Name: 食作用の初期段階の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶ 共焦点顕微鏡を用いた食作用の初期段階の可視化手法。Candida albicansなどの病原体が宿主細胞に侵入するメカニズムをリアルタイムで解析し、免疫学研究に有用な情報を提供します。

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私たちは、イメージングのためのMITのホワイトヘッド研究所でウェンディサーモンとケック施設のニッキー・ワトソンに感謝します。

DC2.4およびRAW 264.7細胞株の作製注：マクロファージ様細胞株RAW 264.7及び樹状細胞株DC2.4両マウス起源であり、以下の条件が細胞を増殖するために使用しました。 <ol><li> 5％CO 2の加湿インキュベーター中で37℃、10％不活性化ウシ胎児血清（FBS）を添加したDMEM（ダルベッコ最小イーグル培地）でRAW 264.7細胞を増殖させます。 </li><li> L-グルタミンの代わりにDMEMを補っ使用RPMI（ロズウェルパーク記念研究所）培地を除き、RAW 264.7細胞のものと同様の条件でDC2.4細胞を成長させます。 </li></ol> 2.蛍光共役微粒子の調製： カンジダ・アルビカンス 、ザイモサン、IgGをコーティングしたビーズ<ol><li> カンジダ・アルビカンスの成長 <ol><li>ウリ（2％バクトペプトン、1％を補充したYPD 25mlに凍結グリセロールストックからC.アルビカンス株 SC5314に接種酵母エキス、2％グルコース、一晩30℃で80 / mlのウリジン）。 注：OD 12の600よりも多くのカンジダ培養物を増殖することは避けてください。 </li><li> カンジダ・アルビカンスの1ミリリットルを取り、室温で5分間、2000×gでスピンダウン。 </li><li>上清を吸引除去し、1mlのPBSでペレットを再懸濁。 </li><li>室温で5分間、2000×gで遠心分離することによってペレットを収集します。 </li><li>手順を繰り返し2.1.4。 </li><li>食細胞の数との関係でカンジダ・アルビカンスの感染多重度（MOI）を計算し、1の部3アンOD 600で説明したように、食作用アッセイを続行すると、1ミリリットル当たり2.5×10 7 カンジダ・アルビカンスと同等です。 注：カンジダ-BFPの生成は文献13に記載されています。 </li></ol></li><li> ザイモサンおよびIgGでコーティングされたビーズの調製 注：ザイモサンは、βグルカン含有されていますサッカロマイセス・セレビシエ由来の真菌炭水化物微粒子製剤。ザイモサンは、マクロファージおよび樹状細胞における炎症性シグナルを誘発することが知られ、それは13食作用の研究に広く用いられている14、15。 <ol><li>簡単に言うと、微粒子が含まれているチューブをボルテックスし、1.5mlチューブに実験のための十分な量を分取。 注：一般的に、我々は（1セルのために、10ザイモサン粒子またはIgGでコーティングしたビーズを追加）1:10を使用します。 </li><li>氷冷PBSの1ミリリットルを加え、10,000×gで1分間遠心分離して粒子を収集します。 </li><li>上清を吸引し、1mlの氷冷PBSでペレットを再懸濁。 </li><li>手順を繰り返します2.2.2-2.2.3 注：2.2.5ステップまたは使用するまで4℃でチューブを格納するために進んでください。 </li><li>回避するために、超音波浴超音波処理器（120 V、50〜60 kHzの）中で10秒間微粒子を超音波処理NYの粒子凝集。 </li></ol></li></ol> 3.食作用注：食作用は、粒子の表面上のリガンドとのPRRの相互作用を介して食細胞の細胞表面上の粒子の結合から始まる複雑なプロセスです。結合は、アクチンのアセンブリとの接触部位でその関連タンパク質、および貪食カップの形成が続いています。その後のアクチン解体はファゴソームで発生し、粒状の完全な貪食になります。私たちは食作用のさまざまな段階を説明し、以下に。 <ol><li> 結合分析 注記：この実験の目的は、標的粒子上のリガンドおよび貪食細胞上の受容体との相互作用を伴う食作用の第一段階を監視することです。 <ol><li>それらは、実験時に60〜70％コンフルエントになるように、チャンバースライド中で約5×10 4個の細胞を播種します。 Alternatively、カバースリップ（24または12ウェル形式）またはガラス底の96ウェルプレート上にプレート細胞。 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。 注：細胞は、血球計または同様の技術を用いて計数することができます。 </li><li> 10分間10℃のチャンバースライド（またはプレート）を配置します。 </li><li>優しくピペットまたはアスピレーターを用いて、各ウェルから培地を除去します。 注意：チャンバーカバーガラスシステムの各ウェルが小さい慎重にこの手順を実行します。ピペットの先端またはアスピレータの強い気流で細胞を乱すことは容易です。 </li><li>細胞培養培地を用いて、蛍光標識された粒子を混合する（上記のように調製しました）。細胞に、（10のMOIで）、蛍光共役ザイモサンまたはラテックスビーズウサギIgG-FITC（1細胞当たり10粒子） カンジダ -BFPを追加します。すべてのセルがカバーされることを保証するためにも1室のために200μlの培地の最終容量を使用してください。 </li><li> 277でチャンバースライドをスピンダウン10℃で3分間XG。 注：この遠心分離工程は、微粒子と細胞の間の接触を増加させるのに役立ち、これは、結合プロセスを同期させます。 </li><li>すぐに5分間、5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターにチャンバースライドを転送します。 </li><li>インキュベーターからチャンバースライドを削除し、メディアを吸引除去します。 </li><li>細胞を氷冷PBSで3回洗浄します。 注：光学顕微鏡で結合していない粒子の存在を確認し、必要に応じてPBSで複数回洗浄します。分析中にバックグラウンドノイズを最小限に抑えるために井戸から結合していない粒子を除去することが不可欠です。 </li><li>室温で30分間インキュベートすることにより、PBSで希釈した500μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA）を加えることにより細胞を固定。 注意：このステップは非常に、毒性、腐食性、および潜在的な発がん性物質である4％PFAを使用する必要があります。この液体を使用する際に適切な注意が取られるべきです。また、光からサンプルを保護します。 </li><li&gt;チャンバー内に500μlのPBSを加えることによって、細胞を洗浄し、溶液を穏やかに吸引除去します。 </li><li>二回3.1.9手順を繰り返します。 注：このステップでは、直前のPBSを除去した後、各バイアルを補充します。 </li><li> 10分間、PBS中の50mMのNH 4 Clを500μlとインキュベートすることにより固定を停止します。 </li><li>ステップ3.1.10で説明したように、PBSで細胞を2回洗浄します。 </li><li>室温で30分間（PBS中0.1％サポニン、0.2％BSA）結合緩衝液250μLを添加することにより細胞を透過性。 </li><li>蛍光共役ファロイジン（：結合緩衝液中で1：500に希釈）を添加することにより染色F-アクチン。室温で1時間細胞をインキュベートします。 </li><li>ステップ3.1.10で説明したようにPBSで細胞を3回洗浄します。 </li><li>共焦点顕微鏡（63X対物レンズ、および402 nmおよび488 nmレーザー）を使用して画像をキャプチャし、ImageJの16を使用して画像を分析。 注：結合に成功粒子は、食のCuの存在によって特徴付けられます粒子状の接触食細胞（ 図1）サイトのp。ステップ3.2.5を参照してください。 </li></ol></li><li> 貪食取り込みアッセイ 注記：この実験は、共焦点顕微鏡（ 図2）を用いて食細胞による蛍光標識された粒子の完全な内在化を監視するように設計されています。 <ol><li>それらは、実験時に60〜70％コンフルエントになるように、チャンバースライド中で約5×10 4個の細胞を播種します。代替的に、カバースリップ上にプレート細胞またはガラス底の96ウェルプレート（24-または12-ウェル形式）。 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。 注：細胞は、血球計または同様の技術を用いて計数することができます。 </li><li> 10分間10℃のチャンバースライド（またはプレート）を保管してください。 注：冷却はエンドサイトーシスをブロックするためだけでなく、不要な食作用に必要であり、その後同期食作用を有すること。 </li><li> PERF3.1.3から3.1.5へのORMのステップ</li><li> 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターにチャンバースライドを転送し、そして異なる時点インキュベート。 30、60および90分後の感染後に細胞を固定。 C.アルビカンスは、60分後の感染に菌糸を形成し始める観察します。食細胞は、90分8後の細胞死（pyroptosis）を示し始めます。 注：これは推奨され、最適化は、細胞の種類や粒子状に応じて必要不可欠です。 </li><li> 3.1.7から3.1.15までの手順を実行します。 ImageJの16を使用して画像を分析します。 注：成功した取り込みは食細胞の細胞質内部の微粒子を完全に内在化することを特徴とする（ 図2）。このようなファロイジン等の細胞表面マーカーで食細胞を染色すると、細胞の輪郭を描くのに役立ちます。粒子が細胞表面またはCOMPLに結合しているかどうかを決定するために、Zスタックを実行するためにも不可欠ですetely内在化。 </li></ol></li><li> 貪食のライブイメージング 注：このプロトコルでは、我々は、蛍光共役ザイモサンを用いて、食作用の異なる段階を捕捉するために、共焦点顕微鏡の使用を記載しています。我々は安定してmCherryをタグ付きF-アクチン8を発現する樹状細胞株DC2.4、生きた細胞内の繊維状アクチンの分布を示しているバイオセンサーを使用しています。食作用は、アクチン駆動プロセスであるので、このセル内のライブイメージングは、F-アクチンネットワークの動きとダイナミクスをキャプチャするだけでなく、生きた細胞（ 図3、映画1）内の異なる食細胞のイベントを可視化することを可能にするだけでなく。 <ol><li>それらは、実験時に60〜70％コンフルエントになるように、濃度のチャンバースライド中で約5×10 4個の細胞を播種します。 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。 注：細胞は、血球計数器または使用してカウントすることができます同様の技術。 </li><li> 10分間氷上でチャンバースライドにしてください。 注：冷却は望ましくない取り込みをブロックするために必要であり、同期食作用を有すること。 </li><li> 3.1.3から3.1.5への手順を実行します</li><li> 37℃に顕微鏡ステージを予め加温し、5％CO 2を用いてチャンバを平衡化。撮影を開始する前に安定させるために、温度およびCO 2のために30から45分を待ちます。 注：CO 2と温度レベルは食作用のために重要であるので、環境室を平衡化するために、実験前に、顕微鏡用ヒータをオンにすることが重要です。 </li><li> 37℃、5％CO 2で平衡化した顕微鏡インキュベーターエンクロージャ内の細胞を含むチャンバースライドを置きます。 </li><li>ライブイメージング17、18を実行します 。 注：レーザパワーの設定（ゲイン、ピンホールなど ）番目の種類に応じて変えることができます電子顕微鏡と蛍光プローブを使用します。したがって、我々はあなたのライブイメージング17,18のための最適条件のための顕微鏡のマニュアルに相談することをお勧めします。 <ol><li>ライブイメージングのための共焦点レーザー走査顕微鏡（および関連するソフトウェア）を使用します。 1から1.1エアリーユニットのピンホールで63X 1.4NA油の目的を使用してください。 </li><li>撮影を開始するには、チャンバースライド上の代表的な地域を見つけるために、明視野を使用していました。次に、ソフトウェア上の位置のオプションをクリックしてフィールドを選択します。 488と582 nmの間の波長を検出するために、582 nmでのビームスプリッタを用いて488 nmレーザーのフィルタセットを使用トラック1にGFPを検出します。 </li><li>トラック2にmCherryを（RFP）は578 nmでビームスプリッタを使用し、578〜600nmの波長を検出するための最適なフィルタセットを選択します。 50％のレーザー出力と600から700のゲイン出力と488 nmおよび578 nmのレーザーを使用してください。 90分の合計のための画像を30秒ごとに取得します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Information processing during phagocytosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+macrophage+%26%2334%3Bprobing%26%2334%3B+is+required+for+the+efficient+capture+of+phagocytic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic macrophage &#34;probing&#34; is required for the efficient capture of phagocytic targets.</a> J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).</li>
