Name: センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶ、遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞を生成する効率的なプロトコル。センダイウイルスによる遺伝子導入と遠心処理により、浮遊細胞の接着を促進し、創薬スクリーニングや再生医療への応用が可能なiPSCを樹立する方法を解説する。

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この作業は、韓国国立研究財団（NRF）を通じて基礎科学研究プログラムからの助成金によって支援されました。これは、科学・情報通信・未来計画省（2013R1A1A1076125)の資金提供を受けて行われました。

倫理に関する声明：本研究プロトコルは、カトリック大学校（KC12TISI0861）の施設内倫理委員会によって承認されました。 血からの単球細胞の1の単離<ol><li>単球細胞の単離（日-5） <ol><li>細胞調製チューブ（CPT）に採血から新鮮な血液の少なくとも10ミリリットルを取得します。 </li><li>新しい50mlのコニカルチューブに血液を移し、1で滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でそれを希釈：4の比率。 注：希釈の比率が高いが、より高純度のために使用することができます。 </li><li>新しい50 mlのコニカルチューブに密度勾配媒体の10ミリリットルを追加し、慎重に密度勾配媒体の上に希釈した血液をレイヤー。遠心ブレーキなしで室温（RT）で30分間、750×gで遠心分離します。 </li><li>慎重に、新しい50 mlのコニカルチューブにバフィー層を転送管にPBSの30ミリリットルを追加し、細胞を洗浄。 </li><li>室温で5分間、515×gで細胞を遠心&lt;/李&gt; <li> PBSを捨て、血液細胞培地の0.5ミリリットルで細胞を懸濁します。 </li><li>細胞をカウントし、24ウェルプレートのウェルあたり1×10 6個の細胞をプレート。蒸発を防ぐために、周囲のウェルにPBSを追加します。 </li><li>形質導入の前に5％CO 2中、37℃で5日間、細胞を安定化させます。細胞を乱すことなく、日3-4に新鮮な血液細胞のメディアの追加0.5ミリリットルを追加します。 </li></ol></li></ol>センダイウイルス2.伝達<ol><li>トランスダクション（0日目） <ol><li>収集し、15mlのコニカルチューブに血液細胞を転送し、血球計数器を使用してそれらを数えます。 </li><li>伝達あたり3×10 5細胞を調製し、室温で5分間、515×gで細胞を遠心します。 </li><li>吸引により上清を捨て、血液細胞培地の0.5ミリリットルで細胞を再懸濁します。 </li><li>非コーティングした24ウェルプレートのウェルに細胞を移します。 </li><li>氷の中にセンダイウイルスの混合物を解凍し、suコマンドに追加spended細胞。メーカーの推奨に基づいて細胞にセンダイウイルスを追加します。 </li><li>封止フィルムでプレートを密封し、30℃で30分間1,150×gで、それを遠心。 </li><li>遠心分離後、5％CO 2で一晩（O / N）で37℃で細胞をインキュベートします。 </li></ol></li><li>フィーダーマトリックスへの細胞移動（1日目） <ol><li>翌日、コートビトロネクチンとの24ウェルプレート。最終5μg/ mlの濃度のために、PBS中のビトロネクチン液を希釈します。 24ウェルプレートのウェルにビトロネクチンの1ミリリットルを追加し、少なくとも1時間、室温で静置します。使用前にコーティング溶液を除去します。コーティングしたプレートを3日間室温で保存することができます。 </li><li>コーティングしたウェルに細胞やウイルスを含むすべてのメディアを転送します。 </li><li>新鮮な血液細胞のメディアの追加0.5ミリリットルと残りの細胞を収集し、細胞含有ウェルにそれを追加します。 </li><li> 35℃で10分間、1150×gでプレートを遠心。 </li><li>セント後rifugation、上清を除去しIPSCメディアの1ミリリットルを追加し、5％CO 2、O / Nで、37℃で細胞を維持します。 </li></ol></li><li>第二の細胞移動（2日目） <ol><li>コートステップ2.2.1で説明したように5μg/ mlのビトロネクチンとの新しい24ウェルプレートのウェル、。各形質導入のためのプレートの1つのウェルを使用してください。 </li><li>新たにコーティングされたビトロネクチンプレートに第一プレートから細胞懸濁液を転送します。 注：必要でない場合、懸濁細胞を廃棄することができます。ステップ2.3に記載の手順では、懸濁細胞を2~3回繰り返すことができます。手順が繰り返される場合は、細胞を採取します。 </li><li>また、メンテナンスのため、第一プレートのウェルにIPSCメディアの1ミリリットルを追加し、5％CO 2、O / Nで37℃で静置します。 </li><li> 37℃で付着した細胞を維持し、5％CO 2、新鮮なIPSCメディアを毎日培地交換を行います。コロニーは形質導入後の日14-21に表示されます。 </li><li> Centrifug10分間1,150×gで35℃で懸濁細胞を含む電子新たにコーティングされたプレート。 </li><li>遠心分離後、5％CO 2、O / N中37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li>翌日、上清を除去し、新鮮なIPSCメディアと交換してください。 注：ステップ2.3に記載の手順では、懸濁細胞を2~3回繰り返すことができます。ステップが繰り返される場合は、上清中の細胞を採取し、ステップ2.3を繰り返します。 </li><li> 80％の密集度に到達するまで毎日メディアの変化と付着した細胞を維持します。 </li></ol></li></ol> 3.