Name: のジェノタイピング黄色ブドウ球菌によってリボソームスペーサーPCR（RS-PCR） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶリボソームスペーサーPCRによる黄色ブドウ球菌のジェノタイピング法。牛乳腺炎における病原菌の遺伝子型解析と疾患関連性の解明に役立つ、迅速かつ高スループットな手法を習得できます。

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著者は、R. Boss、A. Cosandey、C. Fournier、I. Ivanovic、J. Nascovaの素晴らしい仕事に感謝します。

1. 黄色ブドウ球菌分離株<ol><li> S.10μlのスプレッド黄色ブドウ球菌株培養または1つのコロニーを5％ヒツジ血液（BA）を含むコロンビア寒天プレート上で選択培地上で増殖させました。 </li><li> 24時間〜18時間、37℃で好気的に培養します。 </li></ol> 2. DNA抽出<ol><li> 10 mMトリス-塩酸および10mMのNa 2 EDTA、pHが8.5を含むTELバッファを準備します。 15分間、121℃でアリコートし、オートクレーブを準備します。 </li><li> 100μlのTELに滅菌プラスチックループまたは滅菌木製の歯のピックと再懸濁を使用して、BAから1コロニーを収集します。スクリューキャップで1.5ミリリットルチューブを使用してください。 </li><li> 10分間95℃でインキュベートします。その後、濡れた氷の上にすぐにサンプルを置きます。 </li><li> PCR（PCR用=鋳型DNA）に適したH 2 Oで100：サンプル1を希釈します。非希釈し、希釈した試料を1ヶ月間-20℃で保存することができます。 </li></ol> 3. RS-PCR <ol><l各サンプルピペットiについて&gt; PCRチューブに1.5μlのH 2 O、12.5のTaqマスターミックス、2μlのG1プライマーμlの10μM、2μlのL1プライマー、10μM、および純粋の約30 ngのに対応するテンプレートDNAの7μlのDNA 2。 </li><li>標準的なPCRサイクラーで以下のサイクリングプログラムを実行します。7分間55℃で2分間ランプアニールに続いて1分間94°Cを含有する27サイクル、続いて15分95°C、。さらに2分勾配後、2分間72℃で延びています。 4℃に冷却し、続いて72℃で10分間の最終伸長によってPCRを終了します。 注：PCR産物は、5日間20℃で保存することができます。 </li><li> RS-PCRの各実行のために知られて遺伝子型（通常はGTB）とポジティブコントロール、 すなわち、サンプル、およびネガティブコントロール（H 2 O）が含まれます。 </li></ol> 4.電気泳動<ol><li>一緒にDNAのための市販の小型化電気泳動キット（MEDキット）を使用しますPCおよびインストールされたソフトウェアに接続されているバイオアナライザと。慎重に、メーカーの対応マニュアルを研究しています。 </li><li>チッププライミングステーションを設定し、製造業者の説明書に従ってシリンジクリップを調整します。 </li><li>製造業者の説明書に従ってゲル - 色素ミックスを調製します。 </li><li> （製造業者の説明書に従って）ゲル - 色素ミックスをロードします。 <ol><li>使用前に30分間RTにゲル染料ミックスを平衡化します。 </li><li>チッププライミングステーション上の新たなDNAチップを置きます。よくマークされG.中のゲル - 色素のピペット9μlの</li><li>プランジャが1ミリリットルに配置されていることを確認した後、チッププライミングステーションを閉じます。それは、シリンジクリップで固定されるまで押しプランジャ。 30秒後、シリンジクリップを解放するために正確に待ちます。 </li><li> 5秒間待ってください。ゆっくりと1ミリリットルの位置にプランジャーを引き戻します。 </li><li>両方のウェル中のゲル色素のオープンチッププライミングステーションとピペット9μlを「G」をマークしました。 </li></ol></li><li> Mのロードarker <ol><li>全12サンプルウェル中、よくはしご中のマーカーのピペットを5μl。空のこれらの13のウェルのいずれかのままにしないでください。 </li></ol></li><li>ラダーとサンプルをロードします。 <ol><li>ラダー記号をよくマークさにDNAラダーのピペット1μlの。 </li><li>サンプルのピペット1μlの（使用のウェル）または脱イオン水（未使用井戸）の1μlの。 </li><li> 2400 rpmで1分間アダプタと渦に水平にチップを置きます。 </li><li> 5分以内にバイオアナライザーでチップを実行します。 </li></ol></li><li>分析の実行<ol><li>バイオアナライザーと接続されたコンピュータを起動します。ソフトウェアを開きます。 </li><li>バイオアナライザのふたを開け、（チップは一方向にしかフィット）チップホルダーにチップを置きます。慎重に蓋を閉じます。 </li><li>ソフトウェアのインストゥルメントの文脈では、「電気泳動&quot;&gt;&quot;のdsDNA &quot;&gt;&quot; DNA 7500 &quot;を選択します。ソフトウェアの現在のファイルの接頭辞を受け入れるか、またはそれを変更します。</li><li>ソフトウェアに存在するスタートボタンをクリックします。ソフトウェアでサンプル名を入力します。チップの実行が終了すると（後に約30分） を実行し 、メッセージの終了は、バイオアナライザーソフトウェアに表示されます。 </li><li>製造業者の指示に従ってチップを取り外し、バイオアナライザーの電極を清掃してください。 </li></ol></li></ol> 5.電気泳動プロファイルから遺伝子型の推定<ol><li> （ソフトウェアは作者から自由に利用可能です）・マハルのソフトウェアをロードします。 </li><li>マハルソフトにインポートする参照データ：「ファイル」&gt;「インポート参考データ」 </li><li>バイオアナライザソフトウェアのデータコンテキストで実行電気泳動を開きます。 1サンプルの電気泳動プロファイルを選択します。 </li><li>関連するピークを確認してください。 <ol><li> 「ツール」&gt;「平均蛍光」：関連するピークを確認するためにマハルソフトウェアを使用してください。 