の剛性を測定します ex vivoでマウス大動脈
2016年10月19日
私たちは、マウスからの大動脈の分離と、原子間力顕微鏡を用いたそれらの弾性率の測定のための詳細なプロトコルを提示します。
このプロトコルの全体的な目標は、原子間力顕微鏡を使用してマウス大動脈のEx Vivo弾性率を測定する手順を説明することです。この方法は、心臓血管疾患や老化など、血管の生体力学や疾患分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、動脈や細胞などの柔らかい生体サンプルのAFM特性を、ダノスケールレベルで高い精度で特徴付けた生体力学的特性です。
私はAFMの手順を発表し、当研究室の研究員であるShu-lin Liu博士がマウスアオルタの単離方法を紹介します。まず、マウスを安楽死させ、付属のテキストプロトコルで説明されているように大動脈まで解剖します。小さな鉗子を使って大動脈の周りの脂肪をつかみ、小さなハサミを使って大動脈の周りの脂肪を丁寧に切り取ります。
次に、鉗子で大動脈をそっとつかみ、上行大動脈の始まりで血管を貫通する切り込みを入れ、下行大動脈の終点、腹部大動脈のすぐ上にもう1つの切り込みを入れます。解剖した大動脈を、カルシウムやマグネシウムを含まないPBSを含む60ミリメートルの皿に移します。皿の中で、大動脈から残っている脂肪組織を解剖し続けてから、大動脈を縦方向に開きます。
次に、下行大動脈から2mm×4mmのピースを、大動脈弓から同じサイズのピースを、原子間力顕微鏡で分析するために切り取ります。これらのティッシュを新しい60ミリメートルのプラスチック皿に入れ、PBSを一滴垂らして湿らせておきます。大動脈に触れずに、ラボワイプを使用して組織の周りからPBSを慎重に取り除きます。
組織の管腔側が上を向いていることを確認し、5〜10マイクロリットルのシアノアクリレート接着剤を使用して、開いた大動脈の両端をプレートに優しく接着します。このプロセス中に大動脈が伸びないことが重要です。終了したら、接着された大動脈が折りたたまれたり浮いたりしていないことを確認します。
大動脈の接着剤を30〜60秒間風乾した後、PBSを静かに加え、サンプルを沈めます。ピンセットを使用して、硝酸シリコーンAFMプローブを球形の先端でプローブホルダーにスライドさせます。次に、プローブホルダーをAFMヘッドのZScannerマウントにしっかりと固定します。
次に、AFMソフトウェアを開きます。実験の種類を選択するには、 [実験カテゴリ] に移動し、 [連絡モード] を選択します。次に、[Experiment Group]に移動して[Fluid]で[Contact Mode]を選択し、最後に[Experiment]に移動して[Fluid]で[Contact Mode]を選択します。
これらを選択したら、[Load Experiment] をクリックします。これにより、レーザーがオンになります。次に、付属のテキストプロトコルで説明されているように、レーザーのアライメントに使用するサンプルを準備します。
サンプルをAFM上に置きます。レーザー位置決めノブを調整して、レーザースポットをAFMプローブの先端に配置します。次に、検出器の位置決めノブを使用して、垂直たわみの値がゼロから負の1ボルトの間になり、水平偏向がゼロボルトに近づくまで、フォトダイオードの位置を調整します。
次に、レーザーのSum Signalが最大化されていることを確認します。必要に応じて、AFMチップ上のレーザービームの位置とフォトダイオードの位置を再調整して、最大合計信号を取得します。キャリブレーションを開始するには、チェックパラメータを選択し、スキャンサイズのパラメータをゼロに設定します。
スキャンレートを1ヘルツに設定します。[Sample/Line] を 256 に、[Deflection Setpoint] を 20 ナノメートルに設定します。次に、[エンゲージ] を選択します。
プローブがプレートの表面に接触したら、[ランプ]をクリックします。次に、スキャンツールバーメニューで拡張モードを選択し、ここに示すようにパラメータを設定します。ランプツールバーで、ランプ連続体を選択し、プレート上の力曲線を取得します。
この力曲線では、Channel 1をDeflection Errorに設定して、ソフトウェアが垂直方向の変位対Z位置として結果をグラフ化できるようにします。フォースカーブの左端または右端をクリックし、カーソルをドラッグして、直線にフィットするフォースカーブの線形領域を囲みます。次に、ツールバーで[ランプ]を選択し、[感度の更新]をクリックします。
現在の値を記録します。次に、[キャリブレーション]を選択し、[検出器]をクリックします。[Deflection Sensitivity] ボックスの 5 つの測定値から値と平均値を入力します。
「Withdraw」を2〜3回クリックすると、AFMヘッドが上がり、サーマルチューンプロセス中にAFMチップとプレートが相互作用するのを防ぐことができます。次に、ツールバーの「Thermal Tune」をクリックします。サーマル チューンの範囲を 1 から 100 キロヘルツに設定し、たわみ感度補正を V 字型カンチレバーの場合は 1.144、長方形カンチレバーの場合は 1.166 に設定します。