再プログラムされた細胞のメンテナンス<ol><li> 24ウェルプレートの培養後の早期のメンテナンス<ol><li>細胞がコンフルエントとしたら7-10日形質導入後、ビトロネクチンでコーティングされ、60-mmディッシュを準備します。最終5μg/ mlの濃度PBS中のビトロネクチン液を希釈します。皿にビトロネクチンの1ミリリットルを追加し、少なくとも1時間、室温で静置します。 </li><li>洗いますPBSで細胞と細胞を剥離するために、PBS / 1mMのEDTAの1ミリリットルを追加します。 </li><li> 37℃でそれらをインキュベートし、2分間、5％CO 2。 </li><li>細胞を採取し、2分間250×gで、室温でそれらを遠心分離します。上清を除去し、新鮮なIPSC培地3mlに細胞を再懸濁。 </li><li>プレートは、すべて新たにコーティングされた60-mmディッシュに細胞を再懸濁しました。 </li><li>細胞が80％コンフルエントになるまで、5％CO 2中37℃でそれらを細胞に10mMのRhoキナーゼ阻害剤を追加して維持します。 </li></ol></li><li>コロニーの外観のためのスプリット（サブクローニング調製） <ol><li>ステップ3.1.2で説明したように、ビトロネクチンでコーティングされた、100-mmディッシュを準備します。 </li><li> PBSで細胞を洗浄し、細胞を剥離するために、PBS / 1mMのEDTAの1ミリリットルを追加します。 </li><li> 37℃でそれらをインキュベートし、2分間、5％CO 2。 </li><li>細胞を採取し、2分間250×gで、室温でそれらを遠心分離します。 </li><li>血球計数器を用いて細胞をカウントし、ディッシュあたり1×10 4細胞を調製。</li><li> 250×gで細胞を遠心分離し、室温で2分間。 </li><li> IPSCメディアの6ミリリットル、再懸濁1×10 4個の細胞は、コーティングされた100-mmディッシュにそれらをめっきし、メディアに10mMのRhoキナーゼ阻害剤を追加します。 </li><li>大きなコロニーが現れるまで一週間、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。 注：サブクローニングのためのコロニーを維持し、展開します。サブクローニングは、通常、5継代の下で行われています。 </li></ol></li><li>ソリューションを外すIPSCのコロニーを使用してピッキングコロニー<ol><li>コロニーピッキング、種子ステップ3.2.7で述べたようにビトロネクチンでコーティングされた、100-mmディッシュで1×10 4細胞、前の週。 </li><li>ビトロネクチン溶液2mlを添加し、少なくとも1時間室温でインキュベートすることにより、ビトロネクチンでコーティングされ、60-mmディッシュを準備します。 </li><li>顕微鏡（40Xまたは100X倍率）を介して観察することにより、マーカーペンを使用して、明確な境界を有するコロニーをマーク。ステップ3.3.2で行われた新しいプレートからビトロネクチン溶液を除去し、6ミリリットルを追加します。IPSCのメディアは、10 mMのRhoキナーゼを補充しました。 </li><li>細胞から培養培地を除去し、PBSの3ミリリットルでそれらを洗ってください。 </li><li> IPSCコロニー取り外し溶液1mlを加え、室温で30秒のためにそれらをインキュベートします。 </li><li>プレートから溶液を除去し、さらに30秒間、室温で静置します。 </li><li> P200のピペットを用いて、プレートから200μlの培地を描き、ピペッティングによって標的コロニーを切り離します。新しい100-mmディッシュに飛散コロニーを転送します。 </li><li>インキュベートし、5％CO 2中37℃で細胞を維持します。 注：これらは10の特徴付けが、少なくとも10継代後に行われた通路に到達するまで、純粋なIPSCのコロニーを得た後、細胞を維持しました。抗体希釈プライマー情報を表1及び2に示されています。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+and+personalized+medicine%3A+current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives.</a> Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).</li>
<li>Seki, T., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application.</a> World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).</li>
<li>Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPSCs+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+non-integrative+Sendai+virus+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).</li>
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<li>Ohmine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+GMP-grade+hematopoietic+progenitor+cells+and+mononuclear+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).</li>
<li>Mae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nat Commun. 4, 1367(2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

