Name: 治療のために血液網膜関門の違反と潜在的な薬を評価するための急性網膜モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶ血液網膜関門違反の治療薬スクリーニング法。豚網膜を用いた低コストで効率的なex vivoモデルにより、血管漏出やMüller細胞活性化を評価し、神経変性疾患の早期メカニズム解明に貢献します。

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Bringhurst Meats(ニュージャージー州ベルリン)は、豚の目玉を提供する彼らの真の助けとして認められています。

すべてのプロトコルは、施設内動物管理使用委員会該当する場合のポリシーに準拠して実施しました。 1.準備<ol><li> 75％のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で安定化媒体を準備し、25％ハンクス平衡塩溶液（HBSS）。使用するまで-20℃でアリコートとストア、よく混ぜます。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備し、オートクレーブで滅菌します。溶液を室温で保管してください。実験（ウェル当たり5ミリリットル）の前に37℃にPBSを温め。 </li><li> PBS中の10％、20％および30％スクロースを準備します。殺菌のための独立した0.22μmのフィルターの上、個別にすべてのソリューションをフィルタリングします。 4℃でのソリューションを保存します。 </li><li> 90 mMの濃度にPBS中のヒスタミン原液を準備します。 0.22μmのフィルターを介して濾過することにより溶液を滅菌します。小分けし、-80℃で溶液を保存します。複数の凍結と融解の繰り返しは避けてください。 </li><li>実験の前に、PBS中の新鮮な4％パラホルムアルデヒド（PFA）を確認します。氷の上に置きます。 注意：ドラフト内でPFAを維持し、適切な保護具を着用します。 </li><li>安定化媒体（網膜あたり20 ml）を解凍します。 100 U / mlの最終濃度になるようにペニシリン - ストレプトマイシンを追加します。実験前インキュベーターで37℃まで媒体の暖かい部分（網膜当たり15ミリリットル）。氷の上の媒体の残りの部分を残します。 </li><li>氷上でHBSS（網膜当たり10ミリリットル）を配置します。 </li></ol> 2.網膜器官培養<ol><li>組織培養フードにサンプルを転送します。レンズ周りを切断することにより、アイカップを開きます。ブラシを使用して、静かに網膜を引っ張ることなく、硝子体液を除去します。ゆっくりと視神経乳頭が露出するようにブラシで切断縁から網膜を切り離します。カミソリを伴う重度の視神経と網膜をリリース。 </li><li>ペトリ皿に網膜を転送し、慎重に冷HBSSを使用して一度網膜をすすぎます。私にHBSS中にサンプルを置き、CE。ステップ2.1と、この工程を繰り返すことにより、必要な数の網膜を解剖。 </li><li>かみそりで対称的に半分に網膜をカット。穏やかにウェル当たり安定培地3mlで6ウェルプレートにサンプルを移します。 5％CO 2を含有する雰囲気のインキュベーター中で37℃で30分間平衡化を可能にします。 </li><li>ステップ2.3でのインキュベーションの間に以下の試薬を準備し、暖かい培地中の所望の濃度（450μM）にヒスタミン原液を希釈します。 250 ngの/ mlの最終濃度まで培地にLXA4（アルゴン下で保存されている）を溶解します。 注：LXA4の効果を測定する場合、他の半分はLXA4でヒスタミンを用いているが、単一の網膜から半分は、単独でヒスタミンに使用されます。 </li><li>慎重に安定化媒体を吸引除去し、各ウェル（ウェル当たり3ミリリットル）に調製した培地を追加します。 5％CO 2を含有する雰囲気のインキュベーター中で1時間、37℃でサンプルをインキュベートします。 </li><li>リンス一度暖かい、滅菌PBS中のサンプル。 </li></ol> 3.免疫染色のためのサンプルを準備します<ol><li>プレートから吸引し、PBS。 4％PFA（ウェルあたり3 ml）を加え、室温で15分間インキュベートします。 </li><li>迅速PFAを吸引。一度PBSを用いてサンプルをすすぎます。 10％スクロースにサンプル（ウェルあたり5ミリリットル）に移し、4℃で2時間〜4インキュベートします。 </li><li> 30％スクロース（ウェル当たり5ml）中にサンプルを移し、4℃で一晩インキュベートします。作動凍結培地を作製するために、20％ショ糖の2つの部分を有する市販の凍結培地の一部を混合します。気泡が消えるまで、一晩以上4°Cでそれを残します。 </li><li>作動凍結培地にサンプルを移し、室温で5分間平衡化を可能にします。長方形（5ミリメートルによっておよそ3ミリメートル）にそれぞれの網膜をトリミングします。 </li><li>慎重に円筒状容器（約1cm半径×2センチ高さ）devの中に含まれる作業の凍結培地にサンプルを移しますアルミ箔からised。網膜のスライスは、液体窒素でそれらを凍結する（セクショニング時に網膜の断面を提供するように配向）垂直であることを確認してください。使用するまで-80℃でブロックを保存します。 </li><li>項各14μmの厚さのスライスにクライオスタット上のブロックとは、ガラススライド上のセクションをマウントします。使用するまで-80℃でスライドを保存してください。 </li></ol> 4.免疫染色<ol><li>一度、5％ショ糖リン酸緩衝液（SPB、PBS中の5％スクロース、pH7.4）でセクションを洗ってください。室温で1時間（10％正常ヤギ血清および0.5％トリトンX-100で5％SPB）をブロッキング緩衝液中で切片をインキュベートすることによって非特異的結合部位をブロックします。 </li><li> 1時間：（ブロッキング緩衝液中で500 1に希釈し、GFAPまたはMAP2、）適切な一次抗体を用いて（スライド上）のセクションをインキュベートします。ソリューションを吸引。 5％SPBで3回洗浄します。内因性のIgGを染色するために、このステップをスキップします。 </li><li>対応するseconを持つセクションをインキュベート1時間：DARY抗体（ブロッキング緩衝液中で800 1に希釈シアニン/ FITC結合ロバ抗マウス/抗ウサギIgG）。 </li><li> 5％SPB 3回で十分セクションを洗ってください。メディア取り付けDAPIを含有し、カバースリップで覆うことでそれらを実装することにより、顕微鏡用の試料を準備します。 </li><li>グループ間など 、滞留時間、値を得るため、このようなレーザ強度と同一のパラメータの下で20Xレンズを通して画像を取り込む、レーザー共焦点顕微鏡を使用して。 525分の488 nmのように（FITCを検出するために）785分の561 nmのように緑のチャンネルのために（シアニン3を検出するために）赤チャンネルのために、447分の408 nmのように（DAPIを検出するために）青チャネルの励起/発光波長を設定します。 </li></ol> 5.画像解析<ol><li>次の基準12に従って漏れやすい血管の割合を定量化：数のセクションの平面内の内皮細胞の核を有する血管のみを含めます。それはAGを示している場合は、血管漏出性を検討します容器の周囲の免疫染色のradient。 </li><li>発現レベルを決定するために、関心領域を選択し、画像解析ソフトウェアを用いて、平均グレー値を測定します。 </li><li>プロセスの幅を測定するために、プロセスが異なっている部分（例えば外核層、ONL）のエリアを選択します。そして、このようなプロセスが見えると連続している光学フィールドを選択します。 、微視的な設定に応じてスケールバーを設定し、プロセス全体に線を描画して、測定を行います。 </li><li>プロセスの継続性を分析するために、関心の選択領域は、その近傍の分散で、各ピクセルを置き換えることによって、画像のエッジを強化する分散と呼ばれるフィルタを適用し、自動的に、コントラストと明るさを調整する行をカウントし、カウントを正規化エリア。 </li><li> 両側スチューデントt検定を用いて統計的有意性を計算します。 *、P &lt;0.05。 **、P &lt;0.01。 ***、P &lt;0.001。 P平均±SEMとして多くの結果を。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このレポートでは、ブタ網膜を使用したBRB機能障害の強力なex vivo 急性網膜モデルを紹介します。このモデルシステムは特別な機器を必要とせず、ほとんどの実験室環境で簡単に適合させることができます。ただし、成功した結果を得るには、いくつかの手順に細心の注意を払う必要があります。ソースから眼球を入手した後、それらは4°Cまたは氷上に保たれ、できるだけ早く処理する必要があります。治療の効果を分析する場合、同じ網膜の 2 つの半分を使用する必要があります - 半分は実験手順 (ベースライン) のみによる変化を検出し、もう 1 つは治療の効果を検出します。このアプローチにより、年齢、性別、健康状態などの動物のバリエーションの修正も可能になります。 
このプロトコルは、 M. musculus や B. Taurus などのさまざまな種の網膜にうまく適用できます (データは示していません)。市販の豚の眼球を使用することは、動物の飼育と比較して大幅なコスト削減要因となります。さらに、この研究では、ヒスタミンとのインキュベーション時間はわず...