<li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li>
<li>Botelho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+biphasic+changes+in+phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+at+sites+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis.</a> J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).</li>
<li>Tafesse, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Sphingolipid+Biosynthesis+Blocks+Phagocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 11, e1005188(2015).</li>
<li>Kwik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+cholesterol%2C+lateral+mobility%2C+and+the+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate-dependent+organization+of+cell+actin%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin.</a> PNAS. 100, 13964-13969 (2003).</li>
<li>Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+in+phagocytosis+and+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22BBA%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis.</a> BBA. 1851, 805-823 (2015).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Strijbis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton%27s+Tyrosine+Kinase+%28BTK%29+and+Vav1+contribute+to+Dectin1-dependent+phagocytosis+of+Candida+albicans+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages.</a> PLoS Pathog. 9, e1003446(2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-glucan+receptor+Dectin-1+activates+the+integrin+Mac-1+in+neutrophils+via+Vav+protein+signaling+to+promote+Candida+albicans+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance.</a> Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).</li>
<li>Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+recognition+is+mediated+by+the+association+of+dectin-1+and+galectin-3+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages.</a> PNAS. 108, 14270-14275 (2011).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24974023">Fluorescence live cell imaging.</a> Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+that+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
<li>Jaumouille, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+reorganization+by+Syk+regulates+Fcgamma+receptor+responsiveness+by+increasing+its+lateral+mobility+and+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering.</a> Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).</li>
<li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Immunopath%22%5BJournal%5D)">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).</li>
<li>Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+host-Leishmania+interactions%3A+significance+in+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Para.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis.</a> Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).</li>
<li>John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii.</a> Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

