治療のために血液網膜関門の違反と潜在的な薬を評価するための急性網膜モデル

低コストで、簡単に使用できる強力なシステムは、ヒスタミンにより誘発される血液網膜関門の違反を改善する可能性のある潜在的な治療法を評価するために確立されています。血管漏出、ミュラー細胞の活性化および神経突起の連続性は、損傷応答および潜在的薬物、リポキシンA4との逆転を評価するために利用されます。

このex vivoレチナールモデルシステムの全体的な目標は、血液神経関門の侵害を改善する薬剤をスクリーニングすることです。この方法は、神経変性疾患の分野におけるいくつかの重要な質問に答えることができます。たとえば、初期のイベントは何か、それらの患者の治療に役立つ薬をどのようにスクリーニングできるかなどです。この手法の主な利点は、低コストで使いやすく、高速で適応性が高いことです。

一般に、この方法に不慣れな人は、信頼性と再現性のあるデータの取得が優れたサンプルを生成するための技術的スキルに依存するため、苦労するでしょう。まず、商用ソースから入手したブタ網膜がここで使用されます。供給元から調達した後、眼球は4度または氷上に保ち、できるだけ早く処理する必要があります。

組織培養フードで解剖を開始するには、レンズの周りを切ってアイキャップを開きます。次に、ブラシを使用して、網膜を引っ張らずに、硝子体液をそっと取り除きます。ブラシを使用して網膜をカットエッジからそっと取り外し、視神経乳頭を露出させます。

かみそりで視神経を切断し、網膜を解放します。網膜をペトリ皿に移し、冷たいHBSSを使用して網膜を一度慎重にすすいでください。サンプルを氷上のHBSSに入れます。

次に、カミソリを使用して網膜を対称的に半分に切ります。治療が必要な場合は、網膜の半分を治療し、同じ網膜の残りの半分を処理してベースラインを設定し、動物の変化を補正する必要があります。サンプルを、ウェルあたり3ミリリットルの安定化媒体を含む6ウェルプレートに静かに移します。

5%の二酸化炭素を含む雰囲気のインキュベーターで、摂氏37度で30分間網膜を平衡化します。インキュベーション後、安定化培地を慎重に吸引し、ヒスタミンとLXA4を含む3ミリリットルの培地を各ウェルに加えます。サンプルをさらに1時間インキュベートします。

温かい滅菌PBSですすいだ後、各ウェルに3ミリリットルの4%PFAを加え、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、PFAを迅速に吸引し、サンプルをPBSで一度すすいでください。ウェルに10%のスクロースを加え、摂氏4度で2〜4時間インキュベートします。

次に、10%のスクロースを30%のスクロースに交換し、摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、1部の市販の凍結培地と2つの部の20%スクロースを混合して、作業用凍結培地を作ります。気泡が消えるまで、摂氏4度で一晩以上放置します。

翌日、30%ショ糖を作業用凍結培地と交換し、室温で5分間平衡化させます。平衡化後、各網膜を3ミリメートル×5ミリメートルの長方形にトリミングし、次に網膜スライスをアルミホイルのシリンダーに含まれる凍結媒体に入れて凍結します。切片化時に網膜の断面を提供するために網膜スライスが垂直であることを確認し、液体窒素で凍結します。

クライオスタット上の各ブロックを14ミクロンのスライスに切片にし、切片をスライドガラスに取り付けます。スライドは使用するまでマイナス80°Cで保管してください。免疫染色を開始するには、切片を5%ショ糖リン酸緩衝液(SPB)で洗浄します。

次に、切片をインキュベートし、室温で1時間バッファーをブロッキングすることにより、非特異的結合部位をブロックします。次に、切片を適切な一次抗体と1時間インキュベートします。1時間が経過したら、溶液を吸引し、切片を5%SPBで3回洗浄します。

次に、光から保護しながら、対応する二次抗体と切片を1時間インキュベートします。切片を5%SPBで3回洗浄した後、サンプルをDAPIを含む培地にマウントし、カバースリップで覆って顕微鏡用にサンプルを準備します。最後に、共焦点顕微鏡を使用して画像を撮影します。

プロセスの幅を測定するには、虫眼鏡ツールを使用して、プロセスが進行しているセクションの領域(外側の核層など)を選択します。次に、そのようなプロセスが目に見えて連続している光学場を選択します。メインメニューの解析ツールをクリックし、サブメニューのスケール設定をクリックして、微視的な設定に従ってスケールバーを設定します。

メインメニューでライン機能を選択し、プロセスを横切る線を引きます。メインメニューの「解析」をクリックし、サブメニューの「測定」をクリックして、測定を実行します。プロセスの連続性を分析するには、メインメニューに戻り、ポリゴン機能を使用して、関心のある領域として内側のプレキシフォームレイヤーを選択します。

[分析] をクリックし、[測定] をクリックして、面積を測定します。「処理」、「フィルター」、「バリアント」の順にクリックし、各ピクセルをその近傍バリアントに置き換えて画像のエッジを強調します。次に、画像をクリックしてコントラストと明るさを自動的に調整し、明るさとコントラストを調整し、サブメニューの[自動]をクリックします。

次に、線を数えます。これらの画像では、IGGの免疫反応性が赤で見られます。対照群では、IGG は血管内で制限されています。

ヒスタミン群では、IGGは血管から検出され、点線の円で示される漏出雲を形成します。LXA4 治療群では、IGG は再び血管内で制限されます。LXA4をさらに添加すると、ヒスタミンによって誘発される血管の機能が回復します。

このヒストグラムは、テストされたグループ全体で漏れている血管の割合を示しています。これらの画像では、Muller 細胞を染色する GFAP の免疫染色が示されています。ポジティブ染色は、ミュラー細胞のプロセス、網膜全体、および血管周囲で得られます。

すべてのグループからのMullerセルプロセスの幅が表示されます。ヒスタミンまたはLXA4のみで処理すると、プロセス幅が狭くなります。しかし、両方の試薬を一緒に塗布すると、プロセス幅が救われました。

これらの画像では、MAP2の免疫染色が示されています。神経節細胞の突起および細胞体からの陽性染色が観察されます。すべてのグループからの連続的なMAP2陽性神経節細胞プロセスの密度が示されています。

ヒスタミンによる治療は樹状突起プロセスの連続性を低下させますが、LXA4は有意な影響をもたらさない。一度習得すると、この実験は、適切に実施されれば、網膜ごとに5分、治療に6分、その後の切片化、免疫染色、および分析で3〜5日で行うことができます。この手順を試みるときは、新鮮な組織と適切なコントロールを使用することが重要です。

この手順に続いて、ライブイメージングなどの他の方法を追加して、カルシウムとミトコンドリアの特性レベルのリアルタイムな変化を追跡することができます。このビデオを見れば、このex vivo急性網膜培養モデルの使用方法、BRB機能障害の作製方法、損傷の評価方法、および潜在的な薬剤のスクリーニング方法について十分に理解できるはずです。ご覧いただき、ありがとうございました。