Name: スターレットイソギンチャクの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導 Nematostella vectensis (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学ぶNematostella vectensisの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導する手法。この実験系は刺胞動物の再生メカニズムと幹細胞生物学を研究する上で重要なモデルとなります。

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温度、栄養および明/暗サイクルのための動物の1コンディショニング<ol><li>世界中の数多くのNematostellaラボの1、または非営利業者からNematostella vectensis成人を得る（ 表1） </li><li>千あたり12部（PPT）の塩分で「1/3× &quot;人工海水（ASW）で、暗闇の中で（典型的には18と21°C）一定温度でNematostellaを維持します 。一般的に250 mlまたは1.5 L容量11、シンプルなソーダライムガラス培養皿で培養を維持します。 注：これらの単純な培養条件は、一般的にNematostellaを研究ラボの中で使用されているが、文化のケアも19を自動化することができます。 </li><li>週4倍- 2ノープリウスNematostella新しく孵化したアルテミアを養います。フル強度（36 PPT）または1/3倍の浅い長方形のガラス皿20内またはで30℃、でASWでハッチアルテミアシスト小規模、商業や自家製ブラインシュリンプ孵化場の数のいずれか。インキュベーターが使用できない場合は、エビはRTで孵化が、よりゆっくりとそうなります。 注：これは、多くの場合、完了のために24時間以上を必要とします。 </li><li>少なくとも週に一度アネモネ培養水を交換してください。最高の大人の健康のために、徹底的にクリーン（石鹸なし）文化が一度コートボウルと缶トラップ食べ残しや廃棄物の蓄積粘液分泌、の週をボウル、動物を絡ませます。 </li></ol>栄養的に馴化動物の2.選択とリラクゼーション<ol><li>ほぼ同じ長さの大きさがマッチしたポリープを選択（3〜5センチメートルを、ときに自然にリラックスした）前切断に3日間コロニーから分離ボウルに配置します。 注：切断のために選択された動物の数は、実験によって決定されますもちろん、行われているが、一般的に、我々は6反復でサンプル点当たり少なくとも5匹の動物をお勧めします。このように、典型的な実験では30匹の動物の最小値は、事前に選択されたことになります。 （下記参照）不規則な切断術の後スコアに影響を与えることができるので、一般には、より多くの最小数（30）より選択することが賢明です。 </li><li>切断する前に少なくとも1時間室内光にインキュベーターから選択した動物の食器を削除します。 注：室内光とハンドリングの振動への曝露は、おそらく動物が収縮する原因となりますので、実験台上でのインキュベーションによって適合または「リラックス」する必要があります。動物は触れるために、耐火及び露光となり、その時点での穏やかなピペッティングして移動することができます。 </li><li>オプション：（1/3×ASWに）7.5％のMgCl 2を追加することにより、動物を麻酔。静かに標準的なプラスチック5 mLのピペットでボウルへのMgCl 2溶液を追加します。 注：動物は、最終的に光へと物理的な操作に慣れになるだろうが、維持またはトンを「修正」するために動物を麻酔することが有利な場合があります彼らは細長い16,21,22となった後、彼は状態を緩和しました。 </li><li> 12 PPTのASWを含む直径100mmの滅菌ガラス切断皿の底に、切断されるように、プールから5匹の動物（1/3×ASWに）転送するために広い口径（&gt; 0.5センチメートル）プラスチックピペットを使用してください。 40X - 10の間に可変倍率の実体顕微鏡のステージに上の皿を置きます。 注：動物は、切断のために麻酔をかけ、リラックスされていない場合、彼らはまだ触れないように対応し、ステレオスコープの照明ので、再びリラックスになるために数分を必要とする場合があります。 </li></ol> 3.切断術<ol><li>滅菌メスを使用して、約限り、それは広いと全く腸間膜を含まないあるようですphysaのセクションを得ることを目標に、各ポリープから尾方physaを切断します。 注：理想的な切断部位は、腸間膜の終了にちょうど尾方です。切断面に薄いリットルに対して適切腸間膜からの移行がありますINESは、各腸間膜挿入（ 図1参照、矢印）に対応します。それは穴17,30 &#39;を差し込む」容易にすることができる粘液を生成するので、腸間膜の不在は重大です。 <ol><li>切断の所望の部位での動物と接触したメスの刃を配置します。 （フリーハンド）補助なし、または静かに＃5鉗子（デュモンスタイルまたは類似）で動物の体を把握することでこのいずれかの操作を行います。 </li><li>体全体の「ロッキング」運動にメスの湾曲した刃を活用することで、組織を通ってカット。 注：組織は、メスが揺動されるようにきれいに切断し、ドナーからphysaの所望の部分を解放する必要があります。