例えば、マクロファージや樹状細胞などのプロフェッショナル食細胞、飲み込みため、侵入病原体宿主防御システムの重要なコンポーネント食作用を作る排除。このプロセスの間に食細胞は、その細胞表面8、19、20で大規模な膜の再編成および細胞骨格再配列を受けます。よりよいこのダイナミックなプロセスを理解するには、食作用の異なる段階の可視化が不可欠です。ここでは、食作用の様々なステップを監視するために使用された顕微鏡ベースの方法を記載しています。 ライブイメージング技術の主な重要性は、それが分子レベルで、宿主 - 病原体のインタフェースを監視するために顕著な能力を提供することです。微生物感染の重要なステップの可視化を可能にすることにより、ライブイメージングは​​、免疫応答の基本的な性質に重要な洞察を提供します病原体<sup...

例えば、細菌、ウイルス、真菌などの病原体への連続暴露にもかかわらず、私たちの体はよく感染に対する保護を提供する免疫機構が装備されています。自然免疫系は、侵入する病原体に対する防御の第一線であると認識し、外国人のターゲットを内在食細胞に主に依存しています。 食作用は、0.5ミクロンより大きく、不要な粒子の飲み込みを含む進化的に保存された細胞プロセスです。食細胞は、飲み込み3の前に、病原体上に存在する病原体関連分子パターン（PAMP）を認識することを可能にする細胞表面に（また、パターン認識受容体のPRRとして知られる）は、免疫受容体の広い範囲を表します。結合病原体は、細胞表面での受容体のクラスター化が続き、食作用カップの形成をトリガします。これは、周りに突出しているアクチン駆動膜リモデリングをもたらしますターゲットは、最終的にそれを包むとピンチオフする離散ファゴソーム液胞2,5を形成します。ファゴソームは、その後成熟し、ファゴリソソーム6を形成後期エンドソームとリソソームとのその後の融合によって酸性化。 食作用は、受容体媒介とアクチン駆動型のイベントとして記載されているが、このプロセスはまた、ホスホイノシチド（主任研究者）とスフィンゴ脂質7、8などのプラズマ膜を構成する脂質の空間的・時間の変更に依存しています。アクチン重合を貪食カップの基部にホスホイノシトール-4,5-二リン酸（PI（4,5）P 2）の局所的蓄積によって決定されているが、アクチン脱重合は、（PI（4,5）Pの変換に依存します2にするホスホイノシトール3,4,5-をビホスフェート（PI（3,4,5）P 3）3、9。両方の修正ターゲットの周りの偽足の成功延長前者リードとして不可欠であり、後者は、食細胞10の細胞質ゾル中の粒子の沈降を可能にします。 貪食する能力を有する細胞は、マクロファージ/単球、顆粒球/好中球のような専門の貪食細胞、および繊維芽細胞および上皮細胞11として樹状細胞（DC）またはノンプロ食細胞、のいずれかです。プロの食細胞によって行われる食作用は病原体に対する自然免疫と適応免疫応答の調整を担当している間、すべての食細胞によって行われる食作用は、組織維持およびリモデリングにおいて中心的な役割を果たしています。プロフェッショナル食細胞は、適応免疫系のリンパ系細胞にも存在する抗原を巻き込むと病原体を殺すが、ありません。従って、これは、につながる、炎症性サイトカインの放出およびリンパ系細胞の係合に寄与します感染12の成功封鎖。 従来の生化学的手法は、このような翻訳後修飾とタンパク質との間の様々な高親和性の関連付けなどの食作用中に異なる細胞過程の分子機構に関する知識を得るに尽力してきました。しかし、従来の生化学的方法を用いて、食作用事象の空間的および時間的動態に関する情報を得ることは困難です。ライブセルイメージングだけでなく、私たちは時間に敏感な方法で細胞イベントを監視することができますだけでなく、単一細胞レベルでの情報を得るために私達を可能にします。ここでは、食作用の異なる段階を調査するため、並びに、共焦点顕微鏡を使用して時空間的に全体のプロセスを分析する方法を記載します。

