Name: 実証、メタゲノムと計算手法を照らす殺菌剤妥協ミツバチ健康メカニズム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学ぶ、殺菌剤がBombus属マルハナバチの花粉微生物叢を変化させ、コロニー衰退を引き起こすメカニズム。次世代シーケンスと野外・室内実験で、微生物共生の破壊と幼虫死亡率の関連を解明する。

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著者に感謝に関する技術的な支援を提供するため増幅とシーケンス処理設備とサービス、ケイトリン カールソン、ジェニファーのコツ、ジェイク オットー、マックス Haase を提供するウィスコンシン大学バイオ テクノロジー センター DNA シーケンスの施設分子分析。この作品は、米国農務省農業研究サービス充当資金 (現在研究情報システム #3655-21220-001) によって支えられました。これ以上のサポートは (グラント号下の国立科学財団によって提供されました。DEB-1442148)、DOE グレイト レイクス バイオ エネルギー研究センター (科学 BER デ-FC02-07ER64494 の DOE のオフィス)、および米国農務省農業研究所と農業 (ハッチ プロジェクト 1003258)。C.T.H. は医科学とそれぞれピュー慈善信託とアレクサンダー ・ フォン ・ フンボルト財団によってサポートされて、アルフレッド Toepfer の教員仲間でピュー学者です。