「蛍光」ボックスに挿入します蛍光値は、それらがバイオアナライザーソフトウェアから読み出すことができるように蛍光単位（FU）として示されます。昇順で最も高い蛍光を有する4（3）ピークを挿入し、カンマで区切られています。例：126130132137。 注：すべてのこれらのピークのFUのは、バイオアナライザーソフトウェアによって示されている場合、それらはプロットからそれらを読み出すことによって推定される必要があります。 </li></ol></li><li> 「計算する」ボタンを押してください。観察された蛍光は、ボックス「最小ピーク高さ」で指定された値を超えた場合にピークが関連しています。 </li><li>遺伝子型を推論します。 <ol><li>昇順にマハルのテキストボックス「入力ピークス（bp）の「すべての関連のピークの塩基対での大きさに挿入し、カンマで区切られています。例：440,462,519,579,637。 注：これらのピークの大きさの全てではないが、バイオアナライザーソフトウェアによって示されている場合、それらはプロットからそれらを読み出すことによって推定される必要があります。 </li></ol></li><li> 「計算する」ボタンを押してください。 </li><li>リストでボックスには、最小限の二乗マハラノビス距離 &quot;D2M」を探してください。それは≥0.05ある右に対応するP値は、その後確率は帰無仮説H 0が拒否されたこと≥5％である場合には（H 0：観察された基準プロファイルは同一である）が観察されたプロファイルが同じであることが認められていることを意味します指示された遺伝子型の基準プロファイル。 </li><li> D2Mが最小であるが、対応するP値のフィールドが空の場合、確率&lt;5％H 0を棄却。 注：これはD2Mは最小限ですが、プロファイルが等しくないことを意味します。このような結果は、非平均電気泳動条件に起因し得ます。 <ol><li>これらの偏差を補正するために、値395「ピーク（bp）の観測」テキストボックスに挿入し、「計算」ボタンを押してください。最小限のD2Mと対応するP値≥0.05のために再度確認してください。成功しない場合、値は405、415、および425を試してみてください。 注：時々、小さなステップでもあります示されています。 、観察されたプロファイルが参照データには存在しない成功していないまだ場合、それは新たな遺伝子型または変異体であってもよいです。 </li></ol></li><li>様々なプロファイル<ol><li>繰り返しますが、別途、各電気泳動プロファイルに対して5.6〜5.9を繰り返します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sears, P. M., McCarthy, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+and+treatment+of+staphylococcal+mastitis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Clin.North+Am.Food+Anim.Pract%22%5BJournal%5D)">Management and treatment of staphylococcal mastitis.</a> Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).</li>
<li>Fournier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Staphylococcus+aureus%3A+association+of+virulence+genes%2C+genotypes+and+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Res.Vet.Sci%22%5BJournal%5D)">Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome.</a> Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).</li>
<li>Cosandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+genotype+B+and+other+genotypes+isolated+from+cow+milk+in+European+countries%5BTitle%5D)+AND+%22J.Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).</li>
<li>Boss, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Staphylococcus+aureus%3A+Subtyping%2C+evolution%2C+and+zoonotic+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).</li>
<li>Graber, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mastitis-related+subtypes+of+bovine+Staphylococcus+aureus+are+characterized+by+different+clinical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties.</a> J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).</li>
<li>Heiniger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kosten-Nutzen-Analyse+einer+Intervention+zur+Verbesserung+der+Eutergesundheit+in+Schweizer+Milchviehbetrieben%5BTitle%5D)+AND+%22Schweiz.Arch.Tierheilkd%22%5BJournal%5D)">Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben.</a> Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).</li>
