マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で
2016年12月19日
私たちは、マトリックスゲルプラグ血管新生アッセイの変動を用いて、マウスにおけるヒト内皮 - 周皮細胞の相互作用を研究するためのプロトコルを提示します。
この in-vivo マトリックスゲルアッセイの全体的な目標は、内皮細胞と寄生虫との相互作用を調査することです。このマトリゲルアッセイは、研究者がアンドロジェネシスの主要なステップを研究するのに役立つように設計されています。また、血管形成の主要なステップに関与するシグナル伝達経路や、機能不全が血管障害やその他のアンドロジェネシスの異常につながる可能性のある遺伝子の特定も可能になります。
この技術の主な利点は、内皮細胞とその支持細胞である周皮細胞の両方が関与する生体内血管形成を研究できることです。まず、100 mmプレート上でヒト内皮細胞および寄生虫細胞培養物を、10 mLの適切な培地で増殖させます。細胞が80%の密度に達するまで、2〜3日ごとに培地を交換します。
細胞と混合するマトリックスゲル溶液を調製するために、マトリックスゲルのストックを摂氏4度で一晩解凍します。次に、マイナス摂氏20度で長期的に、または摂氏4度で最大2週間保存するために1.5ミリリットルのアリコートを作ります。各実験用プラグには、200マイクロリットルのマトリックスゲルが必要です。
したがって、在庫のある1本のチューブで6つのプラグを25%の過剰で供給できます。解凍した100x beta-FGFストックを15マイクロリットル追加して、必要な各アリコートを準備します。ピペッティングでβ-FGFを溶液に混合し、細胞を添加する前に氷上で少なくとも30分間インキュベートします。
この時点で、注射用の28ゲージ1ccインスリン注射器を冷やします。培養プレートから細胞を採取するには、培地を取り出し、細胞をPBSで一度洗浄します。PBSを取り除いた後、トリプシン溶液1ミリリットルを加え、プレートをインキュベーターに1分間戻します。
次に、プレート上に2ミリリットルの培養培地をピペットで移して細胞を剥離し、培地を15ミリリットルのチューブに集めます。次に、血球計算盤を使用してコレクションの濃度を確認します。次に、15ミリリットルのチューブに細胞のアリコートを調製します。
ここでは、100万個の内皮細胞と200, 000個の寄生虫の組み合わせが実験グループに使用されます。次に、細胞アリコートを400gで5分間遠心分離します。次に、計算された量のマトリックスゲルを細胞ペレットに加え、気泡を注入できないため、泡が生じないように穏やかなピペッティングで混合します。
次に、マウスが注入する準備ができるまで、準備を氷の上に保ちます。マウスにイソフルランを麻酔し、つま先をつまんで麻酔状態を確認した後、マウスをイソフルランを供給する非再呼吸システムに取り付け、腹側を下にして加熱パッドに置きます。次に、両側の後部から約1平方センチメートルの髪を取り除きます。
次に、露出した肌を70%アルコールできれいに拭きます。次に、調製した細胞溶液1ミリリットルを冷やした注射器にロードします(これは4つのプラグに十分です)。注射をするには、背中の皮膚を持ち上げて皮下腔を見つけます。
その後、胸郭後方の皮下腔に200マイクロリットルをゆっくりと注入し、漏れを防ぐために針をゆっくりと取り外します。注射後、その部位に隆起が形成されます。アルコールで部位を拭き、後で見つけられるように油性マーカーで隆起の輪郭を描きます。
次に、マウスの反対側で注入手順を繰り返します。3分以内にすべての細胞を注入しないと、細胞が注射器にくっつき始めます。注入ステップは、マトリックスゲルプラグが皮膚と筋肉層の間に形成され、プラグが良好な形状を維持し、拡散しないようにするために重要です。
次のマウスの注入に進む前に、注入したマウスをヒートパッドに1分間置いて、マトリックスがゲル化する時間を与えます。安楽死後、マウスを手術台にセットします。注射部位から再成長した毛を取り除いた後、プラグの位置を識別するマーカーラインを見つけます。
次に、細い手術用ハサミを使用して、プラグのマークされた境界に沿って、皮膚に垂直に、そしてその下の筋肉まで切開します。マークされた境界線の周囲を慎重に切り取ります。次に、プラグを取り外し、皮膚と筋肉の層の間に挟んだままにします。
