マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

この実験の全体的な目標は、狼瘡を起こしやすいマウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞(PDC)を高純度で単離し、その機能を研究することです。この方法は、狼瘡の発症後期にPDCを産生するインターフェロンアルファなど、特定の免疫細胞集団の特性に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、1〜2個のターゲット集団を磁気ビーズソーティングよりも高純度に濃縮できることです。

収穫後、後肢の骨と4ミリリットルの完全培地を乳鉢に移します。6ミリリットルの新鮮な完全な媒体を追加して、総容量を10ミリリットルにします。そして、杵で骨を優しく割る。

乳棒をそっとかき混ぜて骨髄を解放します。次に、すべての培地を70ミクロンのストレーナーを介して氷上の50ミリリットルの円錐形チューブに移します。10ミリリットルの新鮮な完全な媒体をモルタルに加えます。

そして、骨が白く見えるまで、上清をさらに2回ろ過します。次に、骨髄細胞を遠心分離し、ペレットを10ミリリットルの新鮮な完全培地に再懸濁します。次に、15ミリリットルの円錐管に調製した5ミリリットルの新たに調製した密度勾配培地に細胞を層状に重ね、層を乱さないように注意します。

そして、遠心分離によって細胞を分離します。次に、溶液の上部8ミリリットルを慎重に取り除き、間期に2ミリリットルのバフィーコートを収集します。単離された単核細胞に12ミリリットルの氷冷した完全培地を加え、チューブをキャップして反転して混合します。

次に、遠心分離により細胞をペレット化します。細胞をFACSに染色するには、摂氏4度の100マイクロリットルのCD1632FCブロッキング抗体に再懸濁します。10分後、細胞を4ミリリットルの氷冷選別緩衝液で洗浄し、100マイクロリットルの適切な細胞表面染色抗体カクテルで細胞を標識します。

暗闇の中で摂氏4度で15分間。細胞を4ミリリットルの氷冷ソーティングバッファーで洗浄し、結合していない蛍光標識抗体を除去します。次に、ペレットを500マイクロリットルのFACSローディング溶液に再懸濁し、サンプルを氷上のFACSチューブに移します。

コンペンセーションコントロールを染色するには、チューブごとに10〜6番目の脾細胞を1回分注します。細胞を4ミリリットルの選別緩衝液で洗浄し、ペレットを100マイクロリットルの選別緩衝液に再懸濁します。次に、マスターセル表面抗体カクテルから適切な蛍光標識抗体を対応する各コンペンセーションチューブに加え、チューブを振とうして混合します。

暗所で15分後、摂氏4度で、すべてのサンプルを選別緩衝液で洗浄し、ペレットを500マイクロリットルの氷冷選別緩衝液に再懸濁します。ただし、DAPIチューブは500マイクロリットルのFACSローディング溶液に再懸濁されます。蛍光活性化細胞ソーティングにより標的細胞集団を精製するために、抗生物質を添加した500マイクロリットルのFBSを含む収集チューブをソーティングバルブの下にロードします。

次に、未染色のチューブをロードし、10, 000のイベントを収集して、各蛍光強度のネガティブゲートを設定します。そして、各蛍光強度の正のゲートを設定するための単一の染色補償チューブで10、000のイベント。実験サンプルから3, 000のイベントを収集して、選別された細胞集団のゲートを設定します。

蛍光強度をXおよびYアクセスグラフのパラメータとして使用して、標的細胞集団を手動でゲートします。次に、標的細胞集団をコレクションチューブに選別します。選別の終わりに、最大4ミリリットルのアイスコール完全培地を細胞に加えます。

次に、チューブにキャップをし、反転して細胞を混合します。精製した細胞を遠心分離によりペレット化し、上清の最後の200マイクロリットルを除くすべてを吸引します。次に、ペレットを1ミリリットルの氷冷完全培地に再懸濁し、細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移して2回目の遠心分離を行います。

最後に、上清の最後の100マイクロリットルを除くすべてを吸引し、選別された細胞集団を使用まで氷上に保存します。狼瘡を起こしやすいマウスからの骨髄形質細胞様樹状細胞の磁気活性化細胞選別は、濃縮後の純度がわずか7.75%になります。しかし、FACSに富んだ形質細胞様樹状細胞は、ソーティング後96.4%という高い純度を示します。

高純度を確保するために、単核骨髄細胞は最初にゲート化され、前方散乱および側方散乱パラメータによって破片から分離されます。前方散乱幅と前方散乱高さ、および側面散乱幅と側面散乱高さを使用して、単一セルをさらにゲート化し、凝集体によって生成される偽陽性信号を回避します。次いで、生の単一DAPI陰性細胞は、それらのCD11c陽性、CD11B陰性細胞表面発現によってゲーティングされ、B220陽性、PDCA-1陽性標的骨髄形質細胞様樹状細胞集団のさらなるゲーティングが可能になります。

選別されたPDC集団は、高純度であるだけでなく、in vitroでCPG刺激を受けるとIFNalphaを産生する能力を持つ機能的にも正常です。この手順を試みるときは、細胞の生存能力を維持するために、骨を割って放出された骨髄を穏やかにかき混ぜることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、RNAシーケンシングやin vitro培養および刺激などの他の方法を実行して、濃縮された細胞集団の遺伝子発現または機能に関する追加の質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、PDC研究者が狼瘡および狼瘡を起こしやすいマウスモデルの開発におけるこの強力な細胞の役割を探求する道を開きました。このビデオを見れば、狼瘡を起こしやすいマウスの骨髄から高度に精製されたPDC集団を分離する方法を十分に理解できるはずです。