1。 バンブレ蜂コロニーの成功を使用してフィールド ケージ実験に殺菌剤曝露の効果を調べる フィールドで <ol>を 10 セット <li>メッシュ ケージは麦が植えられました。各ケージの周りトレンチを掘るし、蜂が逃れることができないように地面にメッシュ ケージの 4 つすべてのエッジを掘る。ハチ (例えば ソバ、ルリヂサ、ミヤマナズナ属、コスモス、ひまわり) を知られている、鉢植えな顕花植物とケージをストック ( 図 2).</li>
	<li>は、ブルームのクローバーのシングル トレイ (36 cm × 42 cm) とケージを補足します。スペース約 2.5 m x 1 m 単調な生活残りのケージ領域を麦でケージの 1 つのコーナー内の花のリソースをクラスターします</li>。
	植民地、各含んでいる労働者と単一の女王、治療 <li>ランダム熊蜂を割り当てる (殺菌剤あり/なし、N = 治療当たり 5 植民地、植民地 10 合計)、フィールド ケージ内配置 (N = 1/ケージ) 29 日 (6 月 23 日-7 月 21 日 2014).</li>
	<li>オリエント コロニー ボックスその植民地 &#39; s 開口部がミツバチをナビゲーションの最適の条件を提供する南を指します。砂糖水の膀胱、蜜可用性を補完するハイブ ボックス内に配置を持つコロニーを補助します</li>。
	<li>適用草花 5 殺菌剤治療中にフィールドに関連するレベル (20 g/L) クロロタロニル ベース殺菌剤は手を使って研究 (一日 0 や 13) 中に 2 回農薬噴霧器を開催しました。花の表面 ( 図 3) にさらに液体の付着がありませんその花を均一にコートします</li>。
	<li>ケージ調査の結論で、ケージから B. インパチェンス 植民地を手で削除、20 分-20 ° C のフリーザーに置くことによってじんましんをクールな</li>
	<li>を取り外して滅菌鉗子を用いたミツバチ幼虫、蛹、大人の女性の数を記録 (私 。e. 受動的探索担当)、および大人の男性。母女王、幼虫、蛹、(すなわち 受動的探索担当)、成人女性、成人男性の乾物重を記録分析用天秤を使用します</li>。
</ol> 2。へまをする蜂の巣室を用いた In Vivo 試験の花粉対策で微生物に殺菌剤影響を調べる 標準を使用して細かい粉に <ol><li>廃タイ市販購入した花粉研究所ボールミル。粉末花粉を滅菌するには、紫外線の下で一晩蒸発することができます 70% エタノールに浸漬します。汎用寒天に ~0.5 mg をメッキすることによって花粉の不稔を確認します。
	<ol><li>乾燥、滅菌ピペットを使用して滅菌の花粉を追加殺菌剤の投与量を関連するフィールド: 14.3%; propiconazole トリートメントの 22.9% でアゾキシストロビン (0.74 μ L と 0.65 μ L それぞれ/日ハイブ/)。滅菌を木の棒でよく混ぜ</li>。
	</ol></li> <li>場所 6 実験ハイブ (n = 3 の各コントロールと治療のため) で部屋の温度で維持されるクリーンで衛生研究所ベンチトップ。毎日花粉 34 , 35 防かび剤 (トリートメント) 用または (制御用) 標準的な無菌技術を使用してフード内の滅菌水と混合の 4.27 g の重量を量ます。
	<ol><li>トラップ ドアの外側のじんましん、段ボール箱の側面によって提供されるを使用してハイブ内の花粉を紹介します。毎週滅菌糖溶液とハイブを補足します。4 週間以内に政権を与え続ける</li>。
	</ol></li> <li>研究室での研究の結論で滅菌鉗子とへらを使用してひな部屋内に含まれる花粉規定を 20 分こすり-20 ° C のフリーザーに置き、滅菌ストレージ管場所ハイブをクールします。-80 ° c. の数と労働者と開始時と実験 (ステップ 1.7) の最後の女王の母の重量のレコード ストア</li>。
	<li>市販 DNA の隔離を使用して花粉規定サンプルからの DNA の分離キット (詳細については表を参照してください).
	<ol><li>抽出への花粉提供の 0.25 g チューブ、簡単にミックスする渦を追加します</li>。
		<li>は、50 μ L/サンプルについて十分な脱イオン蒸留水に 200 mg/mL のリゾチーム ソリューションを行います。完全にフォーム ソリューションを積極的に振る</li>。
		<li>は、リゾチーム溶液 50 μ L を加える、それのサンプルを抽出管と複数回の反転でよく混ぜます。37 の ° C の水浴中で 10 分間のチューブを孵化させなさい。沈殿物が形成されている場合熱 60 ° C まで使用する前に溶解するソリューションです</li>。
		<li>追加 70 μ L 水溶液溶解抽出管にソリューションの保護、テープでフラット ベッド渦パッドの水平と 30 10,000 x g で 10 分間遠心分離渦管常温 s.</li>
		<li>は、きれいな 2 mL コレクション チューブに上清を転送します。4 ° C の氷浴で 5 分で 5, 加温のタンパク質沈殿物溶液、渦の 250 μ L を追加します 。
		注: は、500 μ L の上清を 400 μ L の間期待してください。上清はまだいくつかの粒子を含めることができます</li>。
		<li>10,000 × g で 1 分間室温でチューブを遠心し、上清の最大 600 μ L をクリーン 2 mL 管に転送します。水性阻害剤除去ソリューション、簡潔に、渦の 200 μ L を追加し、, 5 分遠心 10,000 x g に 1 分間室温でチューブはクリーン 2 mL コレクション チューブに上清の 750 μ L まで転送のための 4 ° C で</li>。
		<li>培養上清と 5 の渦に水性バインド ソリューションの追加 1200 μ s. スピン フィルター、および 10,000 × g で遠心する室温で 1 分に清約 675 μ L をロードします。流れを破棄します</li>。
		<li>繰り返す 2.4.7 2 回。 。
		注: 処理の各サンプルに対して 3 つの負荷の合計が必要です</li>。
		<li>追加 500 μ L エタノール、室温で遠心する 30 の 10,000 x g に s、流れを破棄し、再びクリーン 2 mL 採取管の g. 場所スピン フィルター x 10,000 で 1 分間室温で遠心分離します</li>。
		フィルター膜の中央に <li>追加 100 μ L の溶出バッファー。30 間室温で遠心 10,000 x g に s スピン フィルターを破棄します。ストアは、-20 ° C から-80 ° C の間に DNA を集めた</li></ol></li> <li>シーケンスの DNA を分離使用。
