マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別
2016年11月4日
私たちは、PDCの機能研究のための狼瘡傾向マウスの骨髄から高純度の形質細胞様樹状細胞（pDC）を単離するために蛍光活性化セルソーティングを使用してプロトコルを報告しています。
この実験の全体的な目標は、狼瘡を起こしやすいマウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞(PDC)を高純度で単離し、その機能を研究することです。この方法は、狼瘡の発症後期にPDCを産生するインターフェロンアルファなど、特定の免疫細胞集団の特性に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、1〜2個のターゲット集団を磁気ビーズソーティングよりも高純度に濃縮できることです。
収穫後、後肢の骨と4ミリリットルの完全培地を乳鉢に移します。6ミリリットルの新鮮な完全な媒体を追加して、総容量を10ミリリットルにします。そして、杵で骨を優しく割る。
乳棒をそっとかき混ぜて骨髄を解放します。次に、すべての培地を70ミクロンのストレーナーを介して氷上の50ミリリットルの円錐形チューブに移します。10ミリリットルの新鮮な完全な媒体をモルタルに加えます。
そして、骨が白く見えるまで、上清をさらに2回ろ過します。次に、骨髄細胞を遠心分離し、ペレットを10ミリリットルの新鮮な完全培地に再懸濁します。次に、15ミリリットルの円錐管に調製した5ミリリットルの新たに調製した密度勾配培地に細胞を層状に重ね、層を乱さないように注意します。
そして、遠心分離によって細胞を分離します。次に、溶液の上部8ミリリットルを慎重に取り除き、間期に2ミリリットルのバフィーコートを収集します。単離された単核細胞に12ミリリットルの氷冷した完全培地を加え、チューブをキャップして反転して混合します。
次に、遠心分離により細胞をペレット化します。細胞をFACSに染色するには、摂氏4度の100マイクロリットルのCD1632FCブロッキング抗体に再懸濁します。10分後、細胞を4ミリリットルの氷冷選別緩衝液で洗浄し、100マイクロリットルの適切な細胞表面染色抗体カクテルで細胞を標識します。
暗闇の中で摂氏4度で15分間。細胞を4ミリリットルの氷冷ソーティングバッファーで洗浄し、結合していない蛍光標識抗体を除去します。次に、ペレットを500マイクロリットルのFACSローディング溶液に再懸濁し、サンプルを氷上のFACSチューブに移します。
コンペンセーションコントロールを染色するには、チューブごとに10〜6番目の脾細胞を1回分注します。細胞を4ミリリットルの選別緩衝液で洗浄し、ペレットを100マイクロリットルの選別緩衝液に再懸濁します。次に、マスターセル表面抗体カクテルから適切な蛍光標識抗体を対応する各コンペンセーションチューブに加え、チューブを振とうして混合します。
暗所で15分後、摂氏4度で、すべてのサンプルを選別緩衝液で洗浄し、ペレットを500マイクロリットルの氷冷選別緩衝液に再懸濁します。ただし、DAPIチューブは500マイクロリットルのFACSローディング溶液に再懸濁されます。蛍光活性化細胞ソーティングにより標的細胞集団を精製するために、抗生物質を添加した500マイクロリットルのFBSを含む収集チューブをソーティングバルブの下にロードします。
次に、未染色のチューブをロードし、10, 000のイベントを収集して、各蛍光強度のネガティブゲートを設定します。そして、各蛍光強度の正のゲートを設定するための単一の染色補償チューブで10、000のイベント。実験サンプルから3, 000のイベントを収集して、選別された細胞集団のゲートを設定します。
蛍光強度をXおよびYアクセスグラフのパラメータとして使用して、標的細胞集団を手動でゲートします。次に、標的細胞集団をコレクションチューブに選別します。選別の終わりに、最大4ミリリットルのアイスコール完全培地を細胞に加えます。
次に、チューブにキャップをし、反転して細胞を混合します。精製した細胞を遠心分離によりペレット化し、上清の最後の200マイクロリットルを除くすべてを吸引します。次に、ペレットを1ミリリットルの氷冷完全培地に再懸濁し、細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移して2回目の遠心分離を行います。
最後に、上清の最後の100マイクロリットルを除くすべてを吸引し、選別された細胞集団を使用まで氷上に保存します。狼瘡を起こしやすいマウスからの骨髄形質細胞様樹状細胞の磁気活性化細胞選別は、濃縮後の純度がわずか7.75%になります。しかし、FACSに富んだ形質細胞様樹状細胞は、ソーティング後96.4%という高い純度を示します。
高純度を確保するために、単核骨髄細胞は最初にゲート化され、前方散乱および側方散乱パラメータによって破片から分離されます。前方散乱幅と前方散乱高さ、および側面散乱幅と側面散乱高さを使用して、単一セルをさらにゲート化し、凝集体によって生成される偽陽性信号を回避します。次いで、生の単一DAPI陰性細胞は、それらのCD11c陽性、CD11B陰性細胞表面発現によってゲーティングされ、B220陽性、PDCA-1陽性標的骨髄形質細胞様樹状細胞集団のさらなるゲーティングが可能になります。
選別されたPDC集団は、高純度であるだけでなく、in vitroでCPG刺激を受けるとIFNalphaを産生する能力を持つ機能的にも正常です。この手順を試みるときは、細胞の生存能力を維持するために、骨を割って放出された骨髄を穏やかにかき混ぜることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、RNAシーケンシングやin vitro培養および刺激などの他の方法を実行して、濃縮された細胞集団の遺伝子発現または機能に関する追加の質問に答えることができます。
その開発後、この技術は、PDC研究者が狼瘡および狼瘡を起こしやすいマウスモデルの開発におけるこの強力な細胞の役割を探求する道を開きました。このビデオを見れば、狼瘡を起こしやすいマウスの骨髄から高度に精製されたPDC集団を分離する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
この研究は、蛍光活性化細胞選別を用いて、ループス傾向のネズミの骨髄から形質細胞様樹状細胞（pDC）を分離するためのプロトコルを提示しています。この方法は、pDCの機能研究のために高い純度を達成することを目的としています。
研究の主要な構成要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 自己免疫
背景
- 形質細胞様樹状細胞は免疫反応にとって重要です。
- 特にループスの進行時にインターフェロンαを産生します。
- 正確な機能分析のために高純度の分離が不可欠です。
- 蛍光活性化細胞選別は従来の方法に比べて利点があります。
研究目的
- ループス傾向のネズミからpDCを分離すること。
- pDCの機能特性を研究すること。
- ループスにおける免疫細胞の挙動の理解を深めること。
使用方法
- ループス傾向のネズミから骨髄を採取すること。
- 分離のために蛍光活性化細胞選別を使用すること。
- 細胞処理のために完全培地を準備すること。
- 細胞を選別のために骨を割ること。
主要な結果
- 高純度のpDCの分離に成功しました。
- ループスにおけるpDCの機能についての理解を深めました。
- 蛍光活性化細胞選別の利点を実証しました。
- 将来の研究のための信頼できるプロトコルを提供しました。
結論
- このプロトコルは機能研究のために効果的にpDCを分離します。
- この研究結果はループスの病理学の理解に貢献します。
