マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別
2016年11月4日
私たちは、PDCの機能研究のための狼瘡傾向マウスの骨髄から高純度の形質細胞様樹状細胞（pDC）を単離するために蛍光活性化セルソーティングを使用してプロトコルを報告しています。
この実験の全体的な目的は、ループス好発マウスの骨髄から、機能研究のために高純度で形質細胞様樹状細胞（pDC）を分離することです。この手法は、ループス発症の後期におけるインターフェロンα産生pDCなど、特定の免疫細胞集団の特性に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、磁気ビーズソーティングよりも高い純度で、1つまたは複数の標的集団を濃縮できることです。
採取後、後肢骨と4 mLの完全培地を乳鉢に移します。さらに6 mLの新鮮な完全培地を加え、全量を10 mLにします。そして、乳棒で骨を静かに砕きます。
乳鉢の中で乳研をゆっくりと動かし、骨髄を放出させます。次に、すべての培地を70 µmのストレーナーでろ過し、氷上の50 mLコニカルチューブに移します。乳鉢に10 mLの新鮮な完全培地を加えます。
骨が白くなるまで、上清をさらに2回ろ過します。次に、骨髄細胞を遠心分離し、ペレットを10 millilitersの新鮮な完全培地で再懸濁します。続いて、15 milliliterコニカルチューブに入れた5 millilitersの調製直後の密度勾配 mediumの上に、層を乱さないように注意しながら細胞を重層させます。
遠心分離により細胞を分離します。次に、上層の溶液 8 mL を慎重に取り除き、界面にある 2 mL のバフィーコートを回収します。単核細胞に氷冷した完全培地 12 mL を加え、チューブにキャップをして転倒混和します。
次に、遠心分離により細胞をペレット化します。FACS用の細胞染色を行うため、4 °Cで100 µLのCD1632FCブロッキング抗体を用いて細胞を再懸濁します。10分後、4 mLの氷冷ソート用バッファーで細胞を洗浄し、100 µLの適切な細胞表面染色抗体カクテルを用いて細胞を標識します。
4 °Cの暗所で15分間静置します。その後、細胞を4 mLの氷冷ソーティングバッファーで洗浄し、未結合の蛍光標識抗体を完全に除去します。次いで、ペレットを500 µLのFACS用ローディング溶液に再懸濁し、サンプルを氷上のFACSチューブに移します。
補正コントロールを染色するために、1つのチューブに1×10⁶個の脾細胞を分注します。細胞を4 mLのソーティングバッファーで洗浄し、ペレットを100 µLのソーティングバッファーで再懸濁します。次に、マスター細胞表面抗体カクテルから適切な蛍光標識抗体を各対応する補正チューブに加え、チューブを振って混合します。
4°Cの暗所で15分間置いた後、すべてのサンプルをソーティングバッファーで洗浄し、ペレットを500 µLの氷冷ソーティングバッファーで再懸濁します。ただし、DAPIチューブのみは500 µLのFACSローディングソリューションで再懸濁してください。蛍光活性化セルソーティング（FACS）により標的細胞集団を精製するため、抗生物質を添加した500 µLのFBSを入れた回収チューブをソーティングバルブの下に配置します。
次に、未染色のチューブをロードし、各蛍光強度のネガティブゲートを設定するために10,000イベントを収集します。また、各蛍光強度のポジティブゲートを設定するため、単染色補正チューブで10,000イベントを収集します。実験サンプルからは3,000イベントを収集し、ソートされる細胞集団のゲートを設定します。
蛍光強度をX軸およびY軸のグラフパラメータとして使用し、標的細胞集団を手動でゲーティングします。次に、標的細胞集団を回収チューブにソートします。ソート終了後、細胞に最大4 mLの氷冷した完全培地を加えます。
次に、チューブにキャップをして、転倒混和により細胞を混ぜ合わせます。遠心分離によって精製細胞をペレット化し、上清の最後の200 µL以外をすべて吸引します。その後、ペレットを1 mLの氷冷完全培地で再懸濁し、2回目の遠心分離のために細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
最後に、上清の最後の100 microliters以外をすべて吸引し、ソートした細胞集団を使用するまで氷上で保存します。ループス傾向マウスからの骨髄プラズマサイトイド樹状細胞の磁気活性化細胞分取では、濃縮後の純度はわずか7.75%にとどまります。しかし、FACSで濃縮したプラズマサイトイド樹状細胞は、ソート後に96.4%という高い純度を示します。
高純度を確保するため、まず前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）のパラメータを用いて、骨髄単核細胞をゲートし、デブリから分離します。FSC幅対FSC高さ、およびSSC幅対SSC高さを用いてシングルセルのゲートをさらに絞り込み、凝集物による偽陽性シグナルの混入を回避します。次に、DAPI陰性の生存シングルセルを、CD11c陽性かつCD11B陰性の細胞表面発現によりゲートし、さらにB220陽性かつPDCA-1陽性の標的骨髄プラスミサイトイド樹状細胞集団をゲートします。
ソートされたPDC集団は、高純度であるだけでなく機能的にも正常であり、in vitroでのCPG刺激によってIFNalphaを産生する能力を有しています。この手順を行う際は、細胞生存率を維持するために、骨を砕いた後、放出された骨髄を穏やかに撹拌することを忘れないでください。本手順の後、濃縮された細胞集団の遺伝子発現や機能に関するさらなる疑問を解消するために、RNA sequencingやin vitro培養および刺激などの他の手法を実施することが可能です。
この手法の開発により、PDC研究者が、ループスおよびループス好発マウスモデルの発症におけるこの強力な細胞の役割を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、ループス好発マウスの骨髄から高度に精製されたPDC集団を分離する方法について、十分に理解することができるはずです。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本研究では、蛍光活性化セルソーティングを用いて、ループス好発マウスの骨髄からプラズマサイトイド樹状細胞（pDC）を分離するためのプロトコルを提示します。本手法は、pDCのその後の機能研究に向けて、高い純度を達成することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 自己免疫
