Name: マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学ぶマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮細胞と周皮細胞のin vivo相互作用の研究方法。血管形成におけるシグナル伝達経路の同定と血管障害関連遺伝子の探索に応用できます。

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Dr. K. Yuan は、米国心臓協会の科学者開発助成金 (15SDG25710448) と肺高血圧症協会の概念実証賞 (SPO121940) の支援を受けました。V. de Jesus Perez 博士は、Robert Wood Johnson 財団のキャリア開発賞、NIH K08 HL105884-01 賞、肺高血圧症協会賞、米国肺協会の生物医学研究賞、トランスレーショナル リサーチ アンド 応用医学の支援を受けました。スタンフォード大学から賞を受賞しました。

倫理文：動物を対象とする手順は、スタンフォード大学医学部での施設内動物管理使用委員会によって承認されています。 注：動物は、3％の気化イソフルランおよびO 2ガスの3％の供給と麻酔下にあります。目に獣医軟膏の使用は、麻酔下ながら乾燥を防ぐのに役立つかもしれません。 1.細胞の調製<ol><li>適切なメディアの10ミリリットルと100ミリメートルプレートにヒト内皮および周皮細胞培養物を成長させます。細胞が80％コンフルエンスに達するまで3日間 - すべての2新鮮な培地10ミリリットルを交換してください。 <ol><li>会社を補充した完全な内皮細胞培地（ECM）における培養内皮細胞（EC）は、5％ウシ胎児血清（FBS）、10％ペニシリン/ストレプトマイシン及び10％の内皮細胞成長サプリメントを供給しました。 </li><li>会社を補った完全な周皮メディア（PM）における培養周皮細胞は、2％FBS、10％のペニシリン/ストレプトマイシン及び10％周皮細胞成長サプリメントを供給しました。 </li&gt; </ol></li><li>細胞混合物を準備します<ol><li>実験群と対照群のためのセルの必要数を計算します。 注：実験群内の各プラグは百万（1×10 6）が含まれ、人間ECおよび20万（2×10 5）周皮。対照群については、各プラグは120万人の電気部品のみが含まれています。陰性対照群は、マトリックスゲルのみを有しています。各グループには、プラグは、マウスの腰の両側に注入することができるように、2つのマウスを必要とするであろう、少なくとも4つのプラグを含める必要があります。三つのプラグは1に障害が発生した場合に使用することができ、実験と第四のための三連として役立つであろう。ゲルの余分なボリュームを一致させるために25％余分な細胞を準備します。 </li><li>収集し、培養プレートから細胞を数えます。 <ol><li>細胞を剥離するために、メディアを取り出し、室温の1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1回洗浄します。 PBSを削除し、1ミリリットル0.25％トリプシン/ 2.21 mMのEDTAを追加し、1分間インキュベートします。 2を追加することによって、プレートから細胞を洗浄mlの培地とを15mlチューブに収集します。 </li><li>製造者の指示に従って血球計数器を用いて細胞を数えます。 </li><li> 5分間400×gでペレットに適切な数の細胞を遠心します。実験群、遠心分離機ECおよびダウン一緒に1ペレットへの周皮細胞の両方について。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.マトリックスゲルの準備<ol><li>均一な溶液を得るために4時間又は一晩4℃で完全にマトリックスゲルを解凍します。いいえ混合は必要ありません。 </li><li> 4°Cで1.5 mlチューブとストア内の一定分量マトリックスゲル。 </li><li>事前チル滅菌1.5ミリリットルチューブ、4℃で28 G 1ccのインスリン注射器。注意：常に氷上マトリックスゲルを保管してください。 </li><li> 1の体積比でbFGFで冷マトリックスゲルミックス：100（bFGFの最終濃度を0.5μg/ mlに=; bFGFのストック溶液=50μg/ mlの）ダウンを数回ピペッティングによりマトリックスゲル溶液を混合した後、氷上でインキュベート60分B - 30ステップ3.1での細胞と混合EFORE。 注：混合前に在庫のbFGFを解凍します。注射のために必要なプラグの数を計算します。例えば、各プラグは200μlのマトリックスゲルが必要です。したがって、25％の余分なゲルを準備します。 </li></ol>細胞3.ミックスマトリックスジェル<ol><li>グループごとに、bFGFを含有マトリックスゲルの計算量で（適切な細胞数を含む）を細胞ペレットを再懸濁します。発泡回避し、マウスは注射用に調製されるまで、氷上で15 mlのチューブに残すように穏やかに混合。 </li></ol> 4.マウスの準備<ol><li> 3％イソフルランプラス誘導室中の3％O 2で5分間1 SCIDマウスを麻酔。一度に、1つの実験群、または2匹のマウスに焦点を当てています。 </li><li>誘導チャンバーからマウスを外しダウン加熱パッド腹側の場所と迅速麟蹄全体に麻酔を供給するために、非再呼吸システムを介してマウスの顔に鼻ノズルを取り付けますction手順。非再呼吸系に導入室からのガスの流れを切り替えて、1.5％イソフルランおよび1.5％O 2ガスの圧力を低下させます。 </li><li>シェーバーや脱毛クリームで（直径1cm前後）両側後肢領域から髪を削除します。 </li><li> 70％のアルコールパッドで皮膚領域を拭いてください。 </li><li>誘導チャンバーにマウスを戻し、リピートは4.2手順 - 4.4を2番目のマウスで。 </li></ol> 5.マトリックスゲル注入<ol><li>非再呼吸システムに付着し、加熱パッド上腹側を下に置くことによって、注射用1マウスを準備します。 </li><li>一度に予備冷却し28 G 1 ccのインスリン注射器1のマウスにマトリックスゲルをロードします。 <ol><li>注射器に2つのプラグ（200プラグあたりμlのプラス25％余分な）のためのマトリックスゲルの完全な500μlのボリュームをロードします。 </li><li> CEを防止するために、シリンジ内に細胞をロードする3分以内にマウスにマトリックスゲルを注入することを確認します注射器の側に沈降し、注射器の内側に固化からマトリックスゲルを防ぐためにからLLS。 </li></ol></li><li>その後、胸郭の背面後部の皮下空間にゆっくりと均等にマトリックスゲルの200μLを注入し、皮下スペースを見つけるために背中の皮膚を持ち上げます。 </li><li>注射部位から漏れるマトリックスゲルを防ぐために注意しながら、ゆっくりと注射針を外します。バンプは、注射部位に形成されます。アルコールパッドで注射部位を拭きます。 </li><li>その後、熱パッド上にマトリックスゲルのゲル化を可能にするために1分間の背中の上でマウスを残して、マウスの背中の反対側に5.5 - を繰り返し注入が5.2を繰り返します。 </li><li> 14日後にバンプを識別するための恒久的なマーカーを使用して、両方のバンプの概要を説明します。いくつかの髪が戻って成長した後、バンプを見つけることが容易になります。 </li></ol> 6.マトリックスゲルプラグの単離：注射後14日<ol><li>動物を暴露することによって、人道的にマウスを安楽死させます死を確実にするために頸椎脱臼に続く二酸化炭素吸入&gt; 5分秒。 </li><li>マウスの背中からマトリックスゲルプラグを取り外します。 <ol><li>ゆっくりとプラグはステップ4.3を繰り返して配置されている注射部位の周りに再成長の髪を削除します。マーカーラインは、皮膚の下に、元のバンプの大きさを示しています。 </li><li>それぞれ、プラグの上側と下側に取り付け、周囲の皮膚と筋肉層と一緒にプラグを切り出します。 <ol><li>微細手術用はさみを使用して、皮膚に対して垂直であり、プラグの下の筋肉にカットスループラグのマークされた境界に切り込みを入れます。その後、慎重にマークされた境界線に沿ってプラグの周囲にカット。 </li><li>それは、皮膚と筋肉の層の間に挟ま保ち、プラグを取り外します。すぐに余分な血液を洗い流すために、1×PBSを入れた小さなビーカーにすすいでください。プラグは（次のステップ、6.3）修正する準備ができました。 </li></ol></li></ol></li><li> PLUを修正しました。4％パラホルムアルデヒドでグラム。 <ol><li>揺動せずに室温で24時間、4％パラホルムアルデヒド25mlで50mlチューブに、皮膚と筋肉の層を含む全体のプラグを置きます。次の日は、パラフィン包埋の前に別の24時間の70％エタノール25ミリリットルにプラグを移します。 注：慎重にパラホルムアルデヒドを処理します。手袋を着用してください。 </li></ol></li></ol> 7.パラフィンプロセスマトリックスゲルプラグ<ol><li>パラフィン包埋のためにプラグを準備します。 <ol><li> 図1aに示すように、プラグを方向付けます。プラグの側が上を向いているとの両方の皮膚や筋肉の層が切片の間に第1切断される組織ブロックの表面全体に表示されるように、組織カセットにプラグインを配置します。 </li></ol></li><li>パラフィンは、標準的なパラフィン包埋プロトコール13に従ってプラグを埋め込みます。 </li><li>顕微鏡は、アコーをスライド上に組織ブロックのオフに10μmの厚さの切片およびマウント - 8をカット標準的なパラフィン切片プロトコル13丁。 </li><li>染色のための準備ができるまで室温で涼しく乾燥した場所にスライドを保管してください。 </li></ol>ヘマトキシリンおよびエオシン染色（H＆E）13 8.ステインセクション<ol><li>二回、100％エタノール、95％エタノール、70％エタノールおよび最後に1×PBS 100％キシレンを介してスライドを通過させることによって、室温で5分間、各組織切片を脱パラフィンで処理します。次のステップになるまで1倍PBSでスライドを残します。 </li><li>ピペットで100μlのH＆Eセクションへのソリューションと1のためのインキュベート - 5分、または10倍の倍率で直立光顕微鏡下で観察されるような細胞内の青色の核とピンクの細胞質の間に明確なコントラストがあるまで。任意のH＆Eソリューションは、目的を触れないように注意してください。 </li><li>水道水の大ビーカーでスライドを液体につけることによって、スライドのオフウォッシュH＆Eソリューションは、その後、ビーカー内のラックにスライドを配置し、2分間流水と面一に。 </li><li>モースライドをマウントする9.8ステップにVEの。 </li></ol> 9.ヒトキャピラリと周皮細胞染色する他のスライド<ol><li>二回、100％エタノール、95％エタノール、70％エタノールおよび最後に1×PBS 100％キシレンを介してスライドを通過させることによって、室温で5分間、各組織切片を脱パラフィンで処理します。次のステップになるまで1倍PBSでスライドを残します。 </li><li>抗原回復溶液中のセクションをゆでます。 <ol><li> 2Lのビーカーに、加熱ブロック上で95℃で1×クエン酸緩衝液（pH7.0）を使用して沸騰抗原回復溶液を調製します。 </li><li>沸騰したら、金属ラックにスライドを配置し、20分間沸騰抗原回復溶液中に浸します。 </li><li>慎重にまだ沈めスライドと加熱ブロックからビーカーを取り除き、溶液をゆっくり約30分間室温に戻すことができます。 </li><li>次のステップになるまで1倍PBSでスライドを置きます。 </li></ol></li><li>ブロッキング緩衝液中のセクション（1×PBS、5％ヤギ血清、0をブロック.3％のTriton X-100）。 <ol><li> PAPペンで各セクションのエッジの周りに疎水性の円を描きます。 </li><li>トレイの底に蒸留水で湿度トレイにスライドを配置します。 </li><li>必ずすべての組織を作るのセクションの上にピペットで100μlのブロッキングバッファーを流体によって覆われている（以上100μlのが必要な場合があります）。 </li><li> 1時間、ブロッキングバッファーを持つセクションをインキュベートします。 </li></ol></li><li>一次抗体を持つセクションをインキュベートします。 <ol><li>各CD31（ECS）のためのセクションおよび希釈緩衝液（1×PBS、1％BSA、0.3％トリトンX-100）で希釈した平滑筋アクチン（周皮細胞）を精査するために、2つの一次抗体で1溶液を調製します。 注記：ここでは、抗CD31濃度1:50であり、抗平滑筋アクチン濃度は1：300。 </li><li>蒸留水を含む湿度トレイに100μlの一次抗体と4℃で一晩のセクションをインキュベートします。 </li></ol></li><li> 1×PBST（1×PBS + 0.1％TWEでスライドを3回洗浄各5分洗浄用EN20）。 </li><li>二次抗体を持つセクションをインキュベートします。 <ol><li>希釈緩衝液中に希釈した抗CD31ウサギ抗体を認識し、フルオロフォアコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体を含む溶液を調製します。 <ol><li>注：平滑筋アクチン一次抗体は、すでにCY3フルオロフォアとコンジュゲートされているので、二次抗体染色は必要ありません。 250：ヤギ抗ウサギ二次抗体濃度は1です。 </li></ol></li><li>蒸留水を含む湿度トレイに100μlの二次抗体と1時間のセクションをインキュベートします。 </li></ol></li><li>各洗浄5分間、1×PBSTでスライドを3回洗浄します。 </li><li>スライドをマウントします。 <ol><li>各セクションへのDAPI核染色と退色防止マウントソリューションの - （60μL〜40） - ピペット2 3滴。 </li><li>優しくなしを配置し​​ます。 1.5カバーセクションの上にスリップし、マウントソリューション、流体はセクションに広がるすることを可能にするとの縁へカバースリップ。ゆっくりセクションの上に配置することができる気泡を押し出すために指を使用しています。 </li><li>スライドを取り扱う前に、少なくとも1時間乾燥させます。 </li></ol></li></ol> 10.定量化毛細血管密度と構造14 <ol><li> H＆E染色切片における毛細血管の数をカウントし、＃/ mm 2のように表します。 <ol><li> 40Xの倍率で直立光顕微鏡上の4つの異なるフィールドの写真を取得します。 注：キャピラリーは赤血球で満たされた管として識別されます。 </li><li>あるいは、代わりに手動で計数キャピラリーの使用画像解析ソフトウェア（ 例えば、Wimasis画像解析）は、血管数、平均血管長及び直径、および分岐点のような種々の血管形成のパラメータを定量化します。 </li></ol></li><li>免疫蛍光染色した切片に毛細管構造を分析します。 <ol><li>倒立蛍光顕微鏡上の4つの異なるフィールドの写真を買収FITCとTxRedフィルターキューブを持ちます。 <ol><li> 488 nmの波長で励起することにより、画像のECへのFITCキューブを使用し、594 nmの波長で励起することにより、画像の周皮細胞へのTxRedキューブを使用しています。 <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; 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			</style></li></ol></li></ol></li></ol>