Thermal Tuneメニューで、Acquire Dataをクリックしてサーマルチューニングカーブを取得します。次に、曲線の両側に赤い破線を線に置き、データにより適したローレンツまたは単純調和振動子モデルのいずれかを選択します。次に、フィットデータをクリックし、スプリングKの計算を選択してこの値を保存します。
大動脈組織を収めた60mmの培養皿を顕微鏡ステージに置き、磁気プレートホルダーでプレートを固定します。大動脈がカンチレバーにかみ合ったら、ピエゾの中心が安定していることを確認し、[ランプ]をクリックします。[Ramp Size] を 3 マイクロメートルに、[Trigger mode] を [Relative] に、[Trigger threshold] を 100 ナノメートルに設定します。
次に、ランプ連続を選択します。プローブとサンプルの間の接触点が、Zランプサイクルのほぼ中央から下部の4分の3に発生していることを観察します。これが観察されない場合は、サンプルから離れ、必要に応じてランプサイズを調整し、サンプルを再度関与させます。
次に、メニューバーの「顕微鏡」をクリックし、「エンゲージ設定」を選択します。SPM の引き出しを 30 マイクロメートルに変更し、[OK] をクリックします。フォースカーブを観察した後、メニューバーのキャプチャをクリックし、キャプチャファイル名を選択します。OOOで終わるファイル名を入力し、指定したフォルダを選択してデータを保存します。
解析を開始するには、フォースカーブ解析ソフトウェアを開き、解析するファイルをロードし、付属のテキストプロトコルで説明されているようにデータを変更および平滑化します。次に、メニューバーで[ベースライン補正]を選択し、ここに示すように入力を設定します。次に、グラフ上の垂直の青い点線を調整して、フォースカーブの平らな部分を囲み、[実行]をクリックします。
次に、ツールバーメニューの「インデント」をクリックし、次のように入力を設定します。これらの値を保存し、互いに短い距離で取得される領域ごとに 5 つの力曲線を測定することにより、各関心領域のヤング率を分析します。組織サンプルの全体的な剛性を決定するには、組織内のサンプル領域の5つの異なる領域で最大25回の測定を行う必要があります。
これらの領域は、大動脈弓や下行大動脈など、さまざまな場所の組織を比較するために使用できます。これらのグラフでは、マウス大動脈の同じサンプルからの下行大動脈と大動脈弓の代表的な力曲線が示されています。このデータに基づいて、グループごとに弾性率を計算し、異なる領域や条件間で比較するために使用できます。
このビデオを見れば、マウス大動脈を適切に分離し、原子間力顕微鏡で弾性率を測定する方法についてよく理解できます。この手順を試みた後は、組織単離直後にAFM測定を行うことを忘れないでください。一度習得すれば、大動脈の単離はマウス1匹あたり約45分で完了し、AFMの測定と分析は適切に行われれば1時間半で完了することができます。
この手順に続いて、免疫蛍光アッセイや増殖アッセイなどの他の方法を実行して、血管リモデリングまたは血管平滑筋細胞の増殖に関連する追加の質問に答えることができます。
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概要
本記事では、マウスから大動脈を分離し、原子間力顕微鏡（AFM）を用いてその弾性率を測定するためのプロトコルを紹介します。ここに記載された手法は、血管のバイオメカニクスおよび関連疾患を理解する上で極めて重要です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 血管バイオメカニクス
- 原子力間顕微鏡
- 心血管疾患研究
背景
- 血管の機械的特性を理解することは、心血管系の健康を研究する上で不可欠です。
- AFMを用いることで、軟らかい生物学的組織のバイオメカニクス的特性を精密に測定することが可能です。
- 本研究では、ヒトの血管疾患のモデルとしてマウスの大動脈に焦点を当てています。
- 本プロトコルは、この分野の研究者に信頼性の高い手法を提供することを目的としています。
研究目的
- マウス大動脈の弾性率を測定するための手順を記述する。
- 疾患および老化の観点から、血管力学への理解を深める。
- 生体力学的特性に関心を持つ研究者に向けた詳細な手法を提供する。
使用方法
- マウスの安楽死および大動脈の単離。
- 原子間力顕微鏡を用いた弾性率の測定。
- 解析に向けた大動脈調製のための精密な解剖手技。
- ナノスケールにおける生物力学的特性の評価。
主な結果
- バイオメカニカル試験に向けたマウス大動脈の正常な単離。
- AFMを用いた弾性率の正確な測定。
- 血管組織の機械的特性に関する知見。
- 心血管疾患の理解に対する潜在的な意義。
結論
- 概説されたプロトコルは、血管力学を研究するための信頼性の高い手法を提供します。
- AFMは、軟らかい生物学的試料を特性評価するための有用なツールです。
- これらの知見は、心血管研究の進展に寄与する可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