すぐにPBSの小さなビーカーでプラグを洗い流し、血液を取り除きます。次に、プラグ全体を50ミリリットルのチューブに入れ、25ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを入れます。攪拌せずに室温で24時間固定します。
翌日、プラグを25ミリリットルの70%エタノールに24時間移します。その後、パラフィン包埋を進めます。内皮細胞のみを含むプラグの切片は、一部の血管が生体内で14日後に宿主の血液と灌流されないことを示しています。
対照的に、内皮細胞と寄生虫の両方を含むプラグは、生体内14日後に多くの灌流血管を示します。これらのプラグは、平滑筋アクチン染色に陽性の細胞を有しており(赤色で見られ)、CD31陽性内皮細胞のすぐ隣(緑色で示されています)です。したがって、寄生虫は初期の血管形成において重要な役割を果たす可能性があります。
このビデオを見れば、この強力なin-vivo技術を応用して、複数の細胞タイプで使用されている血管形成を研究する方法について十分に理解できるはずです。この技術は、研究者がマウスモデルにおける血管生物学のさまざまなトピックを探求する道を開くでしょう。この手順に続いて、定量的PCRやウェスタン免疫ブロッティングなどの他の方法も実行して、遺伝子発現やプロテオミクスの変化などの追加の質問に答えることができます。
この強力な技術により、研究者は血管形成中に内皮細胞と寄生虫がどのように相互作用するかを生体内で研究することができます。これは、アンドロジェネシスの重要なステップです。この強力な技術により、研究者は、肺高血圧症などの血管疾患の理解に関連する他の細胞間相互作用を研究することもできます。
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概要
本プロトコルでは、マトリックスゲルプラグ血管新生アッセイを用いて、生体内（in vivo）でのヒト血管内皮細胞とペリサイトの相互作用を研究する方法を提示します。このアッセイは、血管形成に関与するシグナル伝達経路を解明し、血管疾患に関連する遺伝子を特定することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 血管新生
- 細胞間相互作用
- 血管生物学
背景
- 内皮細胞とペリサイトの相互作用は、血管の安定性にとって極めて重要です。
- これらの相互作用を理解することで、血管疾患に関する知見を得ることができます。
- マトリックスゲルプラグアッセイにより、これらのプロセスのin vivoでの観察が可能になります。
- 先行研究により、血管新生におけるシグナル伝達経路の重要性が強調されています。
研究目的
- 内皮細胞とペリサイトの相互作用を調査する。
- 血管形成に関与するシグナル伝達経路を特定する。
- 機能不全に陥った際に血管疾患を引き起こす可能性のある遺伝子を探索する。
使用した手法
- in vivo マトリックスゲルアッセイ。
- ヒト内皮細胞およびペリサイト細胞の培養。
- 血管形成の観察。
- シグナル伝達経路および遺伝子発現の解析。
主な結果
- 生体内における血管内皮細胞とペリサイトの相互作用の構築成功。
- 血管新生に関与する主要なシグナル伝達経路の同定。
- 血管疾患に関連する遺伝子に関する知見。
- マトリックスゲルプラグアッセイの有用性の実証。
結論
- マトリックスゲルプラグアッセイは、内皮細胞とペリサイトの相互作用を研究するのに有効である。
- 得られた知見は、血管形成の理解に寄与する。
- 血管疾患を標的とした治療戦略への応用が期待される。
よくある質問
業界への実用的関連性
このin vivoマトリックスゲルプラグアッセイは、生理学的微小環境におけるヒト内皮細胞とペリサイトの相互作用の研究を可能にすることで、血管新生研究における重要なギャップを埋めるものです。これは、血管標的バリデーションのリスク低減や、前臨床モデルにおける予測信頼性の向上に不可欠です。本アッセイは、血管の成熟とペリサイト動員に関するメカニズム研究をサポートし、肺および全身性の血管疾患に対するトランスレーショナルな関連性を提供します。また、灌流血管の形成やペリサイト被覆などの機能的リードアウトを提供することで既存のin vitroシステムを補完し、バイオファーマの研究開発における標的バリデーションおよびリード化合物同定のワークフローに直接的に適用できます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：血管成熟における内皮細胞とペリサイトのシグナル伝達に関する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：生体内でのターゲットエンゲージメントおよびパスウェイ調節を評価するための、疾患に関連したシステムを提供する。
