スターレットイソギンチャクの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導 Nematostella vectensis

この手順の全体的な目標は、線虫の先端から除去された組織の小さな部分からの完全なポリープの再生中に発生した予測可能な一連の形態学的変化を説明することですこの方法は、創傷部位の細胞がどのように再編成され、失われた構造を作り直すために展開するかなど、再生生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、比較的複雑なポリープが最小限の形態学的情報から始めて、どのように自分自身を元に戻すことができるかを見たかったからです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、最初の創傷後の病期の進行が粘膜によって不明瞭になることがあるため、非常に重要です。

一般に、この方法に不慣れな個人は、ポリープの柔らかく粘着性のあるゼラチン状の性質のために、創傷部位で組織を完全に分離するのに苦労します。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、線虫ステラベクテンシスのコンディショニングから開始します。この手法を使用する場合は、選択した動物が同じサイズであり、同じ摂食やその他の条件パラメーターなど、同じ培養履歴を持っていることが特に重要です。

切断の少なくとも1時間前に、選択した動物の皿をインキュベーターから部屋の光の中に移します。幅広のプラスチックピペットを使用して、切断するプールから5匹の動物を、塩分濃度12分の1の人工海水を含む直径100ミリメートルの滅菌ガラス切断皿の底に移します。皿を実体顕微鏡のステージに置き、倍率を10〜40倍に変化させます。

ほぼ同じ長さのサイズに合わせたポリープを選択し、切断の3日前からコロニーから分離したボウルに入れます。滅菌メスを使用して、各ポリープからアブラルフィサを切断し、幅が広く腸間膜を含まないフィサのセクションとほぼ同じ長さのフィサを取得します。これを達成するには、メスの刃を切断の目的の部位で動物と接触させます。

これは、補助なしで、または5番の鉗子で動物の体を優しくつかむことによって行います。メスの湾曲した刃を体全体に揺らすように動かして、組織を切断します。切断された各ドナーポリープを皿から取り出し、プールされた切断者とラベル付けされた別のボウルに戻します。

ボウルの年代測定後、ストックカルチャーに戻します。切断皿に残っている切除されたフィサを人工海水で1, 000分の12の塩分濃度で洗い流します。次に、各フィサを、各ウェルに1,000分の12の塩分濃度で10ミリリットルの人工海水を含むマルチウェル細胞培養プレート内の別々の滅菌ウェルに移します。

これらの手順を繰り返して、各ウェルに少なくとも5つのphysaを収集し、各実験的治療のために予約します。physaを含むプレートを、所望の再生速度によって決定される固定温度の温度で温度調節されたインキュベーターに入れます。可変倍率の実体複合顕微鏡を使用してphysaを採点します。

切りたての線虫physaをステージゼロとして採点し、切断後、またはDPAを使用して毎日同時に採点を続けます。切りたてのフィサが、透明な風船に似たカップ型の塊として現れ、傷口が開いている可能性が高い場合は、フィサをステージゼロとして採点します。切断傷が閉じているように見える場合は、ステージ1としてphysaを採点します。

聴覚ポールの表面が膨らんでいるように見え、放射状に対称的なパターンで配置され、溝で区切られた8つの隆起したアーチが現れる場合は、ステージ2としてフィサを採点します。ステージ2では、アーチの頂点にある小さな半球状のブレブを観察します。これは、幅とほぼ同じ高さで、おそらく一過性で、最初は単一の外胚葉細胞層で構成されています。フィサが老化するにつれて、粘液に包まれることがありますので、鉗子で慎重に取り除く必要があります。

内胚葉および外胚葉組織層を含む触手の芽が、少なくともいくつかの橈骨弓の聴覚端に安定して形成されている場合、ステージ3としてphysaを獲得します。physaが体壁の挿入から腔腸内に伸びる8つの異なる目に見える腸間膜を含み、耳のaboral lengthがそのaboral endの咽頭に接続されているように見える場所から測定された半径方向の幅の2倍を超える場合、ステージ4としてphysaをスコアリングします。最後に、フィサにプリーツ付きの腸間膜が4つ以上あり、プリーツがステージ4よりも完全で曲がりくねっている場合は、フィサをステージ5として採点します。

ステージ5では、動物はほぼ正常な成体の外観を持っていますが、目に見える性腺細胞はありません。0.1%DMSOで処理されたこの対照群の線虫ステラphysaは、ステージ5まで完全に再生しました。しかし、クロロキンで処理されたPhysaは、完成した腸間膜を完全に形成することができませんでした。

クローズアップは、クロロキンでインキュベートされたフィサの腸間膜のプリーツの存在と欠如の両方を示しています。このグラフは、クロロキン処理の集計結果を示しています。10 マイクロモルから 50 マイクロモルの間の治療は、同様の欠陥を引き起こし、主に腸間膜の完全な改革の欠如を引き起こしました。

この手法を習得すると、30カットのphysaを含む各6ウェルプレートで1時間未満で完了します。スコアリングは迅速で、おそらく各レプリケートプレートに30分かかります。このビデオを見た後、あなたは、アボラル組織の小さなセクションから完全なポリープの再生中に起こる形態学的変化を視覚化するためにphysaを切断する方法をよく理解しているはずです。

この技術の主な利点は、視覚的に均一な組織のカップから完全なポリープの再生の根底にある分子イベントを固定するための形態学的段階を提供することです。この手順を試みる際には、栄養履歴に関して動物を事前に調整すること、成体の腸間膜を除外するために二等分すること、および治療内の変動を減らすために再生するフィサのサイズを標準化することを覚えておくことが重要です。この手順に従うと、例えば、低分子による遺伝子変異やシグナル伝達経路の摂動の影響を評価することができます。

あるいは、形態形成の変化は、自己増殖の顕微鏡分析、系統追跡、または部位2遺伝子発現と相関している可能性があります。この技術は、再生生物学の分野の研究者が、このモデル生物の驚くべき再生能力の根底にある細胞生物学、シグナル伝達経路、および形態形成プロセスを探求するための道を開くでしょう。