組織の小片がまだ体とphysaを接続する場合は、メスでそれをカット。これはphysaに損傷を与える可能性として、引っ張ることにより、接続された作品を分離しようとしないでください。 </li></ol></li><li>皿から各切断「ドナー」ポリープを削除し、SEPAに戻します「プールされた切断者」の標識率ボウル。日付ボウルとストック培養物に戻します。 注：切断ポリープ日以内に尾方の傷を癒してくれるし、その後正常に供給することができます。彼らは、必要に応じてphysaが再び切断することができ、その時点で2週間以内に通常見physaを再生成します。 </li><li> 12 PPT ASWで切断皿に残って切除したphysaをすすぎ、その後、すでに各ウェルに12 PPT ASWの10ミリリットルを持つマルチウェル細胞培養プレートに別々の無菌ウェルに各physaを転送します。 注：この例では、各ウェル海水の10 mL及び5切除したphysaを保持して、6ウェルプレートを使用しています。一般海水でハンドリングし、潜在的な蒸発に起因する動きに空気への暴露を避けるために十分physaをカバーする必要があります。プレートまたはウェルは、蓋を持っている必要があります。 </li><li>各実験治療のために、各ウェルの予約で少なくとも5 physaを収集するために、3.3 - 繰り返して、3.1を繰り返します。 </li><li>箴ます温度でphysaをインキュベート計画された実験的な取調べのための再生の最高の速度をIDE。再生の所望の速度によって決定される一定の温度で、温度調節インキュベーターにphysaを含むプレートを置きます。 注：physaが欠落した組織を再生し、15と27℃の間の温度でインキュベートした場合、完全なポリープを形成することになります。再生の速度は、最初の2つのステージを除いて、温度依存性です。全ての温度のための段階4に到達するための平均日は、切断後7日であり、これはまた、21℃における再生と一致します。 27℃では、ステージ4は、約3日早く到達し、15℃で、ステージ4は、21°C（参照文献10）で再生と比較して約3 dだけ遅延されます。 </li></ol> 4. Nematostella再生ステージングシステム（NRSS）で再生を評価します<ol><li>変数壮麗なステレオ-化合物顕微鏡を用いてphysaスコアエーション（10 - 80X）。ステージ0のように新鮮にカットNematostellaの physaスコアと同時に、NRSS 10を使用して、毎日ポスト切断術（DPA）をスコアリングを続けます。 注：キーのステージング基準や詳細についてはリファレンス10を参照してください。 <ol><li>オープン創傷部位で、弛緩性バルーンに似ているcup-形の質量はそう見えるようたてカットphysaが表示された場合、ステージ0（開いた傷口）としてphysaスコア。 注：傷のエッジがまた最初から一緒に固執する可能性がありますが、組織はまだ崩壊され、剛性が不足しています。開放創のエッジは、創傷治癒のような半径方向の収縮を受けて観察することができます。 </li><li>切断術創が閉じて表示された場合（閉鎖した創傷）第1段階としてphysaスコア。 注：創傷場所は、将来の経口極に対応させていただきます。将来の経口ポールの周りの外表面は、基礎となる放射対称内胚葉腸間膜の挿入に対応する明確なアーチを表示し始める可能性があります。 </li><li>スコアのpHYSAステージ2（ラジアルアーチ）などの経口極の表面が放射状に対称なパターンに配置された8つの隆起したアーチを明らかにし、膨張した溝によって分離された表示されます。アーチの頂点に小さな半球状のブレブを守ってください。彼らは広い、おそらく一過性のように背の高い、と最初は単一の外胚葉細胞層によって構成についてになります。 注：いくつかのケースでは二重層ブレブを安定化させることができます。注：この以降の段階で粘液層がphysa膜状の「鞘」で（ 図2）をカプセル化するために表示されることがあります。このカプセル化材料は、スコアリングを容易にするために削除する必要があります。 </li><li>内胚葉と外胚葉組織層を含む触手の芽を安定的に、少なくともいくつかの半径方向のアーチの経口端部に形成されている場合には、ステージ3（触手）としてphysaスコア。 注：触手は、彼らが広く、最小限の運動性よりも長くなっています。腸間膜の基礎が可視になるようにphysaは増加したが、変数インフレ率が表示されます体腔（腔腸）に腸間膜の挿入から延びるible。 </li><li> physaは、彼らが接続されているように見えたところから測定その2倍の半径方向の幅よりもある口腔尾方の長さで、体壁に挿入から腔腸中に延びる8明確な、目に見える腸間膜が含まれている場合は、ステージ4（リニア腸間膜）としてphysaスコアその尾方端（enterostome）で咽頭へ。 注：4つ以下の腸間膜には、「プリーツ」内部の自由縁を持っています。咽頭が表示されます。以上8触手は、運動性表示され、時には彼らは体内に収縮します。 </li><li> physaはプリーツとつ以上の腸間膜を有しており、プリーツは、動物はほとんど &quot;通常の&quot;大人の外観を持っていますが、目に見えるはありませんステージ4でより完全かつしなやかである場合、ステージ5（主にプリーツ腸間膜）としてphysaスコア生殖細胞。 </li></ol></li></ol>