	<ol><li>定量化するため、蛍光分析で 2 ng/μ L の DNA の分離を正規化します。
		28 s の相対的な量を比較する抽出されたサンプルごとに 3 通 <ol><li>準備反応 (工場)、その (真菌)、分析および各花粉規定サンプル 36 の 16S (細菌) コンポーネント。各反作用に 10 が含まれていることを確認総 DNA、非対称シアニン染料ベースのマスターの組合せの 2 x および前方および逆のプライマー組 28KJ/28 b 37 植物と真菌 DNA の its 1 領/ITS5.8R 各 2.5 μ の ng 38.</li>
		</ol></li> <li>増幅 DNA の次のパラメーターを使用して: 50 ° c、2 分初期変性 95 ° C で 2分前の変性のサイクルの 40 (15 98 ° c、15 s 58 ° c、60 s s 72 ° c)、融解曲線が続く</li>。
		<li>準備 2 ステップ、入れ子になったターゲット 16S rRNA 次世代シーケンシング ライブラリを使用して PCR のプロトコル V3 ・ V4 の可変領域と ITS/5.8 s rRNA スペーサー領域。
		各プライマーのマスター ミックス × 2 <ol><li>追加 12.5 μ L DNA の 5 pmol。(16 s またはその; の表 1 を参照してください)、各地域別の反応を確認します。前述の 39 , 40 遺伝子特定シーケンスにシーケンサー固有のアダプター突出部分塩基配列を追加する領域特異的プライマーを変更します</li>。
			<li>次のパラメーターを使用して初期の増幅を行う: 3 分初期変性 95 ° c、25 サイクル (30 95 ° c、30 秒 55 ° c、30 秒 s 72 ° c)、72 で 5 分最後の拡張 ° C</li>
			<li>次最初の増幅、電気泳動の移動性によってライブラリのサイズ、および量を確認、ボリューム固相リバーシブル imm x 1 を使用してきれいに残存プライマーと反応試薬を削除する obilization ビーズ。プール 16S、各サンプルの単一私アンプリコン プールを作成する定量的その amplicons</li>。
			<li>は、シーケンサー特定アダプターを追加し、次のプライマー (表 1 を参照) を使用して特定のデュアル インデックスのサンプルします。各プライマーのマスター ミックス × 2 5 pmol に増幅された DNA の 2.5 μ L を追加します。次のパラメーターを使用してライブラリの増幅を実行: 3 分初期変性 95 ° c、8 サイクルの (30 95 ° c、30 秒 55 ° c、30 秒 72 ° c s)、72 で 5 分最終的な拡張 ° C</li>
		</ol></li> <li>次の PCR、1 x 量の固相リバーシブル固定化ビーズを使用してクリーンな完成のライブラリ。電気泳動の移動性と蛍光分析、それぞれ使用して完成したライブラリの質と量を評価します。ライブラリに 2 μ M およびシーケンスの前にプールを標準化します</li>。
		<li>プラットフォーム全体私アンプリコン 41 をカバーする適切な長さと、セカンダリの PCR で追加アダプターに似てに次世代シーケンスを実行します</li>。
	</ol></li> <li>シーケンス アノテーションと微生物組成分析。
	<ol><li>コンバインすべてシーケンスされたライブラリの単一のコンティグにシーケンス データをペア ・ エンド (R1 及び R2)。R1 と R2 の両方のファイルをマージするには、ライブラリごとに単一の fasta ファイルが生成します 。
		注: この手順およびプロセス (特記されない場合は) 下記 Mothur バージョン 1.38.0 38 で実行されます</li>。
		<li>画面のあいまいな拠点、予期しない長いシーケンス、および長いホモポリマーを削除する各 fasta ファイル 。
		注: スクリーニング、およびシーケンス除去のパラメーターは、maxambig = 0、maxlength = 600、および maxhomop 両方の遺伝子の 8 を =。同一のシーケンスを削除が、個別に、すべてのライブラリ (別名 Mothur でカウント表) contingence テーブルを保持します</li>。
		<li>シルバ データベース バージョン 123、に対して遺伝子 16S ライブラリとその団結データベース 42 に対して遺伝子 ITS ライブラリの一意のシーケンスを配置します 。
		注: シーケンスは、属のレベルに国レベルから注釈する必要があります。
		<ol><li>クラスターがシーケンスを配置後、diff を使って関数 pre.cluster = 5 とキメラを削除します</li>。
		</ol></li> <li>王 43 (遺伝子 16S) のシルバと (遺伝子 ITS) のためには、「その団結分類ファイル (80% のカットオフ値) に基づいてメソッドを使用してシーケンスを分類します。</li>
		<li>は Mothur の分類プロセス中に生成された contingence テーブル (1 つの遺伝子) R 44 に読み込みます。各分類レベルで、さらに微生物群集変化分析ライブラリごとの相対的な豊かさを取得します 。
		注: 各分類レベルで一緒にマージ分類相対的な豊かさはすべての実験の繰り返しの 2% 未満と</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ミツバチの健康に対する薬剤の効果への調査は、害虫管理戦略の流面を残っています。ミツバチ減少の潜在的な要因を明示的に分離する相補的な技術のスイートを使用して、この知識のギャップを埋めることを目指します。計画、理論的根拠、およびこれらの実験のレンダリングは次のとおりです。
この人口統計学の分析を損なわれてしまいますので、ケージを用いた実験のメッシュを脱出する蜂が許可されないことを確認することが重要です。また、人工の巣は雨や直射日光から保護するために十分な断熱材を持つことが重要です。殺菌剤、巣に直接スプレーしないようには注意が必要があります。植民地は、蜜集めを補完し、脱水を防ぐために砂糖水膀胱が提供されなければなりません。
実験室ベースの飼育実験、花粉の食事を準備するときに、汚染を防ぐために厳格な無菌条件を維持しなければなりません。市販購入した花粉を粉末が必要し、UV 殺菌使用する前に。ハイブ衛生は、パントリー蛾やゴキブリなど余分な寄生虫からの侵入を防ぐために維持する必要があります。流体の膀胱は、脱水症状を防ぐために滅菌の糖溶液で補...