<li>Hamann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+physiological+cell+count+threshold+based+on+changes+in+milk+composition%5BTitle%5D)+AND+%22IDF+Mastitis+Newsletter%22%5BJournal%5D)">Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition.</a> IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).</li>
<li>Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((spa+typing+and+enterotoxin+gene+profile+of+Staphylococcus+aureus+isolated+from+bovine+raw+milk+in+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vet.Sci%22%5BJournal%5D)">spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea.</a> J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).</li>
<li>Sakwinska, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Link+between+genotype+and+antimicrobial+resistance+in+bovine+mastitis-related+Staphylococcus+aureus+strains%2C+determined+by+comparing+Swiss+and+French+isolates+from+the+Rhone+Valley%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.Environ.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley.</a> Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).</li>
<li>Rabello, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+of+Staphylococcus+aureus+isolates+recovered+from+cows+with+mastitis+in+Brazilian+dairy+herds%5BTitle%5D)+AND+%22J.Med.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds.</a> J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).</li>
<li>Tavakol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine-associated+MRSA+ST398+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Vet.Scand%22%5BJournal%5D)">Bovine-associated MRSA ST398 in the Netherlands.</a> Acta Vet.Scand. 54, 28(2012).</li>
<li>Harmsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typing+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+in+a+university+hospital+setting+by+using+novel+software+for+spa+repeat+determination+and+database+management%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management.</a> J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).</li>
<li>Zadoks, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+pulsed-field+gel+electrophoresis+and+binary+typing+as+tools+in+veterinary+clinical+microbiology+and+molecular+epidemiologic+analysis+of+bovine+and+human+Staphylococcus+aureus+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).</li>
<li>Cremonesi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+characteristics+of+Staphylococcus+aureus+strains+associated+with+high+within-herd+prevalence+of+intramammary+infections+in+dairy+cows%5BTitle%5D)+AND+%22J.Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows.</a> J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).</li>
<li>Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+for+characterization+of+methicillin-resistant+and+methicillin-susceptible+clones+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