<table><tbody><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>細胞シグナル伝達技術&nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、乳酸)</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーD3571</td><td></td></tr>ジ<tr><td>メチルスルホキシド(DMSO)</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーBP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM(ダルベッコ'のミニマルイーグル」</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>FITC-coupled IgG-coated latex beads</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド溶液 (PBS中4%))</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (ロズウェル パーク メモリアル インスティテュート)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー溶液 (0.4% (w/v) in PBS)</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps 洗剤溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp;85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>チャンバー付き 1.0 ホウケイ酸カバーガラス システム (8 チャンバー)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Glasstic スライド 10 グリッド付き</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

食作用の初期段階の可視化

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

哺乳動物の体は、病原体の侵入から身を守るために役立つメカニズムの様々な層が装備されています。このような好中球、樹状細胞、およびマクロファージなど- -免疫系のプロフェッショナル食細胞が検出され、食作用1を介して、このような病原体の侵入をクリアする生得的な能力を保持します。食作用は、細胞表面2、3における膜の再編成とアクチンリモデリングの振り付けイベントを伴います。食細胞が正常に内在し、食作用のすべての段階が満たされた場合にのみ、外来分子を根絶します。これらのステップは、認識し、細胞表面に存在するパターン認識受容体（PRR）によって病原体の結合は、粒子を取り囲むようにアクチンに富む膜状の突起（偽足）を介して貪食カップの形成、およびファゴソームの切断がファゴリソソームの成熟が続くことが含まれますで結果病原体3、4の殺害。 食作用の様々な段階のイメージングと定量化は、この細胞過程の分子機構を解明するためのインストゥルメンタルです。本原稿は、食作用の異なる段階を研究するための方法を報告します。私たちは、結合、貪食カップ形成を可視化し、定量化するための顕微鏡ベースのアプローチを説明し、食細胞によって微粒子の内部。食作用が起こると食細胞上の生得的な受容体が0.5μmよりも大きい標的粒子上のリガンドに遭遇したとき、私たちはここに提示アッセイは、病原性真菌カンジダ・アルビカンスなどザイモサンなどの他の粒子とのIgG被覆ビーズの使用を含みます。

食作用の様々な段階を監視するための顕微鏡ベースの方法が提供されます。 DC2.4細胞による様々な蛍光粒子の貪食中に異なるイベントが示されています。ここに記載された技術を用いて、我々は、食作用の初期段階においてスフィンゴ脂質の役割を調べました。この目的のために、Sptlc2、スフィンゴ脂質生合成経路における第一及び律速段階を触媒する酵素で遺伝的に欠損DC2.4樹状細胞を用いました。野生型細胞と比較して、Sptlc2は- / - DC2.4細胞が有意にセラミド、スフィンゴミエリン及びグルコ8を含むスフィンゴ脂質のレベルが減少しています。 Sptlc2 - / - DC2.4細胞が結合において、ならびにカンジダ・アルビカンス 、ザイモサンおよびIgGのラテックスビーズ8の取り込みに欠陥があります。 図1では、DC2.4細胞における結合の蛍光共役ザイモサン粒子が示されている（切断面を見ますnは詳細については3.1）。 Sptlc2 - / -</...