管理し、野生ハナバチの種は、両方の自然と農業システムの1の主要な意味を持つ、広範な低下を経験しています。この問題の原因を理解するための努力にもかかわらず蜂蜜ミツバチ減少の要因はまだよく理解されて2,3,4。野生では、ネイティブのミツバチの特定の種、状況は悲惨な5,6になりました。産業としての農業と交差する、彼らの人口は、秋に引き続き、花粉 (世界生産の7の 35%) を必要とする作物に耐えるだろうとミツバチの人口を維持できない場合は、収穫を削減しました。
蜂蜜蜂の減少、農薬の露出、病気、および生息地の損失1,4,8,9,10など多くの潜在的な要因が関与しているとき比較的少しネイティブ蜂健康、または農業システムの近くにこれらのストレスのインタラクティブな効果について知られています。多くの現在の研究努力は、過去の研究を示していますが殺菌剤が蜂の低下で、記憶形成を損なうことによって役割再生も殺虫剤、(例えば、ネオニコチノイド11,12) に注力していきます嗅覚フロント13、巣認識14、酵素活性、代謝機能15,16,17。グローバルに、殺菌剤は満開で開花作物に適用し続けます。最近の研究は、蜂はよく戻るハイブに18、確かに殺菌剤残留物をもたらす、研究が含まれているテストのハイブ殺菌剤の残留19,20の大きい割合を示していることを記載しています。その殺菌剤の残留率が高い蜂蜜蜂幼虫死亡率21,22,23とコロニー内で「花粉の埋葬」の存在に関連付けられてそれ以上の仕事は明らかにするが、無毒微生物活性を欠いているし、栄養学的危害を受けた24です。殺菌剤「蜂セーフ」が考慮されて長いことにもかかわらず、証拠は今単独で殺菌剤への曝露ネイティブ バンブレ蜂種25マルハナバチ インパチェンスの深刻な植民地損失を引き起こす可能性が。
殺菌剤暴露と植民地との間の因果関係を確立するには、死亡率、これらの化学物質の手口を決定する必要があります。土26、堆積物中の27日、水生環境28菌をターゲットによって証明される、最も可能性の高い殺菌剤変更真菌豊富と花粉規定、それにより主要なコミュニティを呼び出す内の多様性をシフトします。細菌を強く支持可能性があります。真菌の競合他社や拮抗薬、病原性の細菌は比較的オフ、花粉規定の腐敗を促進する増殖できます。過去の研究は実証、微生物、酵母や糸状菌、特に蜂29,30,31栄養共生として、寄生虫および病原体32 からの保護 ,33, 花粉店の長期保存を提供。防かび剤、したがって、直接害を与えるかもしれないない未熟な蜂がこれらのサービスを提供するために必要な微生物群集を混乱させることによっておよび/または日和見主義の病原体や寄生虫12への感受性を高めることによって。食料生産の需要増加に伴い、世界中の作物がされて毎年殺菌剤を噴霧ブルームは、このような殺菌剤による影響の大きさを理解する必要性を強調する中に。
まで、主な知識のギャップに関するネイティブ蜂微生物生態学は次の質問によって表すことができる:どの程度は殺菌剤変更蜂花粉規定内の微生物コミュニティ?深く変えられた群集で花粉を消費の下流への影響は何ですか?これらの生態学的関係の質問を維持し、実験は、明らかに 1 の主な目標で開発された) 単独でその殺菌剤残渣ネイティブ蜂種; 重度のコロニーの低下を引き起こす可能性が2) 殺菌剤、および 3 によって変更されます花粉規定の微生物群集する程度) ミツバチの健康の深刻な変更された微生物群集による影響します。実験の目的は、実験室およびフィールド ベースの組み合わせを使用して上記の質問に対処するため定義されました。新式のメタゲノムと従来のフィールド観測の方法と一緒に分子技術を使用して、この研究はミツバチの健康に対する薬剤の潜在的な効果を一緒に作品を目指しています。
本研究の第一の目的は、殺菌剤暴露のみでネイティブ蜂種の間で重要な植民地の損失を引き起こす可能性を示すことです。大規模なフィールドのケージを含む研究は、マルハナバチ インパチェンス米国 (図 1図 2図 3) で、ユビキタス、豊富なネイティブ蜂のコロニーの成長に及ぼす殺菌剤曝露の調査に使用されました。殺菌剤処理じんましんであれば、低いフィットネスと非曝露ハイブと比較して非定型の人口統計、仮説。この実験から得られたデータは、花粉内の殺菌剤の残留物がネイティブ バンブレ蜂種25で深遠な植民地の損失の唯一の原因をすることができますを示す、この仮説をサポートされています。本研究の第二の目的は、殺菌剤の曝露に花粉マイクロバイの応答を調査するためです。それは、殺菌剤にさらされる花粉規定内微生物の群集構造が異なる未処理花粉のこと仮定されます。真菌の豊かさと多様性を期待して、大幅に低下する、細菌および/または単一の支配的な真菌種可能性が大きくなります他の競合する菌の有無のチェック。一連の生体内試験、メタを使用してこれらの微生物群集組成の変化を分析します。