- 将来の研究はこの方法論に基づいて構築することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolating rare immune cell populations with high purity is critical for mechanistic de-risking in target validation and preclinical model development. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables precise phenotypic separation of plasmacytoid dendritic cells from lupus-prone mouse bone marrow, supporting reliable functional assays and translational biomarker discovery. This approach reduces biological noise in early discovery, improving predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of plasmacytoid dendritic cell function in lupus pathogenesis by isolating a pure population for interferon alpha production studies.
- Operational Value: Achieves up to 96.4% purity post-sorting, significantly exceeding magnetic-activated cell sorting alternatives.
- Strategic Value: Supports target confidence by reducing cellular heterogeneity in functional readouts, aiding go/no-go decisions in immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified plasmacytoid dendritic cells suitable for in vitro stimulation assays, such as CpG-induced interferon alpha measurement.
- Operational Value: Permits simultaneous separation of multiple cell populations, increasing experimental throughput and assay standardization.
- Strategic Value: Creates a reproducible input for screening workflows, enabling reliable compound evaluation against defined immune phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system using lupus-prone mouse models to study plasmacytoid dendritic cell contributions to autoimmunity.
- Operational Value: Isolated cells remain functionally normal, capable of interferon alpha production upon stimulation, validating assay readiness.
- Strategic Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by supplying well-characterized primary cells for mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early target validation through phenotypic screening and enabling lead identification via functional readouts in purified immune cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating plasmacytoid dendritic cells to clarify their role in interferon-driven lupus pathology.
- Screening: Delivers standardized, high-purity cell populations for reproducible functional assays and compound screening.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as cytokine production, flow cytometry readouts, and purity assessment via forward/side scatter gating.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of lupus-prone mice, aligning with mechanistic de-risking in autoimmune disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating rare immune cells across multiple immunology and autoimmunity projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduction of mechanistic ambiguity in immune cell function studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined gating strategies and compensation controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions and reduced late-stage biological risk in immunomodulator development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable preclinical data from purified cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell staining, and compensation controls for accurate fluorescence-activated cell sorting.
- Dependent on instrumentation including flow cytometers, sorting equipment, and centrifugation systems for bone marrow processing.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, gating strategies, and sorting protocols across immunology and assay development groups.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other model systems or tissue sources beyond mouse bone marrow.
- Includes practical limitations such as the need for gentle bone marrow disruption to preserve cell viability and the time-intensive nature of multi-step purification.