原子間力顕微鏡（AFM）を用いたマウス大動脈のex vivoにおける剛性の定量測定は、心血管疾患のモデリングおよび老化研究に直接的に関連する高解像度のバイオメカニクス的データを提供します。この手法により、初期創薬における血管リモデリングおよび平滑筋細胞生物学のメカニズム的なリスク低減とターゲットバリデーションが可能になります。AFMベースの剛性プロファイリングを統合することで、前臨床モデル選択における予測精度の向上および血管治療薬のトランスレーショナルなバイオマーカー開発への信頼性を高めることができます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 血管組織の力学的特性を直接的に解析でき、仮説に基づいた標的バリデーションを可能にします。
- 疾患や介入に関連するバイオメカニクス的な変化を定量化することで、メカニズムの解明によるリスク低減をサポートします。
- 候補物質の優先順位付けのための機能的なリードアウトを提供し、ポートフォリオの選別を効率化します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- ダウンストリームの化合物スクリーニングワークフローに向けた、検証済みのバイオメカニカルアッセイを構築します。
- アッセイの標準化のために、再現性のある定量的な弾性率測定を提供します。
- 治療的介入のスケール可能な比較評価に向け、生物学的システムを準備します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 前臨床モデルを疾患に関連するバイオメカニカルなエンドポイントに適合させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- 組織力学を機能的アウトカムに結びつけることで、リスク調整後の進展判断を可能にします。
- 剛性と血管リモデリングまたは細胞増殖を相関させることにより、バイオマーカーの開発を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このAFMベースの剛性測定法は、ターゲットバリデーション、アッセイ開発、および血管系疾患のトランスレーショナルリサーチを橋渡しし、初期探索から前臨床までのコンティニュアムに適合します。
- ディスカバリーバイオロジー：血管剛性をメカニズム的なエンドポイントとした定量的な仮説検証を可能にします。
- スクリーニング：比較分析のための標準化され再現性のある生物力学的リードアウトを提供します。
- アナリティクス：条件間の統計的比較を裏付けるために、力曲線データおよび弾性係数値を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：ex vivoの組織力学を疾患モデルやバイオマーカー戦略に結びつけます。
- エンタープライズ再利用：血管研究プログラム全体で生物力学的評価に利用可能な再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：血管標的のバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値：生体力学的測定を標準化し、再現性と拡張性を確保する。
- 戦略的価値：初期段階のプログラムのリスクを低減することで、Go/No-go決定に情報を与え、資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けおよび血管治療薬候補の推進を支援する。
実施上の考慮事項
- AFMの操作および生物力学的データ解析に関する専門知識が必要です。
- 校正済みのAFM装置およびフォースカーブ解析ソフトウェアへのアクセスが不可欠です。
- 組織調製および測定プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 異なる血管組織や疾患モデルに合わせて調整が必要な場合があります。
- 生物力学的な完全性を維持するためには、単離直後の測定が極めて重要です。
バイオファーマに関するよくあるご質問
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
Preparing the Mouse and Isolation of the Aorta
2:06
Preparing Tissue Samples for the AFM Measurements
2:46
Loading the AFM Probe and Aligning the Laser
4:16
Calibrating the Deflection Sensitivity and Spring Constant of the AFM Probe
6:28
Measuring the Elastic Modulus on Mouse Arteries Ex Vivo
7:50
Data Analysis
8:47
Results: Determining Aortic Stiffness
9:29
Conclusion