<table><tbody><tr><td>Natupol Beehive</td><td>Koppert</td><td>USRESM1</td><td>16 じんましん</td></tr><tr><td>Propiconazole 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazole 14.3%</td></tr><tr><td>Abound</td><td>Syngenta</td><td>4033540</td><td>Azoxystrobin 22.9%</td></tr> <tr><td>Chlorothalonil</td><td>Syngenta</td><td>3452</td><td>試験に使用される殺菌剤</td></tr><tr><td>花粉顆粒</td><td>蜂 救助 B004D5650C</td><td></td><td>3X 16ozボトル、試験用花粉</td></tr><tr><td>接種用細菌株</td><td>カリーラボ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>接種用酵母株</td><td>ヒッティンガーラボ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プライマーペア</td><td>UWバイオテクノロジーセンター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA分離キット</td><td>Mo Bio</td><td>12830-50</td><td>市販のDNA分離キット</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HSアッセイキット</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーQ32851</td><td>DNA定量ツール</td></tr><tr><td>CFX</td><td>Thermo Fisher</td><td>4472952</td><td>SYBR GreenER色素を使用したリアルタイムPCRに使用します。</td></tr><tr><td>リアルタイムPCR解析システム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1855196</td><td>PCR増幅</td></tr>用<tr><td>機器 PCRクリーンアップキット</td> <td>Axygen</td><td>10159-696</td><td>未取り込まれたdNTPs、塩、酵素の効率的な除去に使用</td></tr><tr><td>DNA 1000キット</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>DNA断片のサイジングと解析に使用</td></tr><tr><td>MiSeqシーケンサー</td><td>イルミナ</td><td></td><td>次世代に使用シーケン</td></tr><tr><td>シング 各種ガラス製品(ビーカー、フラスコ、ピペット、試験管、レピッター)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