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<li>Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tightrope+act%3A+autophagy+in+stem+cell+renewal%2C+differentiation%2C+proliferation%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging.</a> Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).</li>
<li>Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Autophagy in zebrafish.</a> Methods. 75, 172-180 (2015).</li>
<li>Varga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+zebrafish+caudal+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration.</a> Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+apoptosis+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Autophagy and apoptosis in planarians.</a> Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).</li>
<li>Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+investigate+autophagy+during+starvation+and+regeneration+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra.</a> Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

創傷治癒および再生のモデルとしてNematostellaの使用は、ますます人気が高まっています。したがって、効果的な細胞および分子分析は、割り当てと比較することができる前に、特定のプロトコルの形態学的パターンを可視化できることが重要です。生活の後プラヌラの段階で、ほぼすべての場所で切断し、不足している構造を改革することができるという、回生「柔軟性」の高い学位を持っているNematostella。このように、様々な研究者らは、異なる年齢やサイズ7-18で、再生切断から生じるまたはポリープの異なる領域に負傷を検討しました。 ここで説明したステージングシステムは、生殖組織を欠いている解剖学的に完全な若年性ポリープに大人の尾方端から切断physaの形態学的に均一な部分の変換を、（これらの回生少年が性的メートルになったときに、我々はまだ決定していない以下のature）。このアプローチは、最大に近い複雑さの一つに組織の簡単な原基から再生を調べます。最小グループサイズは、潜在的な個体差と生存のために正規化することをお勧めしますように5 p...

