マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で

このin-vivoマトリゲルアッセイの全体的な目的は、内皮細胞と寄生虫の相互作用を調査することです。このマトリゲルアッセイは、血管新生における主要な段階を研究することを目的として設計されています。また、血管形成の主要な段階を担うシグナル伝達経路の特定や、機能不全が血管疾患やその他の血管新生異常につながる遺伝子の特定を可能にします。

この手法の主な利点は、内皮細胞とその支持細胞であるペリサイトの両方が関与する生体内での血管形成を研究できることです。まず、100 mmプレートを用いて、10 mLの適切な培地でヒト内皮細胞およびペリサイトの培養を行います。細胞が80%コンフルエントに達するまで、2〜3日ごとに培地を交換してください。

細胞と混合するためのマトリックスゲル溶液を調製するため、マトリックスゲルのストックを4°Cで一晩解凍します。次に、長期保存用として-20°Cで、または2週間までであれば4°Cで保存するために、1.5 mLずつ分注します。実験用プラグ1つにつき、200 µLのマトリックスゲルが必要となります。

したがって、保存チューブ1本で25%の余裕を持って6個のプラグに供給可能です。解凍した100x beta-FGFストックを15 µL添加し、使用に必要な各分注液を調製します。ピペッティングによってbeta-FGFを溶液中に混ぜ合わせ、細胞を添加する前に氷上で少なくとも30分間インキュベートします。

この時点で、注入に使用する28ゲージの1ccインスリン用注射器を冷却しておきます。培養プレートから細胞を回収するため、培地を除去し、PBSで細胞を1回洗浄します。PBSを除去した後、1mLのトリプシン溶液を加え、プレートをインキュベーターに戻して1分間静置します。

次に、細胞を剥離させるために2 mLの培地をプレートにピペッティングし、その培地を15 mLチューブに回収します。続いて、ヘモサイトメーターを用いて回収した細胞の濃度を確認します。その後、15 mLチューブに細胞を分注してアリコートを調製します。

実験群には、100万個の内皮細胞と20万個の寄生虫を組み合わせて使用します。次に、細胞分注液を400gで5分間遠心分離します。その後、計算した量のマトリックスゲルを細胞ペレットに加え、気泡が入らないよう、泡立てないように緩やかにピペッティングして混ぜ合わせます。

マウスに注射ができるまで、調製物を氷上で保持します。イソフルランでマウスを麻酔し、足指へのピンチ刺激で麻酔状態を確認した後、イソフルランを供給する非再呼吸システムに接続し、腹側を下にしてヒーティングパッドの上に置きます。次に、両後肢の外側領域から約1平方センチメートルの被毛を除去します。

次に、露出した皮膚を70% alcoholで拭いて清浄にします。続いて、準備した細胞懸濁液1 mLを冷却したシリンジに充填します。これは4つのプラグ分に相当します。注入を行う際は、背中の皮膚を持ち上げて皮下腔を確認します。

次に、肋骨後方の皮下空間に200 µLをゆっくりと均等に注入し、液漏れを防ぎながらゆっくりと針を抜きます。注入後、注入部位に隆起が生じます。その部位をアルコールで拭き、後で特定できるように油性マジックで隆起を囲んで印を付けます。

次に、マウスの反対側で同様に注入手順を繰り返します。細胞がシリンジに付着し始めるため、必ず3分以内にすべての細胞を注入してください。マトリックスゲルのプラグが皮膚と筋肉の層の間に形成され、プラグが良好な形状を維持し、拡散しないようにするためには、この注入ステップを正確に行うことが極めて重要です。

次のマウスに注射を行う前に、注入したマトリックスがゲル化する時間を確保するため、注射したマウスをヒートパッドの上に1分間置いておきます。安楽死させた後、マウスを操作台にセットします。注射部位から再生した毛を除去し、プラグの位置を示すマーカーラインを確認します。

次に、精細な外科用鋏を用いて、皮膚に対して垂直に、かつ下の筋肉まで達するように、プラグの印を付けた境界に沿って切開します。印を付けた境界の外周を慎重に切り取ります。その後、皮膚層と筋肉層で挟むようにしてプラグを取り出します。

直ちに、少量のPBSを入れた小さなビーカーでプラグをすすぎ、血液を除去します。次に、プラグ全体を25 mLの4%パラフォルムアルデヒドが入った50 mLチューブに入れます。撹拌せずに、室温で24時間固定させます。

翌日、プラグを25 mLの70%エタノールに24時間移します。その後、パラフィン包埋を行います。内皮細胞のみを含むプラグの切片により、生体内で14日が経過した後、一部の血管に宿主の血液が灌流されていないことが示されます。

対照的に、内皮細胞と寄生虫の両方を含むプラグは、in-vivoで14日後に多くの灌流血管を示します。これらのプラグでは、緑色に染まったCD31陽性の内皮細胞に隣接して、赤色に染まった平滑筋アクチン染色陽性の細胞が認められます。したがって、寄生虫は初期の血管形成において重要な役割を果たす可能性があります。

このビデオを視聴することで、複数の細胞型における血管形成を研究するために、この強力なin-vivo手法をどのように適用するかを十分に理解できるはずです。この手法は、研究者がマウスモデルを用いて血管生物学のさまざまなトピックを探索するための道を切り開くものです。この手順に続き、定量PCRやウェスタンブロットなどの他の手法を実施することで、遺伝子発現の変化やプロテオミクスなどのさらなる疑問に答えることも可能です。

この強力な手法を用いることで、血管形成時における内皮細胞と寄生虫のin-vivoでの相互作用を研究することが可能になります。これは血管新生における重要な段階です。また、この強力な手法は、肺高血圧症などの血管疾患の理解に関連する他の細胞間相互作用の研究にも活用できます。