- 科学的価値：血管の安定性と血流におけるペリサイトの機能的役割を明らかにすることで、メカニズム的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 比較解析のために、血管の長さ、数、サイズ、およびペリサイト被覆率を含む、組織学に基づいた定量的出力を生成します。
- 運用的価値： アッセイのバリデーションおよび化合物スクリーニングのカスケードに適した、標準化され再現性のある血管リードアウトを提供します。
- 科学的価値： 血管新生または抗血管新生候補物質の下流評価に向けた、検証済み生物学的系の調製を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：免疫不全マウスへのヒト細胞移植を通じて、肺高血圧症などの血管疾患を研究するための疾患関連モデルを提供する。
- 運用的価値：ペリサイトの被覆と血管の成熟を機能的アウトカムに結びつけることで、トランスレーショナルなバイオマーカーの整合性を促進する。
- 科学的価値：血管ネットワーク形成に対する遺伝学的または薬理学的介入の評価を可能にし、前臨床段階の連続性をサポートする。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは、ターゲットバリデーションからリード化合物同定、そして前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに適応しており、特に血管新生または血管安定化メカニズムの機能的な検証を必要とする血管生物学の研究プログラムに有用です。
- 探索生物学：生体微小環境における内皮細胞とペリサイトのクロストークの観察を可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：標準化されたプラグ作製、固定、および切片作成により、定量的組織学的解析のためのアッセイ準備を実現します。
- 解析：形態計測および灌流ベースのリードアウト（血管サイズ、数、ペリサイト被覆率、RBC含有腔）を提供し、条件間の比較評価を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：肺および全身性の血管新生に関連するヒト血管相互作用を生体内でモデル化し、前臨床段階への継続性を確保します。
- 企業利用：血管系ターゲットにおける遺伝学的研究、パスウェイ解析、および創薬キャンペーンに利用可能なプラットフォームとして機能します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値：ペリサイト依存的な血管成熟を直接観察することにより、血管標的のバリデーションにおけるメカニズム的な曖昧さを軽減し、予測の信頼性を高めます。
- 運用上の価値：定義された細胞比率、マトリックスゲルの調製、および組織学的定量化プロトコルを通じて、再現性と標準化を向上させます。
- 戦略的価値：創薬パイプラインのより早い段階で機能的な血管成熟データを提供することにより、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：in vivoにおけるペリサイトのリクルート能および血管機能に基づいた、血管標的のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- ヒト初代細胞培養、無菌的な外科的手技、および組織学的処理に関する専門知識が必要です。
- 免疫不全マウスモデル（例：SCID）の使用、およびマトリキジェル、灌流マーカー、免疫組織化学試薬へのアクセスに依存します。
- 細胞調製、注入の一貫性、および盲検化された組織学的解析について、チーム間での標準化が必要です。
- 適応上の検討事項として、種特異的な細胞源、ペリサイトの種類、および血管新生促進化合物と血管新生抑制化合物の試験が挙げられます。
- 実用上の制限として、アッセイ期間が14日間であること、プラグの回収率にばらつきがあること、およびリアルタイムイメージングではなくエンドポイントの組織学的解析に依存することが挙げられます。