背景
- プラズマサイトイド樹状細胞は免疫応答において極めて重要です。
- これらは、特にループスの進行過程においてインターフェロンαを産生します。
- 正確な機能解析には、高純度での分離が不可欠です。
- フローサイトメトリー（FACS）による細胞分取は、従来の手法に比べて優位性があります。
研究目的
- ループス好発性マウスからpDCを単離すること。
- pDCの機能的特性を解析すること。
- ループスにおける免疫細胞の挙動への理解を深めること。
使用した手法
- ループス惹起マウスからの骨髄採取。
- 分離のためのフローサイトメトリー（FACS）の使用。
- 細胞処理用完全培地の調製。
- ソート用細胞を放出させるための骨の破砕。
主な結果
- 高純度でのpDCの分離に成功。
- ループスにおけるpDC機能の理解を深めた。
- 蛍光活性化細胞選別（FACS）の有用性を実証。
- 今後の研究に向けた信頼性の高いプロトコルを提供。
結論
- 本プロトコールにより、機能研究のためのpDCを効果的に単離できる。
- 得られた知見は、ループス病理学の理解に寄与する。
- 今後の研究において、本手法を基盤として発展させることが可能である。
よくある質問
業界における重要性
高純度で希少な免疫細胞集団を分離することは、ターゲットバリデーションや前臨床モデル開発におけるメカニズムのデリスキングにおいて極めて重要です。蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いることで、ループス好発性マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞を精密に表現型分離することができ、信頼性の高い機能解析やトランスレーショナルなバイオマーカーの探索が可能になります。このアプローチは、初期探索段階における生物学的ノイズを低減し、その後の治療仮説検証における予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： インターフェロンα産生研究のために純粋な細胞集団を単離することで、ループス発症におけるプラズマサイトイド樹状細胞の機能解析を可能にする。
- 運用的価値： ソーティング後に最大96.4%の純度を達成し、磁気活性化細胞分取（MACS）などの代替手法を大幅に上回る。
- 戦略的価値： 機能的なリードアウトにおける細胞の不均一性を低減することでターゲットへの信頼性を高め、免疫調節剤スクリーニングにおける意思決定（go/no-go判断）を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：CpG誘導性インターフェロンα測定などのin vitro刺激アッセイに適した、精製されたプラズマサイトイド樹状細胞を調製できる。
- 運用的価値：複数の細胞集団の同時分離が可能となり、実験のスループット向上とアッセイの標準化が図れる。
- 戦略的価値：スクリーニングワークフローのための再現性のあるインプットを作成でき、定義された免疫表現型に対する信頼性の高い化合物評価が可能になる。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： ループス好発性マウスモデルを用いた疾患関連システムを提供し、自己免疫におけるプラズマサイトイド樹状細胞の寄与を研究することを可能にする。
- 運用的価値： 分離された細胞は機能的に正常な状態にあり、刺激によってインターフェロンαを産生できるため、アッセイへの適用可能性が検証されている。
- 戦略的価値： 作用機序研究のための十分に特性解析された一次細胞を提供することで、創薬から前臨床検証までのトランスレーショナルな連続性を促進する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法はディスカバリー・コンティニュアムに適合しており、フェノタイプスクリーニングによる早期のターゲットバリデーションをサポートし、精製された免疫細胞における機能的リードアウトを介したリード化合物の同定を可能にします。
- 探索生物学：プラズマサイトイド樹状細胞を単離することで、インターフェロン主導のループス病理における役割を明らかにし、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：再現性のある機能解析および化合物スクリーニングに不可欠な、標準化された高純度の細胞集団を提供します。
- 分析：サイトカイン産生、フローサイトメトリーの読み取り、および前方散乱光/側方散乱光ゲーティングによる純度評価などの、定量的従属変数の測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：ループス好発性マウスの使用を通じて前臨床の連続性を確保し、自己免疫疾患モデルにおけるメカニズムのリスク低減（de-risking）と整合させます。
- 組織的な再利用：複数の免疫学および自己免疫プロジェクトにわたって、希少な免疫細胞を単離するための再利用可能な能力を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：免疫細胞機能研究におけるメカニズムの曖昧さを排除することで、予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：定義されたゲーティング戦略とコンペンセーションコントロールにより、標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値：免疫調節剤の開発において、より適切なgo/no-go判断を可能にし、後期の生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：精製細胞集団からの信頼性の高い前臨床データに基づき、リスク調整後の優先順位付けを行います。
実施上の検討事項
- 正確な蛍光活性化細胞分級（FACS）を行うため、フローサイトメトリー、細胞染色、および補正コントロールに関する専門知識が必要です。
- 骨髄処理のために、フローサイトメーター、分級装置、および遠心分離システムなどの計測機器に依存します。
- 免疫学およびアッセイ開発グループ間で、抗体パネル、ゲーティング戦略、および分級プロトコルのチーム横断的な標準化が必要です。
- マウス骨髄以外の他のモデルシステムや組織源に本プロトコルを適用する場合、適応に関する検討が必要です。
- 細胞生存率を維持するための緩やかな骨髄破砕の必要性や、多段階精製に時間を要することなどの実用的な制限が含まれます。