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マトリックスゲルプラグアッセイは、血管形成、in vivoでの血管新生および抗血管新生化合物における遺伝子調節を評価するため、およびインビトロ試験を補完するために便利で強力な方法であることが証明されています。ここでは、詳細には血管形成中の内皮細胞と周皮細胞との間の相互作用を調べ、ヒト血管新生の新規マトリックスゲルプラグアッセイを記述する。 このプロトコルにはいくつかの新規かつ重要なステップがあります。低継代（継代1から4）の細胞は若い細胞は、14日間の実験設定の際に、より実行可能になるので好ましいです。使用される内皮細胞の数が最小のもの百万および周皮細胞に対するECの比率が5：1です。しかしながら、増加した周皮細胞の数は、毛細管へのカバレッジを強化します。単独で内皮細胞の実験群については、注入した細胞の総数は120万である内皮細胞および周皮細胞の和、である必要があり、そのためのeは、プラグあたりの総細胞数は一貫しています。細胞数とマトリクスゲル体積の適切な量を計算することが重要です。基本式は、マトリックスゲルの200μlの1.2万個の細胞です。ま...

血管新生は、新しい血管が既存の血管ネットワーク1から形成されるプロセスであり、正常な発達、疾患の範囲の多くの地域を横切って進行中の研究の焦点です。この動的なプロセスは、酸素や栄養素デリバリー2を必要とするサイトに向けられている血管の管を構築するために、内皮細胞（EC）および周皮細胞の動員の増殖および移動を伴います。このプロセスを研究するためには、管形成の3次元性を再現することができます1、最も重要なのは、同じように動的分析を必要とします。 in vitroでの3Dマトリックスアッセイは、この必要性に対処するために開発されており、研究者は、血管新生が生じ3、4、5、6をとる空間および時間における個別のステップを定義することができるように十分に取り組んできました。しかし、これらのインビトロ 3Dマトリックスモデルは、非灌流血管研究に限られていますdは、したがって、血管新生プロセスに関連する重要なコンポーネントが不足している（ 例えば、血管床を横切って成長と阻害因子、不自然なテンション/力を循環させる）と、生きている組織に存在する複雑な環境をシミュレートすることができません。この制限に対処するために、いくつかのin vivoでの血管新生アッセイは、当社の報告書8、9の焦点になるマトリックスゲルプラグアッセイを含む、7を開発されてきました。 マトリックスゲルプラグアッセイは、血管新生に異なる細胞や物質の役割をテストするための堅牢なプラットフォームを提供するので、研究者にアピールする十分に確立されたin vivoでの血管新生アッセイです。マトリックスゲルは、37℃でゲル状物質に固化エンゲル-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞株によって分泌される市販の基底膜溶液です。マトリックスゲルは、細胞および/またはそのような成長因子、および麟蹄などの物質と混合することができますマウスに皮下CTED。ホストのECは、14日間にわたってプラグに侵入血管網を形成し、宿主の血液で灌流になります。現在までに、マトリックスゲルプラグアッセイこのアッセイは、に共培養内皮細胞および周皮細胞を使用することができるかどうかを決定するために努力がまだ行われていない我々の知る限り、しかし、血管形成中の内皮細胞の挙動の研究にのみ焦点を当てていますこれら2つの細胞型は、血管新生の間にどのように相互作用するかを研究します。具体的には、ECおよび周皮細胞との間の関係を理解することは、血管の損失は微小血管虚血および末梢血管疾患10、11、12を含む、病理学的である疾患を研究するための貴重なものです。 ここでは、ヒトECおよび線維芽細胞成長因子（bFGF）と共にマトリックスゲル混合物にヒト由来周皮細胞を導入するプロトコルを記載しています。次いで、この混合物を皮下I注射することができますnはSCIDマウスの背は、完全に機能的な、周皮細胞被覆され、ハイブリッド血管の形成を可能にします。私たちのプロトコルが持つまたはSCIDマウスとどのように重要な血管新生エンドポイントの組織切片を分析するために人間の周皮細胞、配置があってもなくても、人間のECを含むマトリックスゲルプラグを準備する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>PBS(リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞培地(ECM)キット</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>には、培地、EC成長サプリメント、ペニシリン/ストレプトマイシンが含まれており、それぞれに適切な容量で供給され、簡単に混合できます</td></tr><tr><td>Pericyte Media(PM)キット</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>培地、周皮細胞増殖サプリメント、ペニシリン/ストレプトマイシンを含み、それぞれが適切な量で供給され、</td></tr><tr><td>一次ヒト肺微小血管内皮細胞</td>を簡単に混合できます <td>肺高血圧症ブレークスルーイニシアチブ</td><td></td><td>この細胞タイプは市販されています。継代で使用される細胞 1-4</td></tr><tr><td>初代ヒト肺周皮細胞</td><td>肺高血圧症ブレークスルーイニシアチブ</td><td></td><td>この細胞タイプは市販されていませんが、脳の葉状細胞は入手可能です。&nbsp;継代1-4</td></tr><tr><td>bFGF(塩基性線維芽細胞成長因子)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>ストック溶液で使用される細胞は50 &mu;PBS中の0.1%BSA中のg / ml、50 &muのアリコート;l -20°Cで保存</td></tr><tr><td>マトリゲル基底膜マトリックス</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Insluin Syringe</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Severe Combined Immune Deficiency) マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>5557</td><td>NOD.SCID IL2Rガンマノックアウト株が最適な株です。生後4-6週</td></tr><tr><td>1.5 ml 微量遠心チューブ、滅菌済み</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 ml スクリュートップチューブ、滅菌済み</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>PAP ペン</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>8899</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>ナイア脱毛クリーム</td><td>ウォルマート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD31 一次抗体</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B4737</td><td>ワーキング ソリューションは 1:50</td></tr><tr><td>抗ヒト Smooth Muscle actin CY3 一次蛍光抗体</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>ワーキング ソリューションは 1:300</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ二次抗体; 488/green</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>ワーキング ソリューションは 1:250</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI ソリューション</td><td>セルシグナリング</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>no. 1.5 カバー スリップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸バッファー 10x</td><td>ミリポア</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td>極細手術用ハサミ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン (パラホルムアルデヒド)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュカセット</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