RS-PCR（&gt; 30純粋なDNA /アッセイをNG）におけるDNAの過剰がある場合手順全体の最も重要なステップがある2。そのすべてのピークがベースラインから始まり、最後ならば一般的には、プロファイルの解像度が最適です。 2つのピークが一緒に近すぎる場合は、解像度が不完全です。手動識別が必要とされるように、これらの条件下では、バイオアナライザーソフトウェアが不適切なピーク同定につながり得ます。 BPまたはFUとして表現すべて目に見えて分離し、関連するピークは、さらなる分析のために含まれています。ピークの重なりや減損解像度をピークまでのRS-PCRの結果のためにあまりにも多くの鋳型DNA広いピークで、したがって。また、移行は遺伝子型がもはや推論されることがないように、誤って増加しているピークのサイズに遅い有力です。最後に、無関係なピークの数が大きいです。以上の3つのピークを持つプロファイルの場合、最大蛍光を有するピークは、通常150 FUを超えてはなりません。機械への投資が必要で、無料マハルソフト...

ブドウ （ 黄色ブドウ球菌）は、牛1における乳房内感染（IMI）のための世界的な責任を最も重要な病原体として知られています。欧州12カ国というの牛でCosandey ら 3及びボスら 4によりフルニエら 2スイス牛で実証・研究による研究S.ウシIMIから分離された黄色ブドウ球菌は、遺伝的に不均一な群です。 16S-23S rRNAの遺伝子間スペーサー領域のPCR増幅（RS-PCR）により、17遺伝子型の合計は、最初に101疫学的に独立した単離物2で検出されました。他の15の遺伝子型（GTS）は、各すべての分離株の1〜4％を作り、まれに発生していないのに対し、遺伝子型Bと遺伝子型C（GTC）は、（80％）が最も一般的でした。欧州レベル3では、GTBは、GTCは、GTF、GTI、およびGTRは、すべての分析株（N = 456）の76％を含む、最も重要な遺伝子型でした。 GTBは、ワット中央ヨーロッパに位置していましたhereas他の遺伝子型は、広く普及しました。株の残りの24％は41の遺伝子型が含まれ、それらの多くは、しかし、一度のみ観察されました。 フルニエ者らの研究ら 2、Cosandey ら 3、及びグラバーら 5は、さらに、遺伝子型が非常に欧州レベルでのように、スイスで、ならびに、それらの病原性遺伝子のパターンと関連していたことを実証しました。研究はさらにS.間のIMIの有病率の大幅な違いを明らかにしました球菌 GTB、GTCおよび他の遺伝子型2,5：GTB考慮して、群れでの牛の87％までは、この遺伝子型に感染していました。 GTCのと他の遺伝子型の場合には、しかし、IMIは唯一の群れの1〜2頭の牛に認められました。 IMI S.によって引き起こされます黄色ブドウ球菌は 、通常、対応する乳腺の炎症および乳中の炎症細胞の増加をもたらします。その結果、体細胞の共同乳中のunts（SCC）、ほとんどの国で乳質の重要な指標は、減少した牛乳の価格、あるいは配信停止につながる増加されます。 フルニエら 2のRS-PCRに加えて、他のタイプの方法は、Sのウシ株サブタイプについて記載されています球菌 8-11。 2つの一般的なものは、 スパタイピング 12と多座配列タイピング（MLST）13が含まれます。後者の1が7ハウスキーピング遺伝子の塩基配列決定を必要とするのに対し、前者は、プロテインAのブドウ球菌スパコードする遺伝子の可変スペーサー領域の配列を決定するDNAに基づいています。これは、1つの12および7のPCR 13は 、それぞれ、特定の装置を使用してアンプリコンの精製、配列決定反応及び分析を行い、実行する必要があることを意味します。 RS-PCRと比較すると、これらの方法は、低いサンプルスループットと高いコストが生じ、実験室にかなりの付加的な努力を必要とします。ザスループットは、PFGEのために特に低いです。 S.のウシの株について、これらの方法の解像度を考慮すると黄色ブドウ球菌 、RS-PCRは、少なくともMLST 4またはPFGE 15より4、より良いと入力し、スパと同じくらい良いです。 バイナリタイピング13を含むすべてのこれらの方法は、Sによって引き起こされるウシIMIの病因にさらなる洞察を得ることにその有効性を実証しました黄色ブドウ球菌 、しかし理由述べた制限の彼らは、大規模な臨床研究にはあまり適しています。また、RS-PCRによる遺伝子型決定フルニエらによって記載されているように2は 、疫学的及びS.の病原性の可能性のある信頼性の高い予測を可能にしますウシIMIに関与球菌 、臨床獣医学における2のキー値。