証拠の成長体は、血液網膜関門（BRB）1-5と血液脳関門（BBB）6,7との類似性が存在することをサポートしています。 BBBの妥協はしっかりと、このようなせん妄10として因果関係や、アルツハイマー病（AD）などの慢性神経変性疾患の診断マーカーとして8,9および急性の条件をリンクされています。潜在的な薬剤標的のためのこれらの病理と発見への機構的洞察は、一般的に脳​​の限られたアクセシビリティとネットワーク複雑さによって妨げられています。このようなin vivoイメージング11、脳の器官培養の12、初代細胞培養13,14と共培養システム15などの選択肢が生成されています。しかしながら、これらのモデルの多くは、細胞を同定するために特殊な器具、長い実験期間または複数のマーカーを必要とします。機能的および構造的BBBとBRBの間の類似性だけでなく、dyの間の相関関係2のsfunctionsは16-19を主張してきました。また、簡単にアクセス、明確に定義された細胞型および層状​​構造は、脳へのウィンドウとしてよく特徴付けられた網膜を許可しています。 BBB及びBRBの構造的および機能的な同一性を詳細に比較されていません。しかし、網膜の病状、特にBRBの違反は、またしっかりと糖尿病18-19とAD 21,22を含む、様々な疾患の進行と関連しています。したがって、機構を描写するだけでなく、潜在的な薬物をスクリーニングするだけでなく、BRBの機能不全システムを確立するために重要です。この報告書では、単純な急性網膜文化を使用して、BRBの機能不全を可能にするプロトコルが開発され、提示されています。 増加BBBの透過性およびAD様病理学的変化は、ヒスタミン、前炎症性メディエータ12とインキュベートし、脳の器官培養で確立されています。したがって、提示システムでは、ヒスタミンはAPPLましたBRBの機能不全を誘導するためにex vivoでの網膜培養をIED。このようなハツカネズミとボス牡牛座のようないくつかの種からの網膜は、テストされています。それらの商業的入手し、ヒト組織に似ていることに、新鮮な豚眼球はここで報告されたデータを提供するために利用されました。ヒスタミンおよび/ ​​または他の薬物とインキュベートした後、網膜は、免疫グロブリンG（IgG）、血液の主要なコンポーネントの1つとして、いくつかのタンパク質12の免疫染色による評価のために処理しました。グリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）、グリア活性化のための周知のマーカー。そして、微小管結合タンパク質2（MAP2）、微小管アセンブリのための不可欠なニューロン特異的細胞骨格タンパク質。さらに、網膜の層構造は、その幅と継続性の変化として、ミュラー細胞と神経節細胞のプロセスの詳細な分析を可能にします。このようにいくつかの追加のパラメータがの影響を評価するために利用可能ですBRB違反早い段階で、同様に潜在的な治療法の逆転の効果を評価します。 血管の漏れ（のBV）、グリア細胞の活性化および神経細胞の損傷応答：このプロトコルでは、スクリーニング薬の潜在的な反転効果は3つの観点から評価されています。いくつかの定量法は、例えば、免疫染色の強度、強調フィルタにより示される神経突起のプロセス及び連続の幅測定によって示される発現レベルを利用しています。より良い方法を説明するために、結果の解釈を助けるために、リポキシンA4（LXA4）、内因的炎症性損傷および減衰内皮機能不全23に対応して合成した化合物は、デモの目的のために選択されています。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>J.T.Baker</td><td>4072-05</td><td></td></tr><tr><td>ヒスタミン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>凍結媒体&nbsp;</td><td>トライアングルバイオメディカルサイエンス</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>ノーマルゴートセラム&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>GFAP抗体</td><td>ミリポア</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>MAP2</td>抗体 <td>EMD ミリポア</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC標識ロバ抗ウサギIgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3標識ロバ抗マウスIgG Jackson</td><td>ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>DAPI含有封入剤</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>レーザー共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス Ti顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>国立衛生研究所</td><td>1.45秒</td><td></td></tr></tbody></table>

