するために、フットパッドをつまんでマウスをテストします。強いピンチへの応答の欠如は、十分な麻酔を示しています。 </li><li> 70％イソプロピルアルコールで注射部位をきれいにしてください。 </li><li>フリーハンド注射（ 図1）によって、右大脳半球にTMEV感染株式の30μLを注入します。注射部位は、ほぼ中間の目と耳のラインとの間に、ちょうど正中線から外れています。 </li><li> （ - 5分、通常3）警報や携帯一度完全にその保持ケージにマウスを返します。 </li><li>疾患の発症の速さに応じて、3〜6ヵ月TMEV感染後放血または心臓灌流によってマウスを安楽死させます。 </li></ol></li></ol> 2.ロータロッド分析<ol><li> ロータロッド装置 <ol><li>試験マウスでそれらを理解するためにTMEV感染する前にマシンとそれらの正常なベースラインのバランス調整とモータ制御を評価します。 </li><li> -5日に適応プロトコル感染後（; すなわち、5日TMEV感染前の解像度）を起動します。 </li><li>マウスは、それらが環境に適応することを可能にするために、少なくとも30分前にロータロッドのテストのために試験室に順応することを可能にします。 </li><li>ロータロッド装置とコンピュータの両方が接続され、（ 図2）相互に接続されていることを確認します。 </li><li> 表1に記載したように、-5解像度トレーニングプロトコルパラメータでロータロッドを予め設定。 </li><li>日付と識別情報と作業ファイルを保存します。 </li><li>ロータロッドに隣接テーブルにラックから試験しようとする部隊を含むケージを移動します。マウスは、通常、4の分隊で試験します。 </li><li>尾によってマウスをピックアップし、棒の上に置き、オペレータから離れて直面しています。第マウスを介して第2の手順を繰り返します。マウスFAL場合すべてのマウスが定位置になるまでのlsやジャンプ、ロータロッド上の車線に戻ってそれを置きます。任意のマウスは、オペレータに直面して好転させる場合は無視します。 </li><li>すべてのマウスをロードした後、実験を開始するには、「Enter」ボタンを押してください。タイマーが各レーンのために自動的に起動し、ディスプレイ上の毎分回転数（rpm）を観察。 <ol><li>各動物がロッドから落ちるように、動物がロッド上に残って落下時のロッドの速度だけでなく、時間の長さを記録。ロッドは、最後の動物がロッドアセンブリから低下するまで回転し続けるだろう。 </li></ol></li><li>すべてのマウスが落ちた後、ロッドから任意の糞便丸薬および尿を除去するための組織を使用しています。尿および糞便物質の存在が把持するマウスロッドの能力に影響を及ぼし得ます。 <ol><li> 3分間の休憩の後、マウスを三裁判後、第2とを与えます。単一の試行あたりの最大時間は240秒です。各試験日の間に3試験の合計を管理します。 </li></ol></li><li>彼らのホームケージにマウスを返し、バックラックにそれらを返します。実験セッションの最後に、マシンからすべての糞便を削除するには、石鹸と水でロータロッドをきれいに。 </li><li>エタノール70％できれいにベースプレートを拭いてください。消毒するために二酸化塩素でマシン全体を下にスプレーしてください。 </li><li> 4、 - - 3、 - 2、および-日に1パイ、 表1に記載されているように、適切な訓練プロトコルパラメータでロータロッドをあらかじめ設定し、繰り返しは2.1.12に2.1.2を繰り返します。 </li><li>ベースライン測定を得た後、TMEVをマウスに感染させます。 6日間のパイの回復期間を許可します。 </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> プロトコル </td><td rowspan="2"> テストデー </td><td rowspan="2"> 周波数 </td><td rowspan="2"> 開始数（rpm） </td><td rowspan="2"> マックス数（rpm） </td><td> 加速度 </td><td> トライアル </td><td> ITI </td></tr><tr><td> （回転/秒） </td><td> （NのX秒） </td><td> （分） </td></tr><tr><td rowspan="4"> トレーニング </td><td> - 5解像度</td><td> 1日</td><td> 1 </td><td> 12 </td><td> 1月3日</td><td> 3x240秒</td><td> 3 </td></tr><tr><td> - 4解像度</td><td> 1日</td><td> 1 </td><td> 13 </td><td> 1月3日</td><td> 3x240秒</td><td> 3 </td></tr><tr><td> - 3解像度</td><td> 1日</td><td> 1 </td><td> 14 </td><td> 1月3日</td><td> 3x240秒</td><td> 3 </td></tr><tr><td> - 