<table><tbody><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン</td><td>メルク</td><td>1.08382.0500</td><td>Mw = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>チトリプレックス III</td><td>メルク</td><td>1.08418.0250</td><td>Mw = 372.24 g/mol;Substance is equivalent to Na2EDTA&middot;2H2O</td></tr><tr><td>塩酸 5 mol/L</td><td>メルク</td><td>1.09911.0001</td><td></td></tr><tr><td>コロンビア寒天+5% 羊の血液</td><td>bioM&eacute;rieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA7500 Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 expert sofware</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq master mix&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>203445</td><td></td></tr><tr><td>プライマー L1</td><td>マイクロシンス</td><td></td><td>5'CAA GGC ATC CAC CGT3'</td></tr><tr><td>プライマー G1</td><td>マイクロシンス</td><td></td><td>5'GAA GTC GTA ACA AGG3'</td></tr></tbody></table>

のジェノタイピング<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;によってリボソームスペーサーpcr（rs-pcr）

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

リボソームスペーサーPCR (RS-PCR) は、黄色ブドウ球菌の高分解能で堅牢なジェノタイピング法であり、中程度のコストで高いスループットを可能にするため、日常的な目的に使用するのに適しています。最高の分解能、データ評価、およびデータ管理のためには、小型化された電気泳動システムが必要です。このような電気泳動システムと自社開発のソフトウェア(こちらから無料で入手可能)を組み合わせることで、遺伝子型へのバンドパターンの割り当てが標準化され、簡単に進むことができます。DNA抽出は簡単で(煮沸調製)、反応のセットアップは簡単で、標準的なPCRマシンで実行できます。PCRサイクルは、長時間のランピングと伸び時間を除いて一般的です。スパタイピングやマルチローカスシーケンスタイピング(MLST)と比較して、RS-PCRはDNAシーケンシングを必要としないため、解析が大幅に簡素化され、高いスループットが可能になります。さらに、黄色ブドウ球菌のウシ株の分解能は、少なくともスパタイピングと同等であり、MLSTまたはパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)よりも優れています。RS-PCRデータベースには、現在、合計141の遺伝子型と変異体が含まれています。この方法は、ウシ乳房炎に関与する黄色ブドウ球菌株の病原性遺伝子パターン、伝染性、および病原性と非常に関連しています。黄色ブドウ球菌遺伝子型B(GTB)は伝染性であり、群れの問題を引き起こし、スイスや他のヨーロッパ諸国で多額の費用がかかります。スイスで観察される他のすべての遺伝子型は、個々の牛や宿舎に感染します。RS-PCRによるジェノタイピングは、臨床獣医学の2つの重要な要素であるウシの乳房内感染(IMI)に関与する黄色ブドウ球菌の疫学的および病原性の可能性を確実に予測することができます。これらの有益な特性と適度なコスト、高いサンプルスループットにより、この出版物の目標は、他の研究室で黄色ブドウ球菌のジェノタイピングのためのRS-PCRを簡単に確立し、実行するための詳細なステップバイステップのプロトコルを提供することです。

遺伝子型とその変種の定義すべての識別された遺伝子型から複数の帯域が異なる電気泳動プロファイルが新たな遺伝子型であると考えられます。新しい遺伝子型に名前を付けて拡張フルニエらによると。5 GTZにGTAの遺伝子型につながる、GTBZに遺伝子型GTAZにGTAA、およびGTBAが続き、現在ではGTCCにGTCAされています。ただ一つのバンドの変化は、遺伝子型の変異体とみなされます。これは、遺伝子型（ 例えば、GTRI、GTRII）の名の後に上付きローマ数字で示されています。全体で、参照データベース141の遺伝子型及び変異体は、現在存在しています。 上記で概説した条件下では、フルニエらによるRS-PCRを。5</em...

