での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ
2016年10月9日
皮膚からドレインリンパ節への細胞移動を追跡するためのマウスでのアッセイが説明されており、これにより、Bacille Calmette-Guérinによるフットパッド感染後にリンパ節に動員された皮膚樹状細胞の特性評価が可能になります。
この蛍光細胞トラッカーを用いたアッセイの全体的な目的は、BCG（Bacille Calmette-Guerin）を足底に感染させた後、皮膚から所属リンパ節へと遊走する特定の標的細胞集団をモニタリングし、その特性を明らかにすることです。我々はこの手法を用いて、皮膚へのBCG感染後に所属リンパ節へホーミングする樹状細胞集団を特定しました。本手法により、特定の24時間という時間枠内で腫瘍を注入し、細胞の遊走を研究することが可能となりました。
足底への注射およびリンパ節の分離ステップは、文章だけでは習得が困難であるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要です。Mycobacterium bovis BCGの注射では、つま先へのピンチテストで適切な鎮静レベルを確認した後、29ゲージの1/2インチ針を装着したシリンジを用い、30 µLのPBSに懸濁した1×10⁶ CFUの細菌を、8〜12週齢のマウスの後肢足底に接種します。対照群の足底には、PBSのみを注射します。
その後、動物が完全に回復し、注射した足底に体重をかけられるようになるまで観察します。CFSEの注射については、BCG注射後の適切な時点において、室温の5 mM CFSEのバイアルをPBSで10倍に希釈し、溶液を十分に再懸濁させてください。次に、希釈したCFSEをシリンジに充填し、最初の注射を行ったのと同じ後肢の足底に20 µL投与します。
CFSE注入の24時間後、後肢の大腿部に慎重に垂直切開を加え、筋肉の脂肪を除去します。次に、ハサミとピンセットを用いて、膝窩の脂肪嚢の深部に位置する膝窩リンパ節を露出させ、摘出します。リンパ節を氷上の0.5 millilitersの滅菌PBSに移し、5 millilitersのPBSを入れた6ウェルプレートの1ウェル内で、3 milliliterシリンジの背面を用いて70 micronのセルストレーナーでリンパ節をホモジナイズします。
ストレーナーをさらに5 millilitersのバッファーで洗浄し、細胞懸濁液を15 milliliterチューブに移します。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを適量のバッファーで再懸濁します。フローサイトメトリー用に細胞を標識するため、1×10⁶～10×10⁶個の細胞を5 milliliterの丸底ポリスチレンチューブに分注し、新鮮なFACSバッファーで細胞を洗浄します。
ペレットを、非特異的なFC介在性相互作用をブロックするためのanti-mouse CD16 CD32を含む適切な抗体カクテルを添加した50〜100 µLのFACSバッファーで、氷上で遮光しながら再懸濁します。30〜45分後、細胞をFACSバッファーで洗浄し、ペレットを50〜100 µLの新しいFACSバッファーで再懸濁します。膝窩リンパ節におけるCFSE標識の大部分は、皮膚ドレナージリンパ節に遊走する皮膚樹状細胞と一致する、MHC-II highかつCD11c positive lowの細胞で観察されます。
PBS投与の対照群と比較して、BCG感染マウスの膝窩リンパ節では、これらの標識細胞の頻度と総数の両方が増加しており、BCGがこれらの細胞のドレナージリンパ節への再配置を促進することが示唆されます。皮膚樹状細胞は感染後5日までドレナージリンパ節に入り続けており、本モデルにおける樹状細胞の遊走は、膝窩リンパ節における抗原特異的CD4陽性T細胞の初期活性化のタイムラインを大幅に超えて継続します。さらに、遊走性の皮膚樹状細胞は共刺激分子を高レベルで発現しており、これらの遊走性樹状細胞が活性化されているという概念を支持しています。
重要な点として、炎症を起こしたリンパ節に、輸入リンパ管ではなく高内皮細静脈を介して進入する、リンパ節耐性のモノサイト様およびプラズマサイト様樹状細胞は、いずれもCFSE陰性であり、CFSE標識が主に足底で起こっていることが改めて確認されました。さらに、追加のフローサイトメトリー解析により、EpCAM low CD11b high 細胞のサブポピュレーションが、BCG感染に応じて膝窩リンパ節へ遊走する主要な皮膚樹状細胞サブセットであることが明らかになりました。この手法に習熟すれば、適切に行うことで5分以内に完了させることができます。
この手順を行う際は、注入部位と注入量に注意することが重要です。また、解剖中に排出リンパ節を損傷させないよう十分な注意を払う必要があります。処置後、サブセット特異的な細胞の微小発現をさらに解析するために、フローサイトメトリーや共焦点顕微鏡などの他の手法を用いることができます。この技術により、感染やワクチン接種に対する反応として、皮膚から排出リンパ節へと移動する細胞を24時間以内に追跡することが可能になりました。
このビデオを視聴することで、足底注射の実施方法、および標的とする遊走性樹状細胞集団の追跡と特性解析のための、排泄リンパ節の特定および単離方法について十分に理解することができます。
概要
本記事では、BCG（Bacille Calmette-Guérin）感染後に皮膚から排泄リンパ節へと移動する樹状細胞の移行をモニタリングするために用いられる、蛍光細胞トラッカーアッセイについて解説します。この手法により、免疫応答におけるこれらの細胞の特性および活性化状態を評価することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 神経科学