実証、メタゲノムと計算手法を照らす殺菌剤妥協ミツバチ健康メカニズム

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

生産者は、しばしば病は、殺菌剤残留物に蜂を公開に対する作物を保護するために花の中に殺菌剤散布を使用します。「蜂-安全」と考えられるが、花粉で殺菌剤の残留物が (蜂蜜とバンブレ蜂種) の蜂の減少に関連付けられている証拠があります。メカニズムは比較的知られていないまま、研究者は、蜂と微生物の共生が関与していることを推測しています。微生物は、保全や蜂の幼虫の栄養となる花粉の処理に重要な役割を再生します。微生物群集を変更すると、殺菌剤これらの微生物を介したサービスを妨害、ミツバチの健康危険にさらされる可能性が。本稿では、間接機構、殺菌剤のコロニーの低下を引き起こしている可能性を調査するために使用されるプロトコルについて説明します。殺菌剤処理の花に蜂を公開ケージの実験は既に殺菌剤がネイティブ熊蜂 (マルハナバチ インパチェンス) で深遠な植民地の損失を引き起こすという最初の証拠を提供しています。殺菌剤のフィールドに関連する線量を使用して、一連の実験は、殺菌剤にさらされた花粉群集動態の細かい説明を提供するために開発されています。次世代シーケンサーとメタゲノム解析、花粉マイクロバイ内真菌と細菌群集の構造の組成の変化を調べた。ここを開発した実験は、殺菌剤が花粉規定のマイクロバイにどのような影響を与えるかの機械的な理解を提供するために設計されています。最終的には、これらの調査結果は、間接的な経路、殺菌剤のコロニーの低下を引き起こしている可能性に光を当てる必要があります。

ケージ調査:
ケージの実験から得られたデータは、マルハナバチのミツバチのコロニーが殺菌剤の暴露に重要な応答を持っていたことを示した。殺菌剤処理ハイブ生産コントロールのじんましんよりも大幅に少ない労働者 (12.2 ± 3.8、平均 ± SE) (43.2 ± 11.2,= 6.8 F1, 9, p = 0.03) (図 4)。さらに、殺菌剤処理ハイブ (0.91 g ± 0.15) の蜂バイオマスはコントロール ハイブ (2.36 g ± 0.55; よりかなり低いF1, 9 = 8.3, p = 0.02)。殺菌剤処理のハイブに下げられたバイオマスのこのパターンが母女王の間で認められました。コントロール ハイブ (0.27 g ± 0.01; のクイーンズブレイドよ...

マルハナバチ巣箱内微生物コンソーシア豊かにし、ハチの幼虫のため花粉を維持します。研究室と実験、フィールド ベースの次世代シーケンシングによるこの原稿は殺菌剤残留物変更、花粉マイクロバイ オームおよびコロニーの人口統計、コロニーに繋がること仮説をテストするために使用されるプロトコルについて説明します損失。