ここでは、リボソームスペーサーPCR(RS-PCR)を小型電気泳動システムとともに使用し、黄色ブドウ球菌を適度なコストでジェノタイピングするための高速かつ高分解能の方法として、高いスループットを可能にします。

のジェノタイピング<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;によってリボソームスペーサーPCR（RS-PCR）

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

本手順の総合的な目的は、Staphylococcus aureusの遺伝子型を特定し、それらを宿主における疾患に関連付けることです。この手法は、牛乳房炎の分野における重要な疑問への回答に寄与し、Staphylococcus aureusの伝染性と継代能を保護し、乳房内感染を起こしている牛から本菌を分離することを可能にします。本手順の実演は、私の研究室の技術者であるIvana Ivanovicが行います。まず、5% 羊血を含むコロンビア寒天培地（BA培地）に、10 µL の Staphylococcus aureus ストック培養液、または選択培地で増殖させた1つのコロニーを塗布します。この培養物を 37 °C で 18～24 時間好気的に培養します。滅菌済みのプラスチックループまたは木製つまようじを用いて、BA寒天培地から細菌コロニーを1つ採取し、1.5 mL スクリューキャップチューブに入れた 100 µL の TEL に再懸濁します。サンプルを 95 °C で 10 分間加熱し、直ちに氷上に置きます。次に、サンプルをPCR用滅菌水で100倍に希釈します。ここに記載した試薬をチューブに加え、マスターミックスを調製します。その後、PCRチューブに分注し、サンプルDNAを加えます。既知のジェノタイプを持つDNAを陽性コントロールとし、水を陰性コントロールとして含めてください。標準的なPCRサイクラーを使用して、テキストプロトコルで説明したプログラムを実行します。約6時間45分のサイクル終了後、装置を停止させ、チューブを取り出します。電気泳動を行うには、DNA用の市販の小型電気泳動キットを、PCおよびインストール済みソフトウェアに接続されたBioanalyzerとともに使用します。チッププライミングステーションをセットアップし、製造元の指示に従ってシリンジクリップを調整します。次に、新しいDNAチップをチッププライミングステーションにセットします。次に、ゲル染料ミックスを室温に戻した後、ゲル染料 9 µL を G と記されたウェルにピペットで分注します。プランジャーが 1 mL の位置にあることを確認し、チッププライミングステーションを閉じます。プランジャーをシリンジクリップで固定されるまで押し下げ、正確に 30 秒間待機してからシリンジクリップを解除します。5 秒間待機した後、プランジャーをゆっくりと 1 mL の位置まで戻します。チッププライミングステーションを開き、Gと記された両方のウェルにゲル染料を9 µLずつピペットで分注します。マーカーをロードするには、12個すべてのサンプルウェルと、ラダー記号の付いたウェルにマーカーを5 µLずつピペットで分注し、計13個のウェルすべてに充填されていることを確認します。次に、ラダーウェルにDNAラダーを1 µLピペ

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このプロトコルは、食品中のクラス1インテグロンとそれらに関連する遺伝子カセットの検出を説明しています。...

クラス1インテグロンおよび遺伝子カセットのための食品のスクリーニング

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)および分子技術(16S...

16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定

私たちは、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いて細菌群集の特徴付けのために綿棒から核酸を抽出するための、効率的で堅牢、かつコスト効果的な方法を説明します。方法は、複数のサンプルタイプのための一般的な処理アプローチを可能にし、下流分析プロセスの数を収容します。...

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

ここでは、RNA サンプルでゲノム DNA (gDNA) 汚染をトレースするためのプロトコルを提案する.提案手法では、リボソーム DNA (rDNA) 遺伝子の内部転写スペーサー領域 (ITS) に特異的なプライマーを利用しています。メソッドは、ほとんどの真核生物と原核生物の DNA...

リボソーム DNA に基づいて RNA サンプルの DNA 汚染の評価

ドリップ流反応器と回転するディスクの原子炉とオープンシステムの流れのバイオフィルムを利用するためのプロトコルを詳細に表示されます。...

用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析

マウスの皮膚および軟部組織感染症のモデルは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）およびホストの免疫応答の病原性の機能を評価するために利用されている。ここで、我々は、皮膚および軟部組織感染症のための皮下感染モデルを発表した。...

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の皮下感染

学ぶリボソームスペーサーPCRによる黄色ブドウ球菌のジェノタイピング法。牛乳腺炎における病原菌の遺伝子型解析と疾患関連性の解明に役立つ、迅速かつ高スループットな手法を習得できます。

のジェノタイピング

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