2; - 1解像度</td><td> 1日</td><td> 5 </td><td> 40 </td><td> 1月3日</td><td> 3x240秒</td><td> 3 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 実験的 </td><td> 7から50解像度へ</td><td> 2 /週</td><td>5 </td><td> 40 </td><td> 5月30日</td><td> 3x240秒</td><td> 3 </td></tr><tr><td> 51から150 dpiのに</td><td> 1週間</td><td> 5 </td><td> 40 </td><td> 5月30日</td><td> 3x240秒</td><td> 3 </td></tr></tbody></table> 表1：トレーニングと実験プロトコールでのロータロッドのパラメータ。 <ol start="2"><li> ロータロッド実験プロトコール <ol><li> 表1に記載されているように、適切な実験プロトコルのパラメータを持つ7 dpiの、予め設定されたロータロッドに。繰り返し2.1.2 2.1.10にステップ。 </li><li>トライアル＃3の終わりに、各マウスを計量し、データシートに体重をメモします。清潔でステップ2.1.11および2.1.12ごとにロータロッドを消毒。 </li><li>前述したように、次の6週間、週2回のマウスをテストします。 （マウスはそうプラトー期に達しているに）6週8,9の後、同じエクスペリで週に一度マウスをテストしますリットルプロトコル。実際の試験プロトコルは、特定の疾患の経過に応じて、150日間の平均を持続します。 </li></ol></li><li> 神経学的機能インデックス <ol><li>スプレッドシートファイルに生データをエクスポートし、結果を分析。 </li><li>走行時間（ 図3A）のようなエクスプレスデータ：これは通常の実行時間を加えた受動回転時間マイナス回転遅延時間（ 表2）10です。一日あたり3回の試験の平均実行時間を計算します。 </li><li>神経学的機能指数（; 図3B NFI）などのデータを表現します。 <ol><li>各個々のマウスのベースラインパフォーマンスのしきい値を計算します。ベースライン性能閾値は+ 15 + 45π6,7日目から実行中のすべての時間の平均値として決定されます。 </li><li>その特定のマウス6,7のベースラインパフォーマンスのしきい値で割った最新の3つの平均実行時間の平均としてNFIを計算します&lt;/ SUP&gt;。 注：そのマウスのために、日+ 72上でのマウスのための試験を実行している回場合は+ 76、および+ 79 piが55秒、45秒、50秒であり、同じマウスのベースライン時間は135秒であった、NFI 79 dpiの上に[（45 + 50 + 55）/ 3] / 135または0.37になります。 </li></ol></li><li>調整後のNFI（adjNFI; 図3C）などのデータを表現する：単一の実験のための人口値によってNFIデータを調整します。 <ol><li>その特定の日に偽処置グループによって得られた平均NFIによってNFI値を割ることによりadjNFIを計算します。 </li></ol></li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 期間 </td><td> 定義 </td></tr><tr><td>通常走行時</td><td>マウスが積極的に回転棒上で実行されているに費やす合計時間は、 すなわち 、待ち時間が落下します。 </td></tr><tr><td>受動回転時間</td><td> Aマウスは受動回転モードでロッド上に留まっている時間をマウントします。 </td></tr><tr><td>回転遅延時間</td><td>マウスは受動回転モード時にロッド上に残っている時間の量</td></tr><tr><td>受動回転モード</td><td>マウスは、ロッドをつかみ、歩行することなく回転すると。 </td></tr><tr><td>総セッション時間</td><td>マウスは、セッション中に回転棒上に残っている時間の合計。 </td></tr><tr><td>ベースライン性能</td><td>プリダメージモータの性能は最低性能閾値を決定するために評価します。 </td></tr><tr><td>神経機能指数（NFI） </td><td>各マウスの運動性能を比較した臨床指標、 すなわち、そのピーク性能にいつでも、時間を実行しています。 </td></tr><tr><td>調整後神経機能指数（adjNFI） </td><td>正規化処理は、母集団の値によってNFIデータを調整するために適用される場合単一の実験。 </td></tr><tr><td>母集団値</td><td>特定の日で、偽処置群によって得られた平均NFI値。 </td></tr></tbody></table> 表2：神経学的障害を定量化するために採用したロータロッドパラメータの定義。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