ここでは、真菌、カンジダ・アルビカンス、およびザイモサンやIgGコーティングビーズを含む0.5μmを超える微粒子などの病原体の食作用中の初期のカスケードを視覚化し、定量化するための顕微鏡ベースの技術について説明します。

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

この手法の大きな目標は、共焦点顕微鏡を使用して食作用のさまざまな段階を監視することです。この方法は、病原体間の相互作用の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。主に、感染中に病原体が宿主細胞にどのように侵入するかを理解するためです。この技術の主な利点は、それが単純であり、時間に敏感な方法で食作用中に発生するイベントのウイルス細胞に関する情報を取得できることです。まず、添付のテキストプロトコールに記載されているように、蛍光標識ザイモサンを調製します。前日、チャンバースライドで約5倍10〜第4のDC2.4細胞を播種し、実験時にウェルが60〜70%コンフルエントになるようにします。細胞が適切な密度になったら、チャンバースライドを摂氏10度で10分間置きます。細胞の冷却は、エンドサイトーシスをブロックするため、および細胞化を切り替えるタイミングに必要です。そしてその後、同期した食作用が起こります。次に、ピペットまたは吸引器を使用して、各ウェルから培地を静かに取り出します。次に、蛍光標識ザイモサンを細胞培養培地と10回の感染の多重度で混合します。次に、500マイクロリットルの培地を各チャンバーウェルに追加して、すべてのセルが覆われていることを確認します。次に、チャンバースライドを回転させて、細胞内の微粒子間の接触を増やし、結合プロセスを同期させます。遠心分離後、チャンバースライドを5%のCO2を含む摂氏37度の加湿インキュベーターに移します。摂氏37度で5分後、チャンバースライドをインキュベーターから取り外し、培地を吸引します。次に、細胞を氷冷PBSで3回洗浄します。最終洗浄後、光学顕微鏡で未結合の粒子の存在を確認し、必要に応じて追加の洗浄を行います。分析中のバックグラウンドノイズを最小限に抑えるために、未結合の粒子をウェルから除去することが不可欠です。次に、PBS中の4パーセントパラホルムアルデヒドを500マイクロリットル加えて細胞を固定し、室温で30分間インキュベートします。細胞を固定した後、各チャンバーに500マイクロリットルのPBSを加えて洗浄し、溶液を穏やかに吸引します。洗濯手順をさらに2回繰り返します。3回目の洗浄に続いて、PBS中の50ミリモル塩化アンモニウムを500マイクロリットル加え、10分間インキュベートして反応を停止します。次に、500マイクロリットルの室温PBSで細胞を洗浄します。次に、各ウェルに500マイクロリットルの結合バッファーを添加し、細胞を室温で30分間インキュベートすることにより、細胞を透過化します。次のステップは、蛍光標識ファロイジンを細胞に添加し、室温で1時間インキュベートすることにより、F-アクチンを染色することです。次に、500マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄します。最後に、共焦点顕微鏡を使用して画像を取得し、ImageJを使用して画像を分析します。ザイモサンの取り込みを測定するには、結合アッセイに示されているように、細胞を含むチャンバースライドを調製します。冷却とラベリングの手順に従って、チャンバースライドを5%のCO2を含む摂氏37度の加湿インキュベーターに移します。そして、細胞を異なる時点までインキュベートします。感染後30分、60分、90分後に細胞を固定します。これらの時点は、使用するそれぞれの細胞タイプと蛍光粒子に基づいて最適化してください。次に、ImageJを使用して画像を解析します。取り込みの成功は、食細胞の細胞質内の微粒子の完全な内在化によって特徴付けられます。まず、顕微鏡ステージの環境チャンバーを摂氏37度に温め、チャンバーを5%のCO2で平衡化して準備します。温度とCO2が安定するまで30〜45分待ってからイメージングします。CO2と温度レベルを確認することは、食作用にとって重要であり、実験前に顕微鏡ヒーターをオンにしてそのチャンバーの環境を平衡化することが重要です。次に、結合アッセイで示されたように、mCherry F-actinを発現するDC 2.4細胞を用いたチャンバースライドを調製します。クーイングとラベリングの手順に従って、チャンバースライドを遠心分離機から直接、予熱した顕微鏡ステージに移します。最後に、付属のテキストプロトコルに記載されている共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用してライブイメージングを行い、F-アクチンネットワークの動きとダイナミクスを捉えるだけでなく、生細胞内のさまざまな食作用イベントを視覚化します。ここで緑色で示されている細胞は、赤色で示されているカナダのBFPに感染している野生型のDC2.4細胞です。タイムラプスイメージングは、食作用の初期段階を視覚化するために使用され、ここでは30秒間隔で示されています。アスタリスクで示されている場所は、アクチンのリモデリングが行われている場所です。プロセス全体は数分で完了します。ここでは、スフィンゴ脂質の役割について、食作用の初期段階におけるスフィンゴ脂質の役割を評価しました。この技術を用いて、スフィンゴ脂質はカンジダ・アルビカンスの細胞への結合に不可欠であり、全体的な食作用を減少させることがわかった。この食作用結合の減少は、DC2.4細胞のザイモサンへの結合についても示されました。このビデオを見た後、食作用の初期段階を研究するためのライブイメージングの実行方法について十分に理解しているはずです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば1〜2時間で完了します。この手順に続いて、免疫細胞とこの病原体との間の複雑な関係を理解するために、細菌や寄生虫を含む他の病原体の食作用を行うことができます。その開発後、この技術は、細胞生物学の分野の研究者が、免疫細胞の食作用やマクロピノサイトーシスを含む受容体媒介性エンドサイトーシスを探求する道を開きました。