治療のために血液網膜関門の違反と潜在的な薬を評価するための急性網膜モデル

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

血液網膜関門の破れを改善する可能性のある治療法を評価するために、低コストで使いやすく強力なモデルシステムが確立されています。炎症因子であるヒスタミンは、血管外のIgGの陽性染色を通じて、培養網膜の血管の完全性を損なうことが実証されています。ヒスタミン自体の影響と、リポキシンA4などの治療候補薬の効果は、IgG免疫染色による血管漏出、GFAP染色によるミュラー細胞の活性化、MAP2染色による神経細胞樹状突起の変化の3つのパラメーターを使用して評価されます。さらに、網膜の層状組織により、幅や連続性の変化など、ミュラー細胞と神経節細胞のプロセスを詳細に分析することができます。提示されているデータはブタ網膜培養のものですが、このシステムは複数の種に適用できます。したがって、このモデルは、網膜血管の完全性の低下がさまざまな細胞タイプに及ぼす初期の影響を調査し、治療の候補となる薬剤を評価するための信頼性の高いツールを提供します。

私たちは、ヒスタミンにより誘発されるBRBの侵害から保護する可能性のある潜在的な治療法を評価するため、低コスト、時間、効率的で使いやすいシステムを提案します。 IgGは対照網膜（ 図1A）で血管内に拘束されているが、モデルが正常に確立されたことを確認ヒスタミン曝露（ 図1B）の際に血管の外に漏れます。 LXA4は提示システムにおけるBRBの違反に対する薬剤のスクリーニングを実証するために選ばれました。 BRBの機能不全は、それ自体では有意な効果（ 図1C）を持っていないLXA4（ 図1D）、で処理して減衰されます。反転が漏洩血管の割合として定量化され、結果が（ 図1E）重要です。他の二つの網膜細胞型、ミュラーグリア細胞（ 図2）と神経節細胞（ <st...

低コストで、簡単に使用できる強力なシステムは、ヒスタミンにより誘発される血液網膜関門の違反を改善する可能性のある潜在的な治療法を評価するために確立されています。血管漏出、ミュラー細胞の活性化および神経突起の連続性は、損傷応答および潜在的薬物、リポキシンA4との逆転を評価するために利用されます。