背景
- 樹状細胞は免疫応答において重要な役割を果たします。
- その遊走パターンの理解は、ワクチン開発に役立ちます。
- マウスにおける免疫応答の研究にはBCGが用いられます。
- 細胞遊走の追跡は、免疫細胞の挙動を特性解析するために不可欠です。
研究目的
- 樹状細胞の遊走を追跡するための手法を開発すること。
- 感染後の樹状細胞の活性化を特性評価すること。
- 研究者に向けて、本手法を視覚的に実演すること。
使用方法
- マウスへのBCGおよびCFSEの足底注入。
- 解析のための膝窩リンパ節の採取。
- フローサイトメトリーによる細胞集団の評価。
- 手順の明確化のための視覚的な実演。
主要な結果
- BCG感染後、リンパ節におけるCFSEラベル済み樹状細胞の数が増加した。
- 感染に応じて遊走する特定の樹状細胞サブセットを同定した。
- 初期のT細胞活性化後も、樹状細胞の遊走が持続している証拠が得られた。
- 遊走性樹状細胞において、活性化マーカーの上昇が認められた。
結論
- このアッセイは、BCGに対する樹状細胞の遊走を効果的に追跡します。
- 免疫細胞活性化のダイナミクスに関する知見を提供します。
- この手法は迅速に習得可能であり、さらなる研究を促進します。
よくある質問
産業上の重要性
このCFSEを用いた遊走アッセイにより、バイオ医薬品研究者は、感染またはワクチン接種時における末梢組織からリンパ器官への樹状細胞のトラフィッキングを定量的に追跡することが可能になります。遊走性DCサブセットとその活性化状態を特定することで、本手法は免疫調節薬開発におけるターゲットバリデーションを支援し、ワクチン候補のリスク低減に向けた機序的な知見を提供します。本アッセイの簡便性と再現性は、免疫調節メカニズムを評価する創薬パイプラインへの統合を容易にします。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：免疫調節標的への結合に対する機能的なリードアウトとして、樹状細胞の遊走を解析することを可能にする。
- 運用的価値：in vivoにおける細胞トラフィッキングを評価するための、標準化された定量的な手法を提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 下流の機能的または表現型スクリーニングに使用可能な、遊走能を持つ樹状細胞集団を生成します。
- 運用上の価値： 定義されたCFSE標識およびリンパ節単離パラメータを通じて、アッセイの標準化を支援します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：樹状細胞の遊走と共刺激分子の発現を結びつけることで、ワクチンアジュバントのメカニズム的なリスク低減に寄与します。
- 実用的価値：初期のT細胞活性化以降の遊走細胞の経時的な追跡を可能にし、リスク調整された前臨床段階への進展を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本アッセイは、免疫調節の作用機序に関する定量的な遊走データを提供することで、ターゲットバリデーションからリード化合物同定、そして前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに適合します。
- 探索生物学：微生物刺激に応答した樹状細胞の動員および活性化に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：実験条件下での遊走反応を比較するための、再現性のある定量的な出力を提供します。
- 分析：フローサイトメトリーによるラベル化された樹状細胞の頻度および絶対数の測定を可能にし、比較分析を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ：遊走性樹状細胞のフェノタイプを活性化マーカーと結びつけ、前臨床モデルにおけるバイオマーカーの整合性をサポートします。
- エンタープライズ再利用：ワクチン、アジュバント、または免疫調節剤に応答する細胞遊走を追跡するための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：細胞トラフィッキングにおけるメカニズム的な曖昧さを排除することで、樹状細胞介在性免疫応答の予測信頼性を向上させる。
- 運用的価値：標準化された注入、単離、および染色手順により、再現性とスケーラビリティを向上させる。
- 戦略的価値：標的エンゲージメントの早期機能検証を提供することで、免疫調節剤開発におけるgo/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：樹状細胞の遊走および活性化プロファイルに基づいた、リスク調整後の候補物質の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- マウスの足底注射、リンパ節摘出、およびフローサイトメトリーの専門知識が必要です。
- CFSE、滅菌PBS、セルストレーナー、遠心分離機、およびフローサイトメーターへのアクセスが必要です。
- 注射量、インキュベーション時間、およびゲーティング戦略を統一するため、チーム間での標準化が必要です。
- 他のモデルシステムに適用する場合、感染モデルおよび樹状細胞マーカーの最適化が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、リンパ節単離における技術的習熟度や、CFSEラベル効率の変動の可能性が挙げられます。