単一ヒドラにおける再生の観察は、実験科学の1,2のような生物学の出現で精液のイベントでした。再生は、生物学者に非常に広くアピールの現象のままと同様に人を置きます。人間の再生の限界を理解し、克服する発生生物学者、臨床医、生物医学科学者や組織のエンジニアの可能性はより本質的に興味深いより再生生物学になります 。 さて、このようなゲノム配列決定およびゲインと機能ツールの損失などの新たな技術を使用して、フィールドが回生機構を離れていじめるために、最終的に他の人がすることはできませんが再生成することができますどのように様々な種を理解する態勢を整えています。 、分子細胞性および形態学的応答における共通の度合いはまだ解明されていないが、今のところ再生することができる動物の間の基本的な応答がimagiであったであろうよりも類似していると思われますNEDのみ一昔前3。 特に、刺胞動物は、形態的多様性の広いスペクトルの中で、ほぼすべての身体の部分のを再生するに容易です。孤独な淡水ポリープから、ハイドラは、ポルトガル人-O-戦争のような複雑な植民地siphonophoresに、広大なサンゴ礁を構築小さな海洋ポリープと共に、再生はのための機構に加えて、多くの場合、再生モードであり、怪我や捕食に起因する破損や紛失の体の部分を修理または改。刺胞動物門の多様な種が再生のために類似または異なるメカニズムを使用するかどうかを根本的に興味深い質問4-6です。 私たち、そして他の人が再生7-17のモデルとして花虫類、Nematostella vectensisを開発してきました。我々は最近、aboraから二分組織の形態学的に均一な片から体全体の再生を記述するためのステージングシステムを開発しましたポリープ10のリットルの終わり。任意のレベルで二分したときNematostellaポリープを再生成することができますが、我々はこれが自然な無性分裂18の通常の平面に近いため一部では、ほとんどの形態学的に単純な地域、physaで尾方の位置で大人をカットすることを選んだ、ともあるため体全体が最も単純な形態学的構成要素から組み立て直されているかを観察し、分子解析を可能にします。 Nematostella再生ステージングシステム（NRSS）は、通常の培養条件下で、切断physaによって再生のいずれかの態様の進捗状況を採点するために使用することができる形態学的ベンチマークの比較的単純なセットを提供したり、実験的にそのような小分子治療、遺伝子操作などの状況を摂動しました、または環境の変化。予想通り、NRSSは再生の細胞および分子事象を参照することが可能な形態学的足場として採用されつつあります10。 最後に、切断の我々の方法は、最近の研究17で使用されるピンポイント穿刺よりも数桁大きいぽっかりと穴を生成し、まだ両方の傷は6時間の周りで癒します。創傷閉鎖の視覚的に逮捕した別個のフェーズを文書化することは傷の大きさと、それを閉じるのにかかる時間の見かけ上の独立性を説明するために実験的アプローチを示唆している必要があります。したがって、このプロトコルによって提供される尾方切断プロセスのより深い視覚的理解は、このモデル再生システムにさらなる研究を支援し、Nematostella vectensisのを使用して、この病期分類システムの適用を拡大します。

<table><tbody><tr><td>Nematostella vectensis、大人</td><td>海洋生物学研究所(MBL)</td><td></td><td>非営利サプライヤー</td></tr><tr><td>ガラス培養皿、250mL</td>カ<td>ロライナ生物学的供給</td><td>741004</td><td>250mL</td></tr><tr><td>ガラス培養皿、1,500mL</td>カ<td>ロライナ生物学的供給</td><td>741006</td><td>1,500mL</td></tr><tr><td>ポリエチレン転写ピペット、5&nbsp;mL</td><td>USAサイエンティフィック&nbsp;</td><td>1022-2500</td><td>ナローボア、目盛り付き</td></tr><tr><td>ポリエチレントランスファーピペット、テーパーSamco</td><td></td><td>202-205</td>は<td>、ワイドボアを作るために先端の1インチを切り取りました</td></tr><tr><td></td><td>使い捨てメスフェザー安全カミソリ株式会社</td><td>第10</td><td>ブレードは湾曲する必要があります</td></tr><tr><td>#5デュモンファインポイントピンセット</td><td>Roboz</td><td>RS5045</td><td>代替サプライヤーが利用可能</td></tr>パイ<tr><td>レックスペトリ皿、直径100ミリメートル</td><td>コーニング</td><td>3160</td>は<td>他のガラスペトリプレートを置き換えることができます</td></tr><tr><td>滅菌6ウェルプレート</td><td>コーニングファルコン&nbsp;</td><td></td><td>他のメーカーの353046または同様の</td></tr>もの <tr><td>滅菌済み12ウェルプレート</td><td>Nunc&nbsp;</td><td></td><td>他のメーカーの150628または類似</td></tr><tr><td>のもの 滅菌24ウェルプレート</td><td>Cellstar、Greiner bio-one</td><td>662-160</td><td>または他のメーカーの</td></tr><tr><td>同様のもの ブラインシュリンプハザリーキット</td><td>サンフランシスコ湾; drsfostersmith.com</td><td>CD-154005</td> 食料品店<td></td></tr><tr><td></td><td>で一般的な</td>ブラインシュリンプ<td>パイレックスグラタンディッシュ</td>を育てるための<td>オプション ブラインシュリンプ</td></tr><tr><td>を育てるためのオプション人工海水混合物50ガロン以上&nbsp;</td><td>インスタントオーシャン;</td><td>drsfoster-smith.com CD-116528</td><td>他のブランドは、</td></tr><tr><td>ストックASWの準備のためのプラスチック浴槽 ASWの準備</td><td>様々な</td><td></td><td>一般的な25ガロンのプラスチックゴミ箱OK</td></tr><tr><td>ポリプロピレンカーボー</td>イ<td>カロライナ生物学的供給</td><td>716391</td><td>ASW @ 12 ppt</td></tr><tr><td>ビーカーの作業ストック用、卒業、4,000 mL</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>B199</td><td>36 pptのASWを12 pptに希釈するための</td></tr><tr><td>実体顕微鏡・光源</td><td>各種&nbsp;</td><td></td><td>連続1〜40倍の倍率</td></tr></tbody></table>