血管新生は、既存の血管から新しい血管が形成されるプロセスです。新しい血管の成長には、内皮細胞の増殖、遊走、および尿細管構造を形成するための調整されたアライメントと、壁面のサポートを提供し、血管の成熟を促進するための周皮細胞の動員が必要です。現在のin vitro細胞培養アプローチでは、内皮細胞と周皮細胞が相互作用して機能的な血管を産生する複雑な生物学的環境を完全に再現することはできません。私たちは、重症複合免疫不全突然変異(SCID)マウスを使用して、内皮-周皮細胞相互作用と機能血管の形成を研究するためのin vivoマトリックスゲルプラグアッセイの新しいアプリケーションを紹介します。簡単に説明すると、マトリックスゲルを周皮細胞の有無にかかわらず内皮細胞を含む溶液と混合し、続いて麻酔をかけたSCIDマウスの背中に注射します。14日後、マトリックスゲルプラグを取り外し、固定し、組織学的分析のために切片化します。成熟血管の周皮細胞被覆の長さ、数、サイズ、および範囲(内腔内の赤血球の存在によって定義される)は、市販の統計プラットフォームを使用して定量化し、実験グループ間で比較できます。血管新生アッセイとしての使用だけでなく、このマトリックスゲルプラグアッセイは、遺伝研究の実施や創薬のプラットフォームとして使用できます。結論として、このプロトコルにより、研究者は、内皮-周皮細胞の相互作用と、全身または肺の血管新生への関連性を研究するための利用可能なin vitroアッセイを補完することができます。

