タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのツールとしての蛍光異方性

タンパク質相互作用は、細胞の機能の中心にあります。熱量分光技術は、一般に、それらを特徴付けるために使用されます。ここでは、Shwachman-ダイヤモンド症候群（SBDS）で変異タンパク質と伸長因子様1 GTPアーゼ（EFL1）間の相互作用を研究するためのツールとして蛍光異方性を説明します。

この実験の全体的な目標は、蛍光異方性を使用して、目的の2つのタンパク質間の相互作用を評価および定量化することです。これらの対策は、重要な質問に答えるのに役立ちます。タンパク質生化学およびタンパク質生物物理学の分野では、相互作用が細胞機能に重要なタンパク質などです。

この手法の主な利点は、タンパク質間相互作用に関する定量的および定性的情報を取得できることです。精製SBDS-FlAsHタンパク質を調製するには、まず1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを添加した1リットルのLB液体培地を調製します。そしてその中で、600ナノメートルの光学密度が0.5〜0.7に達するまで、37°Cで細菌を形質転換しました。

0.5ミリモルのIPTGを培養物に添加してSBDS-FlAsHタンパク質の発現を誘導し、さらに5時間インキュベーションを続けます。次に、細菌懸濁液を3800倍Gで4°Cで10分間遠心分離して回収します。上清を取り除きます。

1ミリモルのPMSFを添加した35ミリリットルのSBDS溶解バターに細胞を再懸濁します。摂氏4度で10秒オンと30秒オフのサイクルを使用して、合計4分間超音波処理により溶解します。次に、サンプルをGの9,000倍で摂氏4度で50分間遠心分離します。

上清を保持し、パレットを廃棄して細胞の破片を取り除きます。ニッケルアフィニティーカラムを3カラム容量のSBDS溶解バッファーと平衡化した後、清澄化した上清全体をカラムに導入します。未結合のタンパク質は、SBDS溶解バッファーの3カラム容量で洗浄して除去します。

カラム洗浄後、結合したタンパク質を3カラム容量のSBDS溶出バッファーで溶出します。タンパク質をさらに精製するには、スルホプロピルカチオン交換カラムを3カラム容量の低塩Sカラムバッファーで平衡化します。タンパク質を50ミリモルリン酸緩衝液PH 6.5で6倍に希釈し、カラムに導入します。

結合していない材料を、3カラム容量のLow salt Sカラムバッファーで洗浄します。次に、50ミリモルリン酸緩衝液PH 6.5(1モル塩化ナトリウム)をカラムに添加して、タンパク質を1ステップで溶出します。溶出液を50ミリモルリン酸緩衝液PH 6.5で3倍に希釈します。

次に、限外ろ過装置を用いてタンパク質を3800倍Gで15分間遠心分離して濃縮します。この種の実験で使用されたタンパク質の品質は非常に強力です。使用するタンパク質サンプルの純度が高純度でない場合、データの解釈は複雑になります。

SBDS-FlAsHタンパク質の純度をSDS-PAGE分析とCoomassie染色により確認します。タンパク質を液体窒素で急速凍結し、さらに使用するまで摂氏マイナス80度で保存します。精製されたEFL1タンパク質を調製するために、まず、ウラシルを含まない合成ドロップアウト培地1リットルで摂氏30度で形質転換酵母を培養し、600ナノメートルの光学密度が1.8に達するまで0.5パーセントのグルコースを添加した。

2.8%のガラクトースを培養物に添加してタンパク質発現を誘導し、摂氏30度で18時間インキュベーションを続けます。酵母懸濁液を3800倍Gで4°Cで10分間遠心分離して回収します。遠心分離後、上清を除去します。

1ミリモルPMSFと1ミリモルベンザミジンを添加した50ミリリットルのEFL1溶解緩衝液に細胞を再懸濁します。ガラスビーズを使用してビーズビーター上で摩擦することにより、摂氏4度で2分間オンと15分間オフのサイクルを使用して合計6分間細胞を破壊します。次に、サンプルをGの9,000倍で摂氏4度で50分間遠心分離します。

上清を保ち、口蓋を捨てて細胞の破片を取り除きます。次に、ニッケルアフィニティーカラムを3カラム容量のEFL1溶解バッファーで平衡化します。清澄化した上清をすべて平衡化カラムに導入します。

3カラム容量のEFL1溶解バッファーでカラムを洗浄して未結合タンパク質を除去した後、結合タンパク質を3カラム容量のEFL1溶出バッファーで溶出します。EFL1タンパク質をさらに精製するには、サイズ排除カラムを1.5カラム容量の異方性バッファーで平衡化します。ニッケルアフィニティーカラムから逃れたEFL1タンパク質を限外ろ過装置で1ミリリットルまで濃縮し、3800倍Gで遠心分離し、濃縮したサンプルをサイズ排除カラムに導入します。

逃れたタンパク質を回収し、限外ろ過により最終濃度約30マイクロモルまで濃縮します。EFL1タンパク質の純度をSDS-PAGE解析とクマシー染色により確認します。タンパク質を液体窒素で急速凍結し、さらに使用するまで摂氏マイナス80度で保存します。

SBDS-FlAsHタンパク質の3ナノモルとルミオグリーン色素の3ナノモルを、5マイクロメートルの異方性緩衝液中で混合します。反応を摂氏4度で8時間進行させます。8時間後、異方性バッファーに対してサンプルを一晩透析し、遊離色素を除去します。

280ナノメートルと508ナノメートルの吸光剤を、クォーツキュベットを使用して分光光度計で測定します。次に、Lambert-Beer の法則を使用して、テキストプロトコルに記載されている標識タンパク質の割合を定量化します。異方性の値を測定する前に、タンパク質レギオンからの各ろ過ステップを慎重に行い、サンプル全体が溶液に分注され、均一になるようにする必要があります。

蛍光キュベットに、200マイクロリットルの30ナノモルSBDS-FlAsHを異方性緩衝液に入れ、2マイクロリットルの30マイクロモルEFL1を滴定します。十分に混合し、反応を3分間放置してから、異方性および蛍光値を測定します。総量40マイクロリットルのEFL1が追加されるまで、このプロセスを繰り返します。

最後の手順として、テキスト プロトコルで説明されているように、データを推定バインディング モデルに適合させます。異方性実験を行うには、蛍光強度の大きな変化を排除することが重要です。このように、SBDS-FlAsHはEFL1に結合しても蛍光は目立って変化しません。

SBDS-FlAsHを含む石英キュベットへのEFL1の滴定は、最初に観察された異方性の増加をもたらします。EFL1 のいくつかの追加は、推定された結合モデルへの非線形最小二乗回帰を使用して適合できる対応する結合曲線を記述します。この場合、1つの結合部位モデルでは実験データが適切に記述されません。

代わりに、2つの同一でない結合部位モデルが実験データを適切に記述します。一度習得すると、蛍光異方性結合実験は、適切に実施されれば3時間で行うことができます。この手順を試みる際には、タンパク質を大量に精製することが重要です。

この手順と並行して、フラグメントベースの相補アッセイを用いて使用されていた他の方法、または研究対象のタンパク質の異なるドメインによる蛍光異方性栄養法を、適切な結合モデルをサポートするために実施することができます。このビデオを見れば、結合実験とそれに続く蛍光異方性実験の実施方法について十分に理解できるはずです。