スターレットイソギンチャクの尾方physaから完全ポリープ再生を誘導 nematostella vectensis

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

刺胞動物、具体的にHydraは 、損傷を受けたり、切断構造を再生するために示した第一の動物であった、そして実際にこのような研究は間違いなく250年以上前にトレンブレーの仕事を通じて、現代生物学的調査を開始しました。現在再生の研究では、両方の「クラシック」の再生などヒドラ 、プラナリアやUrodelesのような生物、ならびに海綿から哺乳動物を介して、後生動物の範囲を、スパニング種の拡大スペクトルを用いて復活を見ています。生物学的現象としての本質的な関心に加えて、再生は様々な種でどのように機能するかを理解することは、再生プロセスは、共通の特徴および/または種またはコンテキスト固有の細胞および分子メカニズムを共有しているかどうかをお知らせします。女優のイソギンチャク、Nematostella vectensisは 、再生のための新たなモデル生物です。 ヒドラのように、Nematostellaは古代の門、刺胞動物のメンバーですが、トン内彼のクラス花虫綱、進化的により基礎であるヒドロ虫の姉妹クレード。したがってNematostellaでの再生の側面は、比較し、 ヒドラ及びその他の刺胞動物のものと対比するために興味深いものになります。この記事では、我々は、二等分観察し、physaと呼ばれるNematostella大人の尾方端の再生を分類する方法を提示します。 physaは自然に無性生殖の手段として、核分裂を起こし、自然核分裂またはphysaの手動切断のいずれかは、複雑な形態の再成長と改革をトリガします。ここでは、Nematostella再生ステージングシステム（NRSS）におけるこれらの単純な形態学的変化を成文化しています。私たちは、クロロキンの効果、リソソーム機能ブロックのオートファジーの阻害剤をテストするためにNRSSを使用しています。結果は、自食作用が阻害されたときにポリープ構造、特に腸間膜の再生が異常であることを示しています。

切断されたphysaで再生中の形態学的イベントの進行は、各NRSS段階でphysaの代表的な景色を備えて、図1Aに示されています。典型的なphysa切断部位は、成人（矢じり）に示されています。 図1Aの写真は完全に形成されたポリープを介して新鮮にカットphysaから口頭と身体構造のプログレッシブ再生を示しています。 図1B、Cにはそれぞれ、ステージ4、ステージ5で、腸間膜を内部セプタムの配置を示します。第4段階でいくつかの腸間膜が「プリーツ」を欠くが、大部分はプリーツを開発している必要があり、ステージ5のように修飾することに注意してください。 図1Dは、鉗子（ 図1E）を用いて除去することができる粘液の膜に包まphysaを示しています。再生に有害な通常ではないが（それが不当に動物をトラップしない限り）、膜はphysaを得点妨げと行うことができますこのような分子/生化学分析のための顕微鏡検査、サンプルの固定...

ここでは、モデル刺胞動物のアントゾアンであるStarlet Sea Anemone Nematostella vectensisの再生を誘導し、監視する方法を実演します。 私たちは、形態学的病期分類システムを使用して再生を切断および分類する方法を示し、このシステムを使用して、ポリープ構造の再生におけるオートファジーの必要性を明らかにします。

スターレットイソギンチャクの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導 Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