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

この学際的なプロジェクトの全体的な目標は、花粉に残留する殺菌剤がマルハナバチのコロニー減少を引き起こす可能性のある特定のメカニズムを分離することです。この方法は、殺菌剤が媒介するミツバチの共生の混乱の影響を受けたマルハナバチの幼虫の高い死亡率に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、ミツバチの花粉内の微生物群集の変化とともにミツバチの人口統計を追跡することにより、殺菌剤がミツバチに及ぼす間接的な影響を調査することです。これらの方法は在来のミツバチの健康に関する洞察を提供しますが、ミツバチなどの他の花粉媒介者にも適用でき、ミツバチは世界中の作物の受粉に重要な役割を果たしているため、開花作物への殺菌剤の賢明な適用が強調されています。この共同研究の手順を実証するのは、Prarthana Dharampal、Luis Diaz-Garcia、Caitlin Carlsonです。まず、オート麦が植えられた畑にメッシュケージを設置します。レプリケートごとに 1 つ準備します。1回の治療実験で少なくとも10個作るように計画してください。まず、各ケージの周りに溝を掘り、メッシュケージの4つの端すべてを地面に掘って、ミツバチが逃げられないようにします。次に、ソバ、ルリヂサ、アリッサム、コスモス、ヒマワリなど、ミツバチにとって魅力的であることが知られている鉢植えの顕花植物をケージにストックします。また、各ケージに咲くクローバーのトレイを1つ追加します。ケージの1つのコーナー内にすべての花資源をクラスター化し、約2.5平方メートルを占めます。残りのケージの表面積をオート麦で植生します。コロニーをフィールドケージにロードする前に、それぞれに働きバチと1人の女王がいることを確認してください。その後、ケージごとに1コロニーを29日間ロードします。ケージ内では、コロニーの開口部が南を向くようにコロニーボックスを向き、ミツバチに最適なナビゲーション条件を提供します。次に、実験的な処理をケージの半分に適用します。この場合、ハンドヘルド農薬噴霧器を使用して、クロロタロニルベースの殺菌剤を開花植物に関連するフィールドで適用します。この治療は 0 日目と 13 日目に再度適用されます。花の表面に追加の液体が付着しないように、花を均一にコーティングします。研究期間の終わりに、ケージからコロニーを取り出し、コロニーをマイナス20°Cの冷凍庫に20分間入れてミツバチに麻酔をかけます。麻酔をかけたら、滅菌鉗子を使用してミツバチを切除し、幼虫、蛹、成虫の雌と成体の雄の数、および母なる女王の数を記録します。次に、分析天びんを使用して、マザークイーンと他のクラスのミツバチの乾燥重量を記録します。まず、市販の花粉を標準的な実験室用ボールミルを使用して微粉末に粉砕します。次に、粉末状の花粉を滅菌するために、70%のエタノールに浸します。エタノールをバイオセーフティキャビネット内のUVライトの下で一晩蒸発させます。翌日、滅菌爪楊枝を用いて汎用寒天培地に少量をめっきし、花粉の無菌性を確認する。プレートを摂氏28度で48時間インキュベートし、成長がない場合にのみ使用します。次に、滅菌ピペットを使用して、滅菌した花粉に野外用剤を添加し、滅菌した木の棒を使用して2つを完全に混合します。コントロールには滅菌水を使用してください。次に、実験用の巣箱を少なくとも3つのサンプルサイズで準備します。毎日、各巣箱の花粉アリコートを無菌的に準備します。次に、各巣箱を囲むボックスのトラップドアを介して、花粉を導入します。花粉に加えて、毎週、滅菌された砂糖溶液を各巣箱に供給します。この給餌体制を4週間実行します。以前と同様に、テスト期間の終了時にじんましんに麻酔をかけます。次に、花粉や幼虫の蜂が巣の奥深くに落ちないように、巣穴の中身を非常にそっとこじ開けて掘り出します。以前と同じハイブのカウントと計量の指標を実行しますが、滅菌された鉗子を使用して、ひなチャンバー内に含まれる花粉の供給もこすり落とします。花粉を滅菌チューブに集め、後で分析するために摂氏マイナス80度で保管します。ケージ実験から得られたデータは、マルハナバチのコロニーが殺菌剤への曝露に対して有意な反応を示したことを示しました。殺菌剤で処理されたじんましんは、対照のじんましんよりも大幅に少ない労働者を生産しました。全体的なバイオマスは、マザークイーンの塊を含む殺菌剤で処理された巣箱でも減少しました。その後、幼虫、蛹、成体オスの数と質量は影響を受けませんでした。実験室での実験は、現場での実験結果を反映していました。まとめると、これらの結果は以前に発表された結果と一致しており、殺菌剤への曝露がコロニーの適応度に影響を与えることを示しています。私たちのデータは、殺菌剤で処理された巣箱で微生物の多様性と均一性が低下したことを示しています。花粉供給のメタゲノム解析を使用して、殺菌剤処理された巣箱の微生物群集の変化を分析しました。殺菌剤で処理されたじんましんでは、一般的に単離されたストレプトマイセタルと腸内細菌の存在量が大幅に減少しましたが、節足動物の一般的な病原体を含むリケッチアレス目の細菌メンバーは、殺菌剤で処理されたじんましんにはるかに豊富でした。殺菌剤で処理されたじんましんは、Eurotiales、Sordariales、Saccharomycetales目に属する真菌の量も少なかったが、実際にはCapnodiales目とAscosphaerales目で真菌の量が増加しました。これらの結果は、殺菌剤が花粉供給のマイクロバイオームを変化させ、ミツバチの微生物の共生を効果的に妨害し、ミツバチの健康を損なう可能性があることを示しています。このビデオを見た後、野外でマルハナバチを培養する方法、ミツバチの巣を解剖する方法、ミツバチの花粉供給の微生物群集を特定する方法、それによってミツバチのコロニーの健康に対する殺菌剤の役割を評価する方法をよく理解できるはずです。習得すると、これらの技術を使用して、殺菌剤が媒介する花粉マイクロバイオームの破壊と、マルハナバチのコロニーの全体的な健康に対する間接的な影響を実証できます。この手順を試みている間、感染や侵入を避けるために、花粉の食事の準備中に無菌状態を維持することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、配列間の全差の割合を緩和し、相対存在量が少ない分類群を統合することで分類群の数を減らすことにより、微生物群集構造の記述をさらに改善できます。