いくつかの制限があるにもかかわらず、ロータロッド性能試験は、運動機能および機能不全TMEV-IDD中だけでなく、マウスでの障害進行に対する薬理学的介入の効果を評価するための重要なツールを表します。 ロータロッド試験は、最初にげっ歯類11で神経学的欠損を測定するためのツールとして、1957年に記載されました。げっ歯類は、回転速度の増加に伴って、回転棒の上を歩くと、地面に転倒しないようにしようとする必要があります。落下する待ち時間を記録し、運動機能の定量エンドポイントとして使用されている：動物が持っているより多くの神経学的障害は、すぐに彼らは棒から落ちます。従来の視覚的スコアリングシステムに対するこの試験の明確な利点は、障害の進行3の治療および実験手順の効果を定量化する統計目的のために使用することができる目的変数を生成することです。このような立ち直りリフレなどの視覚的スコアリングシステムXテストは、マウスにおける運動能力を評価するための、より簡単で迅速なテストであるとして優先される場合もあります。しかし、これらのシステムは、ロータロッド性能試...

タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（TMEV）が持続的に、マウスの中枢神経系（CNS）に感染神経向性一本鎖RNAウイルスです。感受性マウスでは、TMEVによる感染はTMEV誘発性脱髄疾患（TMEV-IDD）として知られる免疫介在性、慢性進行性の脱髄疾患を引き起こします。マウスの実験的感染は、多発性硬化症（MS）の進行形で見られるものに似ている病気のコースを取ります。急性期と慢性期：TMEV-IDDは、2つの異なる相によって特徴付けられます。急性期は軽度、通常は不顕性脳炎1,2です。第二、慢性期は、感染後約一ヶ月始め、脱髄、炎症、および軸索損傷の1,2によって特徴づけゆっくりと進行する障害者で構成されています。マウスで観察された弱さは痙縮と、時折、重度の強直性痙攣に関連しています。 現在のところmedicatioはありませんので、NSは患者に進行性の障害を改善するために、研究者は、特に疾患の進行上の疾患修飾薬の影響を監視するための最適な動物モデルを表しTMEV-IDDによって引き付けられます。しかし、マウスならびにMS患者では、障害の進行のモニタリングは、長期間にわたって連続的に臨床的観察を必要とします。マウスでは、障害の進行の長期的な監視は、ロータロッド性能試験を用いて達成することができます。 ロータロッドの性能試験は、げっ歯類の調整、バランス、疲労などのモータ関連する機能を評価する標準的な行動試験です。マウスは、連続的な加速の下で回転している回転ロッド、上の彼らのバランスを維持する必要があります。このロッドから落ちるまでの時間待ち時間が記録されています。神経機能障害を有する動物は、対照限り、回転ロッド上に留まることができない、と回転速度を超えたとき、彼らは通常、ドロップオフ、それらモータ容量。動物が持っているより多くの神経学的障害は、すぐに彼らは棒から落ちる、と短い時間の待ち時間があります。 従来の視覚的スコアリングシステム上のロータロッド試験の利点は、それが目的を生成することである、測定可能な可変時間遅延の最終的療法および実験手順3の効果を定量化するために統計分析のために使用することができます。 ダートマスでの神経免疫学の研究所（LONI）では、マウスは、それらは機械でそれらを理解し、それらの通常の「ベースライン」のバランス調整とモータ制御4を評価するために、前TMEV感染にテストされ、適応プロトコルに供されています5。ベースラインが確立され、マウスはTMEVに感染していると、それらは数ヶ月の期間にわたって一回又は週二回試験します。実際の試験プロトコルは、このように評価を可能にする、150日の平均持続します脱髄疾患の全体にわたってバランス、調整、およびモータ制御の衰退。 数百TMEV-IDDおよび偽処置マウスは、ダートマスで神経機能障害のために、これまでに試験されています。これらのマウスは、様々な免疫治療を受けていたが、何の薬理学的薬剤は、障害の進行6,7を改善するのに有効であることが見出されていません。現在の記事と関連プロトコルがTMEV-IDDマウスで表示される進行性の神経障害を特徴づける方法について説明します。特に、プロトコルは、ロータロッド試験を用いてTMEV-IDDマウスにおける神経障害を研究するための一般的に適切であると考えられ、特定のテスト・パラメータの推奨を提供しています。この手順では、MSのような進行性の神経学的症状を治療することを目的とした治療法を試験するための進行型MSにこのマウスモデルの（1）関連性と（2）その有用性を評価するに対してベースラインを提供します。明らかに、ロータロッド性能試験と現在の最適化されたテスト・パラメータおよびプロトコルはTMEV-IDDマウスモデルにおいて進行性の神経障害を検出することだけでなく、有用であるが、他のウイルス誘導性および/または神経変性疾患の遺伝的マウスモデルで障害を暴くにも有用です。