胚性幹細胞（ESC）は、いくつかの欠点を示しているので、代替ツールの必要性が必要とされました。したがって、山中によって誘導多能性幹細胞（iPS細胞）の開発が国際的なスポットライトの下に来ました。山中は、多能性成体体細胞にのみ4つの遺伝子を添加することによって誘導することができることを発見して以来、約10年間でした。 iPS細胞は、成熟した体細胞から「誘導され」ているので、彼らはかつてのESCに関連する懸念されていた倫理的な問題を回避することができます。 ESCは異なり、性IPSCは、各個体から生成することができます。したがって、それらは、パーソナライズされた医学研究、薬物スクリーニング、疾患モデル、または再生薬のような他の研究において使用され得ます。 最初のヒトのIPSCが正常にこの細胞型の再プログラミング2007の様々なグループに皮膚線維芽細胞から生成されたが、侵襲的な外科的処置は、この一次電池を得ることが必要でした。したがって、それは考えではありませんでした様々な疾患iPS細胞を生成するか、再生医療を設計するためのリットルソース。代替的かつ容易に得られる細胞型は、ケラチノサイト...

幹細胞は、過去数十年の1のための臨床治療の中で最も魅力的な材料の一つとなっています。幹細胞の魅力的な特性は、多分化能と自己再生する能力です。 1981年、第一の胚性幹細胞（ESC）は、マウス胚2から単離しました。技術は、ヒト胚に適用した場合しかし、それはいくつかの倫理的な問題に直面しました。 博士は山中と彼のチームは、マウスの体細胞から最初の多能性細胞を再プログラムするとき、2006年に、幹細胞のフィールドは、その可能性を取り戻し、関心が3が再燃しました。いくつかの定義された因子を送達することによって、多能性幹細胞は、成体体細胞から「誘導され」、したがって、命名された成功した「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」を2007年には、この技術は、ESCの正確な特徴を有する細胞を得、ヒト細胞4に適用されたが、倫理的な議論のどれも。理論的には、のiPSCsは、任意の個体または患者から得られる任意の細胞型から生成することができます。患者特異的iPS細胞は、疾患の表現型および個々の患者のエピジェネティックな条件をシミュレートすることができます潜在的なツールとして上昇しています。遺伝子編集または病原性の状態を逆にすることができ、他の方法を使用して、患者特異的iPS細胞はまた、オーダーメイド医療5で使用することができます。彼らはドナーと同じ免疫アイデンティティを持っているので、また、性IPSCは少ない6自動移植より現実作り、免疫拒絶と関連しています。したがって、性IPSCは、疾患のモデリング、薬剤スクリーニング、および再生治療で最も有望なプラットフォームとなっています。これらの利点を考慮すると、最小の細胞源から最短の時間でより純粋な、より高い収率を与えることができる改良されたプロトコルが開発中で常にあります。将来のアプリケーションのための最も効率的なプロトコルを見つけることの1つの主要な考慮事項は、主要な細胞型です。早期IPSC生成プロトの大半colsのは、元のIPSCラインが皮膚線維芽細胞4から誘導されたので、接着細胞用に最適化されています。しかし、これらの細胞の単離および調製は、労働集約的です。また、皮膚線維芽細胞の単離は、より広範なアプリケーションのための主要な欠点になることができます侵襲性外科手術手順が含まれています。 したがって、iPS細胞をさらなる使用のために、便利な収集を有する細胞源が必要とされます。それはむしろ低侵襲手順7-9を介して取得されるので、血液は、理想的な細胞源とみなされます。本研究では、末梢血単核細胞（PBMC）からhiPSCs生成プロトコルに簡単な変更を開発しました。そのようなCD34 +細胞のような特定の細胞型の困難な膨張処理なしで、全血細胞またはPBMCを連続山中因子を含むセンダイウイルスで形質導入した後、遠心分離によりマトリックスでコーティングされたプレート上にプレーティングしました。この方法は、に必要な時間を減少しました形質導入浮遊細胞の付着とは、自分で取り付けることができませんでした再プログラミングされた細胞の損失を減少させました。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mmディッシュ</td><td>TPP&nbsp;</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル プレート</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コーニカル チューブ</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml コーニカル チューブ</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 使い捨てピペット</td><td>ファルコン</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 使い捨てピペット</td><td>ファルコン</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェル プレート</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PBMC Isolation Materials</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9805</td><td>血球培地</td></tr><tr><td>CC110</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>8697</td><td>血液細胞培地サプリメント (100倍)</td></tr><tr><td colspan="4">iPSC 創製・培養材料</td></tr><tr><td>CytoTune-iPSC 仙台リプログラミングキット</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A16518</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8 培地</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5940</td><td>iPSC 培地</td></tr><tr><td>ビトロネクチン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 阻害剤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express (TrypLE)</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>12604-039</td><td>コロニー剥離液</td></tr><tr><td colspan="4">品質管理 材料</strong</td></tr><tr><td>>18 mm カバーガラス</td><td>スーペリア</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルジヒド</td><td>Tech &イノベーション</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン&nbsp;</td><td>ベクターラボ</td><td>SP-5050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗SSEA4抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>抗Oct4抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>抗TRA-1-60抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>抗SOX2抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>抗TRA-1-81抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>抗KLF4抗体</td><td>アブカム</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L) 抗体</td><td>Molecular Probe</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 抗体</td><td>Molecular Probe</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス コーティング&nbsp;</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>イソプリピルアルコール</td><td>ミリポア</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA ポリメラーゼ</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBE バッファー&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>ローディングスター</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1kb (+) DNAラダーマーカー</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ</td><td>ミリポア</td><td>SCR004</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-1</td><td>リンスバッファー</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520.1000</td><td>リンス バッファー</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td>リンス バッファー</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td>リンス バッファー</td></tr></tbody></table>

