での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ

この蛍光細胞トラッカーを用いたアッセイの全体的な目的は、BCG（Bacille Calmette-Guerin）を足底に感染させた後、皮膚から所属リンパ節へと遊走する特定の標的細胞集団をモニタリングし、その特性を明らかにすることです。我々はこの手法を用いて、皮膚へのBCG感染後に所属リンパ節へホーミングする樹状細胞集団を特定しました。本手法により、特定の24時間という時間枠内で腫瘍を注入し、細胞の遊走を研究することが可能となりました。

足底への注射およびリンパ節の分離ステップは、文章だけでは習得が困難であるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要です。Mycobacterium bovis BCGの注射では、つま先へのピンチテストで適切な鎮静レベルを確認した後、29ゲージの1/2インチ針を装着したシリンジを用い、30 µLのPBSに懸濁した1×10⁶ CFUの細菌を、8〜12週齢のマウスの後肢足底に接種します。対照群の足底には、PBSのみを注射します。

その後、動物が完全に回復し、注射した足底に体重をかけられるようになるまで観察します。CFSEの注射については、BCG注射後の適切な時点において、室温の5 mM CFSEのバイアルをPBSで10倍に希釈し、溶液を十分に再懸濁させてください。次に、希釈したCFSEをシリンジに充填し、最初の注射を行ったのと同じ後肢の足底に20 µL投与します。

CFSE注入の24時間後、後肢の大腿部に慎重に垂直切開を加え、筋肉の脂肪を除去します。次に、ハサミとピンセットを用いて、膝窩の脂肪嚢の深部に位置する膝窩リンパ節を露出させ、摘出します。リンパ節を氷上の0.5 millilitersの滅菌PBSに移し、5 millilitersのPBSを入れた6ウェルプレートの1ウェル内で、3 milliliterシリンジの背面を用いて70 micronのセルストレーナーでリンパ節をホモジナイズします。

ストレーナーをさらに5 millilitersのバッファーで洗浄し、細胞懸濁液を15 milliliterチューブに移します。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを適量のバッファーで再懸濁します。フローサイトメトリー用に細胞を標識するため、1×10⁶～10×10⁶個の細胞を5 milliliterの丸底ポリスチレンチューブに分注し、新鮮なFACSバッファーで細胞を洗浄します。

ペレットを、非特異的なFC介在性相互作用をブロックするためのanti-mouse CD16 CD32を含む適切な抗体カクテルを添加した50〜100 µLのFACSバッファーで、氷上で遮光しながら再懸濁します。30〜45分後、細胞をFACSバッファーで洗浄し、ペレットを50〜100 µLの新しいFACSバッファーで再懸濁します。膝窩リンパ節におけるCFSE標識の大部分は、皮膚ドレナージリンパ節に遊走する皮膚樹状細胞と一致する、MHC-II highかつCD11c positive lowの細胞で観察されます。

PBS投与の対照群と比較して、BCG感染マウスの膝窩リンパ節では、これらの標識細胞の頻度と総数の両方が増加しており、BCGがこれらの細胞のドレナージリンパ節への再配置を促進することが示唆されます。皮膚樹状細胞は感染後5日までドレナージリンパ節に入り続けており、本モデルにおける樹状細胞の遊走は、膝窩リンパ節における抗原特異的CD4陽性T細胞の初期活性化のタイムラインを大幅に超えて継続します。さらに、遊走性の皮膚樹状細胞は共刺激分子を高レベルで発現しており、これらの遊走性樹状細胞が活性化されているという概念を支持しています。

重要な点として、炎症を起こしたリンパ節に、輸入リンパ管ではなく高内皮細静脈を介して進入する、リンパ節耐性のモノサイト様およびプラズマサイト様樹状細胞は、いずれもCFSE陰性であり、CFSE標識が主に足底で起こっていることが改めて確認されました。さらに、追加のフローサイトメトリー解析により、EpCAM low CD11b high 細胞のサブポピュレーションが、BCG感染に応じて膝窩リンパ節へ遊走する主要な皮膚樹状細胞サブセットであることが明らかになりました。この手法に習熟すれば、適切に行うことで5分以内に完了させることができます。

この手順を行う際は、注入部位と注入量に注意することが重要です。また、解剖中に排出リンパ節を損傷させないよう十分な注意を払う必要があります。処置後、サブセット特異的な細胞の微小発現をさらに解析するために、フローサイトメトリーや共焦点顕微鏡などの他の手法を用いることができます。この技術により、感染やワクチン接種に対する反応として、皮膚から排出リンパ節へと移動する細胞を24時間以内に追跡することが可能になりました。

このビデオを視聴することで、足底注射の実施方法、および標的とする遊走性樹状細胞集団の追跡と特性解析のための、排泄リンパ節の特定および単離方法について十分に理解することができます。