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

このex vivo網膜モデルシステムの全体的な目的は、血液神経関門の破綻を改善する薬剤をスクリーニングすることです。この手法により、神経変性疾患分野における「初期にどのようなイベントが発生するのか」や「患者の治療に役立つ薬剤をどのようにスクリーニングできるか」といったいくつかの重要な疑問に答えることができます。本手法の主な利点は、低コストで使いやすく、迅速かつ適応性が高いことです。一般的に、この手法に不慣れな方は、信頼性と再現性のあるデータを得るために高品質なサンプルを作製する技術的スキルが必要となるため、苦労することがあります。まず、ここでは市販の豚網膜を使用します。供給元から入手した後、眼球は4°Cで保存するか、または氷上に保持し、できるだけ速やかに処理する必要があります。組織培養フード内で、水晶体の周囲を切開して眼蓋を開き、解剖を開始します。次に、ブラシを用いて、網膜を引っ張らないように注意しながら、硝子体液を慎重に除去します。さらにブラシを使用して、切開端から網膜をそっと剥離し、視神経乳頭を露出させます。カミソリで視神経を切断し、網膜を遊離させます。網膜をペトリ皿に移し、冷えたHBSSを用いて慎重に1回洗浄します。サンプルを氷上のHBSSに置きます。次に、カミソリを使用して網膜を対称的に半分に切断します。処置が必要な場合は、網膜の半分に処置を行い、同じ網膜のもう半分をベースラインの設定および個体差の補正に使用します。サンプルを、1ウェルあたり3 mLの安定化培地を入れた6ウェルプレートに静かに移します。5%二酸化炭素を含むインキュベーター内において、37°Cで30分間、網膜を平衡化させます。インキュベーション後、安定化培地を慎重に吸引し、ヒスタミンとLXA4を含む培地を各ウェルに3 mLずつ加えます。サンプルをさらに1時間インキュベートします。温めた滅菌PBSで洗浄した後、各ウェルに4% PFAを3 mL加え、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、速やかにPFAを吸引し、サンプルをPBSで1回洗浄します。ウェルに10% sucroseを加え、4°Cで2〜4時間インキュベートします。次に、10% sucroseを30% sucroseに置換し、4°Cで一晩インキュベートします。その後、市販の凍結保存液1部と20% sucrose 2部を混合し、作動凍結保存液を作成します。気泡が消えるまで、4°Cで一晩またはそれ以上の時間放置します。翌日、30% sucroseを凍結用作業溶液に交換し、室温で5分間平衡化させます。平衡化後、各網膜を3 mm × 5 mmの長方形に切り出し、アルミニウム箔で筒状に巻いた凍結用溶液の中に網膜切片を入れて凍結させます。切断時に網膜の断面が得られるよう、網膜切片を垂直に保持し、液体窒素中で凍結させます。クライオスタットを用いて各ブロックを14 micronの厚さで切片化し、ガラススライドに貼り付けます。スライドは使用まで-80 °Cで保存してください。切片を5% ショ糖リン酸緩衝液（SPB）で洗浄し、免疫染色を開始します。次に、切片とブロッキングバッファーを室温で1時間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックします。続いて、適切な一次抗体とともに切片を1時間インキュベートします。1時間経過後、溶液を吸引し、5% SPBで切片を3回洗浄します。次に、切片を対応する二次抗体とともに、遮光下で1時間インキュベートします。5% SPBで切片を3回洗浄した後、DAPIを含む封入剤で封入し、カバーガラスを被せて顕微鏡観察用の試料を調製します。最後に、共焦点顕微鏡を用いて画像を撮影します。突起の幅を測定するには、拡大鏡ツールを使用して、外核層など突起が存在する切片の領域を選択します。次に、そのような突起が可視であり、かつ連続している光学視野を選択してください。メインメニューの解析ツールをクリックし、サブメニューのスケール設定をクリックして、顕微鏡の設定に従ってスケールバーを設定します。メインメニューのライン機能を選択し、プロセスを横切るように線を引きます。メインメニューの「analyze」をクリックし、続いてサブメニューの「measure」をクリックして測定を行います。プロセスの連続性を解析するには、メインメニューに戻り、ポリゴン機能を使用して内網状層を関心領域として選択します。「Analyze」をクリックし、「Measure」を選択して面積を測定します。「Process」、「Filter」、「Variants」の順にクリックし、各ピクセルを近傍のバリアントで置き換えることで、画像のエッジを強調します。次に、「Image」、「Adjust」、「Brightness and Contrast」をクリックし、サブメニューの「Auto」を選択して、コントラストと明るさを自動調整します。次に、線をカウントします。これらの画像では、IGGの免疫反応性が赤色で示されています。コントロール群では、IGGは血管内に限定されています。ヒスタミン投与群では、IGGが血管外に検出されており、点線の円で示される漏出クラウドを形成しています。LXA4処理群では、IGGは再び血管内に限定されています。さらにLXA4を添加することで、ヒスタミンによって誘導された血管機能が回復します。このヒストグラムは、試験群における漏出のある血管の割合を示しています。これらの画像では、ミュラー細胞を染色するGFAPの免疫染色が提示されています。陽性染色は、網膜全域のミュラー細胞の突起および血管周囲に認められます。すべての群におけるミュラー細胞突起の幅を示す。ヒスタミンまたはLXA4単独での処理により、突起の幅は減少した。しかし、両方の試薬を同時に投与したところ、突起の幅は回復した。これらの画像には、MAP2の免疫染色結果が示されています。神経節細胞の突起および細胞体からの陽性染色が観察されます。すべての群における、連続したMAP2陽性神経節細胞突起の密度が示されています。ヒスタミンによる処理は樹状突起の連続性を低下させますが、LXA4には有意な影響は見られません。適切に行えば、この実験は習得後に3〜5日で完了させることが可能です。網膜1枚あたり解剖に5分、処理に6分を要し、その後、切片作成、免疫染色、および解析を行います。この手順を実施する際は、新鮮な組織を使用し、適切なコントロールを設けることが重要です。この手順に続き、ライブイメージングなどの他の手法を追加することで、カルシウムレベルやミトコンドリア特性のリアルタイムな変化を追跡することが可能です。このビデオを視聴することで、このex vivo急性網膜培養モデルを用いてBRB機能不全を誘発し、損傷を評価し、潜在的な薬剤をスクリーニングする方法について十分に理解できたはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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医学

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成体ラットにおける眼治療送達と高度な組織回収

学ぶ血液網膜関門違反の治療薬スクリーニング法。豚網膜を用いた低コストで効率的なex vivoモデルにより、血管漏出やMüller細胞活性化を評価し、神経変性疾患の早期メカニズム解明に貢献します。

治療のために血液網膜関門の違反と潜在的な薬を評価するための急性網膜モデル

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