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Environment

環境

この原稿は、自由飛行ミツバチのための単純な非侵襲的方法、ならびに拘束ミツバチの正確な局所治療を可能にする、より侵襲性の変異体を含む、ミツバチへの薬理学的薬剤を投与するためのいくつかのプロトコルについて説明します。...

拘束と自由飛行ミツバチの神経薬理学的操作、<em&gt;アピスミツバチ</em

ここで我々が提示 個々ミツバチと蜂の巣コロニーの両方に農薬汚染された食物を供給するための方法。手順は、基本的な幼虫の食事のとも蜂の巣コロニーの自然条件にin vivoで供給することにより、個々のミツバチへの農薬の影響を評価します。...

個々のコロニーレベルにミツバチ開発に関する環境化学物質の影響を評価します

ミツバチコロニーの喪失は、作物受粉サービスに挑戦している。現在の受粉者保護の実践は、忌避化学物質を用いてハチミツと有害な農薬との接触を最小限に抑えるための別のアプローチを保証する。ここでは、ミツバチに対する抑止力をスクリーニングするための視覚追跡プロトコルの詳細な方法を提供します。...

ハチミツの抑止化学物質をスクリーニングするためのビデオトラッキングプロトコル

殺虫剤の致死量は定期的にまたは visual...

致死の農薬暴露の蜂蜜の蜂のコロニー レベルの効果を監視

開花植物の殺菌剤散布が孤独な蜂花粉媒介殺菌剤残留物の高濃度にあります。生体外で実験室の実験を使用して-飼育ハチの幼虫、この研究調査ホストと非ホストの植物由来殺菌剤処理した花粉を消費のインタラクティブな効果。...

体外孤独な蜂の飼育: 幼虫の危険因子を評価するためのツール

このプロトコルは、ミツバチの女王とその労働者の世話人を制御された実験室で農薬に暴露し、関連する応答を注意深く監視する方法を確立することによって、農薬がミツバチ(Apis mellifera)の再生にどのような影響を与えるかの理解を深めるために開発されました。...

交配ミツバチクイーンズへの農薬リスクの評価

本議定書は、農薬に汚染された規定を孤独なミツバチの幼虫、...

孤独なミツバチの幼虫に対する農薬の効果の評価

グリホサートベースの製品(GBP)は、世界中で最も一般的な広域スペクトル除草剤です。本稿では、GBPがマイクロバイオームに与える影響を定量化するための一般的なガイドラインを、フィールド実験からバイオインフォマティクス解析まで紹介します。...

グリホサートベースの製品がマイクロバイオームに及ぼす潜在的な影響の定量化

野外で採集したミツバチを安全に取り扱うための試験方法を実演します。この方法により、迅速な操作、同定、遺伝的サンプリング、およびサンプリング中に収集された花粉を介した植物と昆虫の相互作用の確認が可能になります。このアプローチは、簡単に適応でき、希少な昆虫群を研究するための費用対効果の高い非致死的な手段を提供します。...

野外でミツバチを閉じ込めて安全に扱うための迅速な方法

ここでは、増幅可能な細胞溶解、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、およびCRISPR/Cas12aアッセイを使用して、 Lotmaria passim や Nosema ceranae...

RPA/CRISPR/Cas12aシステムへのアルカリ溶解によるトリパノソーマ科寄生虫および Nosema ceranae のオンサイトDNA検出

学ぶ、殺菌剤がBombus属マルハナバチの花粉微生物叢を変化させ、コロニー衰退を引き起こすメカニズム。次世代シーケンスと野外・室内実験で、微生物共生の破壊と幼虫死亡率の関連を解明する。

実証、メタゲノムと計算手法を照らす殺菌剤妥協ミツバチ健康メカニズム

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