この手順の全体的な目標は、線虫の先端から除去された組織の小さな部分からの完全なポリープの再生中に発生した予測可能な一連の形態学的変化を説明することですこの方法は、創傷部位の細胞がどのように再編成され、失われた構造を作り直すために展開するかなど、再生生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、比較的複雑なポリープが最小限の形態学的情報から始めて、どのように自分自身を元に戻すことができるかを見たかったからです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、最初の創傷後の病期の進行が粘膜によって不明瞭になることがあるため、非常に重要です。一般に、この方法に不慣れな個人は、ポリープの柔らかく粘着性のあるゼラチン状の性質のために、創傷部位で組織を完全に分離するのに苦労します。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、線虫ステラベクテンシスのコンディショニングから開始します。この手法を使用する場合は、選択した動物が同じサイズであり、同じ摂食やその他の条件パラメーターなど、同じ培養履歴を持っていることが特に重要です。切断の少なくとも1時間前に、選択した動物の皿をインキュベーターから部屋の光の中に移します。幅広のプラスチックピペットを使用して、切断するプールから5匹の動物を、塩分濃度12分の1の人工海水を含む直径100ミリメートルの滅菌ガラス切断皿の底に移します。皿を実体顕微鏡のステージに置き、倍率を10〜40倍に変化させます。ほぼ同じ長さのサイズに合わせたポリープを選択し、切断の3日前からコロニーから分離したボウルに入れます。滅菌メスを使用して、各ポリープからアブラルフィサを切断し、幅が広く腸間膜を含まないフィサのセクションとほぼ同じ長さのフィサを取得します。これを達成するには、メスの刃を切断の目的の部位で動物と接触させます。これは、補助なしで、または5番の鉗子で動物の体を優しくつかむことによって行います。メスの湾曲した刃を体全体に揺らすように動かして、組織を切断します。切断された各ドナーポリープを皿から取り出し、プールされた切断者とラベル付けされた別のボウルに戻します。ボウルの年代測定後、ストックカルチャーに戻します。切断皿に残っている切除されたフィサを人工海水で1, 000分の12の塩分濃度で洗い流します。次に、各フィサを、各ウェルに1,000分の12の塩分濃度で10ミリリットルの人工海水を含むマルチウェル細胞培養プレート内の別々の滅菌ウェルに移します。これらの手順を繰り返して、各ウェルに少なくとも5つのphysaを収集し、各実験的治療のために予約します。physaを含むプレートを、所望の再生速度によって決定される固定温度の温度で温度調節されたインキュベーターに入れます。可変倍率の実体複合顕微鏡を使用してphysaを採点します。切りたての線虫physaをステージゼロとして採点し、切断後、またはDPAを使用して毎日同時に採点を続けます。切りたてのフィサが、透明な風船に似たカップ型の塊として現れ、傷口が開いている可能性が高い場合は、フィサをステージゼロとして採点します。切断傷が閉じているように見える場合は、ステージ1としてphysaを採点します。聴覚ポールの表面が膨らんでいるように見え、放射状に対称的なパターンで配置され、溝で区切られた8つの隆起したアーチが現れる場合は、ステージ2としてフィサを採点します。ステージ2では、アーチの頂点にある小さな半球状のブレブを観察します。これは、幅とほぼ同じ高さで、おそらく一過性で、最初は単一の外胚葉細胞層で構成されています。フィサが老化するにつれて、粘液に包まれることがありますので、鉗子で慎重に取り除く必要があります。内胚葉および外胚葉組織層を含む触手の芽が、少なくともいくつかの橈骨弓の聴覚端に安定して形成されている場合、ステージ3としてphysaを獲得します。physaが体壁の挿入から腔腸内に伸びる8つの異なる目に見える腸間膜を含み、耳のaboral lengthがそのaboral endの咽頭に接続されているように見える場所から測定された半径方向の幅の2倍を超える場合、ステージ4としてphysaをスコアリングします。最後に、フィサにプリーツ付きの腸間膜が4つ以上あり、プリーツがステージ4よりも完全で曲がりくねっている場合は、フィサをステージ5として採点します。ステージ5では、動物はほぼ正常な成体の外観を持っていますが、目に見える性腺細胞はありません。0.1%DMSOで処理されたこの対照群の線虫ステラphysaは、ステージ5まで完全に再生しました。しかし、クロロキンで処理されたPhysaは、完成した腸間膜を完全に形成することができませんでした。クローズアップは、クロロキンでインキュベートされたフィサの腸間膜のプリーツの存在と欠如の両方を示しています。このグラフは、クロロキン処理の集計結果を示しています。10 マイクロモルから 50 マイクロモルの間の治療は、同様の欠陥を引き起こし、主に腸間膜の完全な改革の欠如を引き起こしました。この手法を習得すると、30カットのphysaを含む各6ウェルプレートで1時間未満で完了します。スコアリングは迅速で、おそらく各レプリケートプレートに30分かかります。このビデオを見た後、あなたは、アボラル組織の小さなセクションから完全なポリープの再生中に起こる形態学的変化を視覚化するためにphysaを切断する方法をよく理解しているはずです。この技術の主な利点は、視覚的に均一な組織のカップから完全なポリープの再生の根底にある分子イベントを固定するための形態学的段階を提供することです。この手順を試みる際には、栄養履歴に関して動物を事前に調整すること、成体の腸間膜を除外するために二等分すること、および治療内の変動を減らすために再生するフィサのサイズを標準化することを覚えておくことが重要です。この手順に従うと、例えば、低分子による遺伝子変異やシグナル伝達経路の摂動の影響を評価することができます。あるいは、形態形成の変化は、自己増殖の顕微鏡分析、系統追跡、または部位2遺伝子発現と相関している可能性があります。この技術は、再生生物学の分野の研究者が、このモデル生物の驚くべき再生能力の根底にある細胞生物学、シグナル伝達経路、および形態形成プロセスを探求するための道を開くでしょう。