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）の最近の開発は成熟した体細胞が未分化多能性の状態に戻ることができることを証明しました。 などケラチノサイト、尿細胞、線維芽細胞、初期の実験は、通常、皮膚線維芽細胞を用いて行った：今、再プログラミングは、成体の体細胞の様々なタイプを使用して行われます。しかしながら、これは、患者からの線維芽細胞を得るために侵襲的な外科的処置を必要としました。したがって、そのような血液および尿細胞などの懸濁細胞を、なぜなら一次細胞を得るための利便性の再プログラミングのために理想的と考えられました。ここでは、末梢血単核細胞（PBMC）からのIPSCを生成するための効率的なプロトコルを報告します。遠心分離を使用して、新しい、マトリックスでコーティングされたプレートにシリアルに形質導入したPBMCをメッキすることにより、このプロトコルは、簡単にIPSCのコロニーを提供することができます。この方法はまた、臍帯血単核細胞（CBMCs）にも適用可能です。この研究は、シンプルかつ効率的PROTを提示しますPBMCおよびCBMCsの再プログラミングのためのocol。

このプロトコルは、血液から単離したPBMCを再プログラムするための簡単な方法を提示します。シリアルめっきおよび遠心分離の組み合わせを使用して、iPS細胞が正常に生成されました。この方法では、性IPSCは、特定の細胞型を単離するか、拡大することなく、全血細胞の少量生成することができます。我々は成功し、小細胞培養プレートにのみ1×10 4個の細胞からiPS細胞を生成しました。 再プログラミングの前に、血液細胞は、密度勾配培地を用いて単離しました。血液細胞を5日間単離後に形質導入しました。 図1Aは、懸濁細胞のための再プログラミング法のスキームを示します。単離後、PBMCをよく非コートに山中因子を含むセンダイウイルスで形質導入しました。翌日、懸濁細胞は、遠心分離を用いてビトロネクチンでコーティングしたプレート上に採取し、播種した細胞ATT一方非コーティングされたウェルに痛んだが廃棄...

末梢血単核細胞(PBMC)を人工多能性幹細胞(iPSC)に再プログラミングするためのプロトコルを提案します。形質導入した血液細胞をマトリックスコーティングプレートに遠心分離で播種することにより、浮遊細胞からiPS細胞を成功裏に誘導します。この技術は、PBMCやCBMCなどの細胞に対するシンプルで効果的なリプログラミングプロトコルを示唆しています。