マトリックスゲルプラグ部は、図に示されているのECおよび周皮細胞の両方を含むプラグが、いくつかの灌流を表示するのに対し、代表的H＆Eおよび免疫蛍光染色は、ECからの2セクションは唯一のプラグは、主に血液で灌流されていないいくつかの船（左図2トップ、黒矢印）を表示しますCD31陽性のECのすぐ隣に正のSMA染色により証明されるように、より大きな直径および完全な周皮細胞被覆を持つ船、。これらの結果は、周皮細胞は、新生血管形成において重要な役割を果たし、この動的プロセスは再現し、容易にin vivoモデルで分析することができることを示唆しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54617/54617fig1.jpg" /> 組織カセットに埋め込まれたとき1.組織の向き...

私たちは、マトリックスゲルプラグ血管新生アッセイの変動を用いて、マウスにおけるヒト内皮 - 周皮細胞の相互作用を研究するためのプロトコルを提示します。

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

このin-vivoマトリゲルアッセイの全体的な目的は、内皮細胞と寄生虫の相互作用を調査することです。このマトリゲルアッセイは、血管新生における主要な段階を研究することを目的として設計されています。また、血管形成の主要な段階を担うシグナル伝達経路の特定や、機能不全が血管疾患やその他の血管新生異常につながる遺伝子の特定を可能にします。この手法の主な利点は、内皮細胞とその支持細胞であるペリサイトの両方が関与する生体内での血管形成を研究できることです。まず、100 mmプレートを用いて、10 mLの適切な培地でヒト内皮細胞およびペリサイトの培養を行います。細胞が80%コンフルエントに達するまで、2〜3日ごとに培地を交換してください。細胞と混合するためのマトリックスゲル溶液を調製するため、マトリックスゲルのストックを4°Cで一晩解凍します。次に、長期保存用として-20°Cで、または2週間までであれば4°Cで保存するために、1.5 mLずつ分注します。実験用プラグ1つにつき、200 µLのマトリックスゲルが必要となります。したがって、保存チューブ1本で25%の余裕を持って6個のプラグに供給可能です。解凍した100x beta-FGFストックを15 µL添加し、使用に必要な各分注液を調製します。ピペッティングによってbeta-FGFを溶液中に混ぜ合わせ、細胞を添加する前に氷上で少なくとも30分間インキュベートします。この時点で、注入に使用する28ゲージの1ccインスリン用注射器を冷却しておきます。培養プレートから細胞を回収するため、培地を除去し、PBSで細胞を1回洗浄します。PBSを除去した後、1mLのトリプシン溶液を加え、プレートをインキュベーターに戻して1分間静置します。次に、細胞を剥離させるために2 mLの培地をプレートにピペッティングし、その培地を15 mLチューブに回収します。続いて、ヘモサイトメーターを用いて回収した細胞の濃度を確認します。その後、15 mLチューブに細胞を分注してアリコートを調製します。実験群には、100万個の内皮細胞と20万個の寄生虫を組み合わせて使用します。次に、細胞分注液を400gで5分間遠心分離します。その後、計算した量のマトリックスゲルを細胞ペレットに加え、気泡が入らないよう、泡立てないように緩やかにピペッティングして混ぜ合わせます。マウスに注射ができるまで、調製物を氷上で保持します。イソフルランでマウスを麻酔し、足指へのピンチ刺激で麻酔状態を確認した後、イソフルランを供給する非再呼吸システムに接続し、腹側を下にしてヒーティングパッドの上に置きます。