inducing-complete-polyp-regeneration-from-aboral-physa-starlet-sea

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

モルファント胚を生産する方法は、発生メカニズムや遺伝子制御ネットワークを研究するために不可欠である。海の星Patiria miniataはこれらの研究のための新たなモデル系である。ここでは、胚の培養液を生産、配偶子を取得するためのプロトコルを提示しており、この種から接合体の急速なマイクロインジェクション。...

のマイクロインジェクション法 Patiria minata接合体

プラナリアSchmidtea メディテラネアは、幹細胞と組織再生を研究するための優れたモデルです。この文書では、化学のアジに動物を公開することによって 1...

化学の切断とSchmidtea メディテラネアプラナリアの咽頭再生

巨大な繊毛虫ラッパムシは、創傷治癒と再生を研究する優れたシステムです。単一細胞または細胞断片からラッパムシ細胞培養の確立、切断細胞による再生を誘導する、化学的に membranellar...

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このプロトコルの目的は、胚を犠牲にすることなく、胃形成中に海アネモネネネメテラステッラベクテンシスを遺伝子入力することです。...

初期開発におけるアネモネのジェノタイピング

ここでは、イソギンチャクから粗毒抽出物を取得し、その溶血作用およびホスホリパーゼ活性を検出するためのプロトコールについて記載する。...

簡単なバイオアッセイによる海アネモンからの粗抽出物中の溶血性およびホスホリパーゼ活性の同定

ポリープ救済は、急性ストレスによって誘発されるプロセスであり、サンゴポリープがコロニーに接続している組織を消化し、そこから剥離して個体として生きる。本プロトコルは、ハイパー生理食塩水またはカルシウムフリー海水処理を用いた救済によってサンゴのマイクロプロパゲーションを誘導する方法を記載している。...

サンゴのコロニーでポリープ救済を誘導して、実験室での実験的使用のための個別化されたマイクロ増殖物を得る

本論文では、生きた Clytia hemisphaerica medusa の上皮に創傷を作製し、 in...

刺胞動物モデル生物Clytia hemisphaericaを用いたin vivoでの上皮創傷治癒の特徴付け

ライブイメージングに適した、クテノフォア Mnemiopsis leidyiのスタトシストおよび関連組織を除去するための簡単なプロトコルについて説明します。...

再生性の高い栉胞における複雑な感覚器官の外科的除去

ショウジョウバエの血液細胞、または血球は、常駐部位と循環の間を循環します。 幼虫では、常在性(固着性)血球は誘導性微小環境である造血ポケットに局在し、循環血球は血リンパ液中を自由に動きます。このプロトコルの目標は、これら 2...

の血液細胞集団のアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

ここでは、TetONシステムを使用して、再生する成体のゼブラフィッシュの尾びれに組織特異的な遺伝子発現を達成するためのワークフローを概説します。...

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

学ぶNematostella vectensisの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導する手法。この実験系は刺胞動物の再生メカニズムと幹細胞生物学を研究する上で重要なモデルとなります。

スターレットイソギンチャクの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導 Nematostella vectensis

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