<table><tbody><tr><td>マウス SJL/JCrHsd 4 〜 6 週齢</td><td>Envigo</td><td>#052</td><td></td></tr><tr><td>TMEV ウイルスストック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td>ハーバード 装置</td><td>#340471</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器 U- 100 29 g x 0.5 cc</td><td>BD</td><td>#328203</td><td></td></tr><tr><td>Rotamex-5 RS-232 およびソフトウェア</td><td>コロンバス インスツルメンツ</td>を備えたマウス用 4 レーン ロタロッド <td>#0890M</td><td></td></tr></tbody></table>

多発性硬化症のマウスモデルで進行性の神経障害を測定します

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Theiler's Mouse Encephalomyelitis Virus(TMEV)による脳内感染後、感受性の高いSJLマウスは、進行性の多発性硬化症(MS)と同様の臨床的特徴を持つ慢性進行性の脱髄疾患を発症します。マウスは、運動機能および感覚機能の喪失を伴う進行性の障害を示し、これは複数の装置およびプロトコルで評価することができる。その中で、ロタロッドパフォーマンステストは非常に一般的な行動テストであり、その利点は客観的な測定を提供することですが、それが単純で単純であると仮定してよく使用されます。MSの一部のモデルで使用されている視覚的な採点システムは非常に主観的ですが、Rotarodテストは客観的で測定可能な連続変数(つまり、時間の長さ)を生成し、ほぼ完全な評価者間の一致を可能にします。ただし、ラボ間の信頼性は、さまざまなテストパラメータが再現されている場合にのみ達成されます。この原稿では、ロッドのサイズ、速度、加速度などの特定のテストパラメータの推奨事項。動物に与えられた訓練の量。とデータ処理は、ロタロッドテストについて提示されます。

この代表的な実験の目的は、ダニエルズ（DA）株およびTMEVの豆株によって誘発される神経学的障害を比較することでした。本研究の目的のために、32雌SJLマウスの群（n = 16）、TMEVと頭蓋内DA株（N = 16）、またはマメ株のいずれかを感染させ、それらの臨床的徴候は、経時的にモニターしました。 20匹のマウスのさらなる群は、偽は、処理された（ すなわち、生理食塩液を頭蓋内注射した）と健常対照群としました。 ロータロッド性能試験はTMEV感染マウスと偽対照における慢性疾患の進行を評価するために使用しました。マウスは個別に耳マークされ、前TMEVの注入にした後、125日間続いた実際の試験プロトコルに週に毎日適応プロトコルに供しました。各試験日、走行時間については、TIの長さとして定義私ロッドにとどまったマウスは、その日の3試験の平均として各マウスについて個別に保存しました。ロータロッドデータもNFIのように偽の正規化adjNFIと...