次に、両後肢の外側領域から約1平方センチメートルの被毛を除去します。次に、露出した皮膚を70% alcoholで拭いて清浄にします。続いて、準備した細胞懸濁液1 mLを冷却したシリンジに充填します。これは4つのプラグ分に相当します。注入を行う際は、背中の皮膚を持ち上げて皮下腔を確認します。次に、肋骨後方の皮下空間に200 µLをゆっくりと均等に注入し、液漏れを防ぎながらゆっくりと針を抜きます。注入後、注入部位に隆起が生じます。その部位をアルコールで拭き、後で特定できるように油性マジックで隆起を囲んで印を付けます。次に、マウスの反対側で同様に注入手順を繰り返します。細胞がシリンジに付着し始めるため、必ず3分以内にすべての細胞を注入してください。マトリックスゲルのプラグが皮膚と筋肉の層の間に形成され、プラグが良好な形状を維持し、拡散しないようにするためには、この注入ステップを正確に行うことが極めて重要です。次のマウスに注射を行う前に、注入したマトリックスがゲル化する時間を確保するため、注射したマウスをヒートパッドの上に1分間置いておきます。安楽死させた後、マウスを操作台にセットします。注射部位から再生した毛を除去し、プラグの位置を示すマーカーラインを確認します。次に、精細な外科用鋏を用いて、皮膚に対して垂直に、かつ下の筋肉まで達するように、プラグの印を付けた境界に沿って切開します。印を付けた境界の外周を慎重に切り取ります。その後、皮膚層と筋肉層で挟むようにしてプラグを取り出します。直ちに、少量のPBSを入れた小さなビーカーでプラグをすすぎ、血液を除去します。次に、プラグ全体を25 mLの4%パラフォルムアルデヒドが入った50 mLチューブに入れます。撹拌せずに、室温で24時間固定させます。翌日、プラグを25 mLの70%エタノールに24時間移します。その後、パラフィン包埋を行います。内皮細胞のみを含むプラグの切片により、生体内で14日が経過した後、一部の血管に宿主の血液が灌流されていないことが示されます。対照的に、内皮細胞と寄生虫の両方を含むプラグは、in-vivoで14日後に多くの灌流血管を示します。これらのプラグでは、緑色に染まったCD31陽性の内皮細胞に隣接して、赤色に染まった平滑筋アクチン染色陽性の細胞が認められます。したがって、寄生虫は初期の血管形成において重要な役割を果たす可能性があります。このビデオを視聴することで、複数の細胞型における血管形成を研究するために、この強力なin-vivo手法をどのように適用するかを十分に理解できるはずです。この手法は、研究者がマウスモデルを用いて血管生物学のさまざまなトピックを探索するための道を切り開くものです。この手順に続き、定量PCRやウェスタンブロットなどの他の手法を実施することで、遺伝子発現の変化やプロテオミクスなどのさらなる疑問に答えることも可能です。この強力な手法を用いることで、血管形成時における内皮細胞と寄生虫のin-vivoでの相互作用を研究することが可能になります。これは血管新生における重要な段階です。また、この強力な手法は、肺高血圧症などの血管疾患の理解に関連する他の細胞間相互作用の研究にも活用できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここで、我々は、ヒト臍帯血由来内皮コロニー形成細胞（ECFCs）と皮下免疫不全マウスへのコラーゲン/フィブロネクチンゲルに埋め込まれている骨髄由来間葉系幹細胞（MSCs）を、、実現する方法論を説明します。このセル/ゲルの組み合わせは、マウスの血管系に接続する人間の血管ネットワークを生成します。...