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオは、マクロファージを介した独立性赤血球(RBC)食作用イベントを監視するためのアッセイを示しています。マウス免疫グロブリンG(IgG)-オプソニン化ヒト赤血球をマウスマクロファージとインキュベートし、共焦点顕微鏡で観察します。赤血球は、食細胞カップ形成を介してマクロファージに飲み込まれ、リソソーム分解の標的となります。...

IgGオプソニン化赤血球のマクロファージ食作用のリアルタイムイメージング

このビデオは、ガラス底皿の表面に付着したIgGオプソン化赤血球(RBC)のマクロファージ媒介性食作用におけるファゴソームの形成と閉鎖をリアルタイムで可視化するための高解像度の全反射蛍光(TIRF)顕微鏡法を示しています。マクロファージはRBCの周囲に偽足を伸ばし、ファゴソーム内に飲み込み、ガラス表面から分離します。...

TIRF顕微鏡法によるファゴソームの形成と閉鎖の可視化

我々は、のライブセルビデオ顕微鏡のための方法を説明します...

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

ここでは、接着性マクロファージ細胞株による蛍光粒子の食作用を蛍光測定法を用いて定量化するプロトコールを紹介します。この方法により、粒子の内在化とそれに伴うアクチン重合のハイスループット定量が容易になります。...

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

全反射蛍光顕微鏡を用いて、生きたマクロファージにおける前例のない高分解能のファゴソーム形成とクロージャを3次元で可視化するための実験設定について説明します。これにより、食細胞カップの基部、伸びる偽足、および食細胞の正確な部位を監視できます。...

「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します

この原稿は、レシオメトリック指標であるセミナフトロダフルーア(SNARF)-1またはS-1を使用して、ヒトおよびマウスの好中球のファゴソームpHと面積、および細胞質pHを測定する簡単な方法について説明しています。これは、生細胞共焦点蛍光顕微鏡法と画像解析を使用して達成されます。...

レシオメトリックpH指示薬を使用して好中球ファゴソームと細胞質のイメージング

ここでイメージの単一食イベントに回転ディスク共焦点顕微鏡を用いたマウス腹腔マクロファージの方法について述べる。他の貪食細胞に、プロトコルを拡張できます。...

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

リーシュマニア感染における貪食作用に関連するメカニズムは、ほとんど解明されていないままである。ここでは、リーシュマニアと宿主細胞との相互作用の間に起こる初期事象を評価する方法について説明する。...

共焦点顕微鏡を用いた リーシュマニア の貪食作用の調査

ここで提示されるプロトコルは、pH感受性蛍光分子に結合された非オプゾン化酵母(zymosan)粒子のマクロファージ(MΦ)食作用の間葉幹細胞(MSC)媒介性調節の動的画像を定量化し、生成するプロトコルです。...

間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング

本研究では、哺乳類細胞におけるGodanti...

哺乳類細胞におけるGodanti Bhasmaによって引き起こされる食作用の連続的な細胞イベントの探索

学ぶ 共焦点顕微鏡を用いた食作用の初期段階の可視化手法。Candida albicansなどの病原体が宿主細胞に侵入するメカニズムをリアルタイムで解析し、免疫学研究に有用な情報を提供します。

食作用の初期段階の可視化

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