この論文では、TMEVに感染したマウスの進行性神経障害を測定するために使用されるRotarod性能試験のための最適化された試験プロトコルが提示されています。

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

この手順の全体的な目的は、慢性脱髄疾患を持つマウスにおける進行性の神経学的障害を評価することです。Rotarodテストを用い、進行性多発性硬化症のTheilersウイルスモデルにおける長期的な神経学的障害の研究に適したテストパラメータを提案することで、これを達成します。本手順は、進行性脱髄に対するマウスモデルの妥当性と、多発性硬化症のような進行性神経疾患の治療を目的とした治療法の試験における有用性を評価するためのベースラインを提供します。この最適化された試験の従来の視覚的スコアリングシステムに対する利点は、運動機能に対する治療や実験的手法の長期的な影響を定量化するための客観的な変数を得られる点にあります。この手順の実演を行うのは、ダートマス大学神経免疫学研究室の技術者、Darlene Royceです。ベースラインのバランス調整能と運動制御能を評価するために、TMEV感染の5日前に順化プロトコルを開始し、まずマウスを試験室に少なくとも30分間置いて順化させます。マウスを順化させている間に、Rotarodをマイナス5 DPIのトレーニングパラメータに設定します。次に、マウスを尾を持って持ち上げ、操作者とは反対方向を向くようにロッド上に置きます。マウスが落下したり飛び降りたりした場合は、すべてのマウスが定位置に配置されるまで、Rotarodのレーンに戻してください。4匹すべてのマウスを設置した後、Enterボタンを押して実験を開始します。タイマーが自動的に開始されることを確認し、各レーンのディスプレイに表示される1分間あたりの回転数を確認してください。その後、動物が棒から落下するたびに、落下時の棒の速度および動物が棒に留まっていた時間を記録します。すべてのマウスが落下した後、ティッシュを使用して棒上の糞便塊や尿を除去します。尿や糞便が付着していると、マウスが適切に棒を掴む能力に影響を与える可能性があるためです。3分間の休息後、2回目および3回目の試行を行います。1回あたりの最大測定時間は240秒とします。各測定日に計3回の試行を実施してください。最後に、マウスをホームケージに戻します。PI（中風誘発）の4日前、3日前、2日前、および1日前に、適切なトレーニングプロトコルのパラメータをRotarodに設定し、Rotarod試験を繰り返します。まず、4〜6週齢の雌のSJLマウスが入ったケージをラックから快適な作業スペースへ移動させることから始めます。個体ごとの臨床的および組織学的疾患の評価を可能にするため、イヤーパンチを用いてマウスにマーキングを行います。次に、PBSに溶解した30 µLのTMEV感染ストックを29Gのインスリン用注射針で吸い込みます。麻酔ガス装置を準備し、処置時間中、十分な量の酸素とイソフルランが供給されることを確認します。動物を導入チャンバーに入れ、上部を密閉します。数分後、動物をチャンバーから取り出し、足底をピンチして適切な麻酔状態にあるかを確認します。次に、注射部位を70% isopropyl alcoholで清浄し、TMEV感染ストック30 microlitersをフリーハンド注射により右大脳半球に注入します。最後に、マウスが完全に覚醒し、自由に動けるようになったら、飼育ケージに戻します。感染後7日目に、適切な実験パラメータでRotarodをプリセットし、適切な実験プロトコルのパラメータに従ってRotarodトレーニング全体を繰り返します。毎日の3回目の試験後、各マウスの体重を測定し、データシートに記録します。その後6週間、同様の方法で週2回、マウスのテストを行います。6週間後から、同じ実験プロトコルを用いて週1回のテストを、平均150実験日になるまで継続します。次に、生データを解析し、神経機能指数（NFI）として算出します。個々のNFI値を決定するために、感染後15日から45日までのすべての走行時間の平均を、各マウスのベースライン性能閾値として算出します。これにより、初期の脳炎による欠損の影響を排除し、進行性脱髄の結果としての運動性能を評価することが可能になります。次に、直近3回の平均走行時間の平均を、そのマウスのベースライン性能閾値で除して、NFI値を算出します。最後に、NFI値を、その特定の日のシャム処置群で得られた平均NFI値で除して、補正NFIを算出します。この図は、TMEV感染マウスが、対照マウスと比較して、時間の経過とともに神経学的欠損が有意に増加することを示しています。2つの異なるTMEV株による慢性感染は、マウスの走行時間に悪影響を及ぼしました。TMEVに感染したマウスの両群において、NFI値はシャムマウスよりも有意に低い値を示しました。さらに、BeAn株に感染したマウスとDA strainに感染したマウスの間で、すべての時点において障害の進行に差は見られませんでした。この手順に続き、マウスの全身状態を迅速に評価するために、正位反射テストなどの従来の視覚的スコアリング法を実施することが可能です。この手法の開発により、多発性硬化症および神経変性疾患分野の研究者が、進行性の障害を遅延させる治療法やその他の介入策の有効性を検証することが可能になりました。本ビデオを視聴することで、マウスにおける長期的な進行性障害を評価する方法について十分に理解できるはずです。この手順は、Theilerウイルスモデルにおける進行性の神経学的障害を検出するのに有用であるだけでなく、他の神経変性疾患マウスモデルにおける機能 impairment を明らかにする際にも有用です。

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