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このビデオでは、リポ多糖を腹腔内に注入したマウスモデルの腸間膜静脈における血液細胞と内皮の相互作用をリアルタイムで可視化する方法を示します。...

炎症マウスモデルにおける血球-内皮相互作用を分析するための生体内顕微鏡法

アン<em生体内で&gt;</em血管透過性をテストする&gt;アッセイ

内皮グリコカリックス/内皮表面層は、理想的には生体顕微鏡を用いて研究されています。生体顕微鏡検査は、肺などの臓器に移動技術的に困難である。私たちは、同時明視野と蛍光顕微鏡を自由に移動させる際に内皮表面層の厚さを推定するために使用することができる方法を示してい...

マウス肺内皮表面層の in vivo測定における

ここでは、血管の炎症や生きたマウスにおける血栓形成の間に活性化内皮上の異血小板、好中球の相互作用を可視化する蛍光生体顕微鏡の実験手法を報告する。この顕微鏡技術は、血管疾患の分子メカニズムを研究することが、病態生理学的な条件下での薬理学的薬剤をテストするためにも役立ちます。...

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

私たちは、超音波と内視鏡検査という2つの補完的なイメージングモダリティを使用して、癌細胞によって分泌される因子のプールの血管新生の可能性を説明するためのマトリゲルプラグアッセイについて説明します。細胞外マトリックス(ECM)模倣ゲルであるマトリゲルは、コンディショニング培地(C.M.)に分泌される血管新生因子を宿主(マウス)に導入するために使用されます。...

急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態

この原稿は、制御された環境で内皮細胞のチューブ形成を使用して、特定の化合物または状態が血管新生に及ぼす影響を定量化するチューブ形成アッセイについて説明しています。...

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

新規体外ビーズ アッセイをこのプロトコルより適切に体内の血管を組み込むことによって血管新生を萌芽の過程をモデル化します。この変更により、血管内皮細胞と血管新生に重要な壁画と有性の細胞間相互作用をより忠実に再現するビーズ...

ペリサイトの発芽アッセイ内皮細胞ビーズを組み込む

この方法の目的は、その後の細胞アッセイのための天然足場として線維芽細胞由来の3D行列を得る。線維芽細胞は、前処理された培養プレートに播種され、マトリックス生成のためにアスコルビン酸で刺激される。マトリックスは、脱細胞化され、関連する細胞(例えば、内皮細胞)を培養するために遮断される。...

内皮管形成アッセイに適用可能な線維芽細胞由来3Dマトリックスシステム

このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in...

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

ここで紹介する方法は、in vivo...

血管新生研究のための改変 In Vivo マトリックスゲルプラグアッセイ

学ぶマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮細胞と周皮細胞のin vivo相互作用の研究方法。血管形成におけるシグナル伝達経路の同定と血管障害関連遺伝子の探索に応用できます。

マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で

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