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

本研究の全体的な目的は、遠心分離による連続的な播種を用いて、末梢血単核細胞を人工多能性幹細胞（iPSC）にリプログラミングすることです。もともとiPSCは、線維芽細胞をリプログラミングすることで作製されていました。現在では、リプログラミングにさまざまな細胞が利用されています。しかしながら、血液は採取が容易であるため、PBMCは薬物スクリーニング、疾患モデリング、および再生医療開発におけるiPSCのさらなる応用のための、優れた細胞源となり得ます。本研究では、遠心力を加えることでPBMCを用いてiPSCをリプログラミングするプロトコルを紹介します。このプロトコルは、浮遊細胞をリプログラミングする際のもう一つの選択肢を提供します。手順を実演するため、私の研究室の大学院生であるNamに協力してもらいます。単球を分離するために、まず細胞調製チューブを用いて採血し、10 mL以上の新鮮な血液を採取します。次に、血液を新しい50 mLコニカルチューブに移し、滅菌PBSを用いて1:4の比率で希釈します。その後、新しい50 mLコニカルチューブに密度勾配媒体を10 mL加え、希釈した血液を密度勾配媒体の上に慎重に重層させます。次に、サンプルを室温で750 ×gにて30分間、遠心停止時間を設けずに遠心分離します。30分後、バフィーコート層を慎重に新しい50 mLコニカルチューブに回収します。PBSを30 milliliters加え、細胞を洗浄します。次に、室温で515 times gで5分間、細胞を遠心分離します。その後、PBSを捨て、0.5 millilitersの血球培地に細胞を再懸濁します。その後、細胞数をカウントし、24ウェルプレートに播種します。蒸発を防ぐため、周囲のウェルにPBSを添加してください。その後、導入前に細胞を37°Cで5日間安定させます。3日から4日目に、細胞を乱さないようにして、新鮮な血球培地をさらに0.5 milliliters加えます。この手順では、血球を15-milliliterコニカルチューブに移し、血球計数器を用いて細胞数をカウントします。次に、導入用に3×10⁵個の細胞を調製し、室温で515×gにて5分間、細胞を遠心分離します。その後、上清を吸引して除去し、0.5 millilitersの血液細胞培地で細胞を再懸濁します。次に、細胞をコーティングされていない24-wellプレートのウェルに移します。氷上でセンダイウイルス混合液を融解し、懸濁した細胞に添加します。プレートをシーリングフィルムで密閉し、30 °Cで1,150 ×gにて30分間遠心分離します。遠心分離後、細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。翌日、24ウェルプレートをビトロネクチンでコーティングするため、ビトロネクチン溶液をPBSで希釈し、最終濃度を5 µg/mLにします。次に、ウェルに1 mLのビトロネクチンを加え、室温で少なくとも1時間インキュベートします。その後、コーティング溶液を除去し、細胞とウイルスを含むすべての培地をコーティングしたウェルに転移します。続いて、残りの細胞をさらに0.5 mLの新鮮な血球培地で回収し、細胞が入ったウェルに加えます。続いて、プレートを35 °Cで1,150 ×gにて10分間遠心分離し、その後、細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩培養します。2回目の細胞移植のために、前述の方法に従い、ウェルを5 µg/mLのビトロネクチンでコーティングします。各トランスダクションにつきプレートの1ウェルを使用し、1枚目のプレートから細胞懸濁液を新しくビトロネクチンでコーティングしたプレートへ移します。その間に、維持のために最初のプレートのウェルにiPSC培地を1 mL加え、37 °C、5% CO₂条件下でインキュベートし、新鮮なiPSC培地で毎日培地交換を行います。導入後、14日から21日でコロニーが出現します。懸濁細胞を含む、新しくコーティングしたプレートを、35 °Cで1,150 ×gにて10分間遠心分離します。遠心分離後、細胞を37°C、5% carbon dioxideの条件下で一晩インキュベートします。翌日、上清を除去し、新鮮な人工多能性幹細胞培地と交換します。細胞が80% confluencyに達するまで、毎日培地を交換して接着細胞を維持します。コロニーピックアップの1週間前に、ビトロネクチンでコーティングした100 mmディッシュに1×10⁴個の細胞を播種します。次に、2 mLのビトロネクチン溶液を添加してビトロネクチンでコーティングした60 mmディッシュを準備し、室温で1時間以上インキュベートします。顕微鏡で観察し、境界が明確なコロニーをマーカーペンでプレートの底面にマークします。新しいプレートからビトロネクチン溶液を除去し、10 mMのRHOキナーゼを添加した誘端多能性幹細胞培地を6 mL加えます。続いて、細胞から培養液を除去し、3 mLのPBSで洗浄します。次に、iPSCコロニー剥離溶液を1 mL加え、室温で30秒間インキュベートします。その後、プレートから溶液を除去し、室温でさらに30秒間インキュベートします。30分後、プレートから200 µLの培地を分注し、ピペッティングによって目的のコロニーを剥離させます。次に、分散させたコロニーを新しい60 mmディッシュに移します。細胞を37°C、5%二酸化炭素条件下で、継代10代に達するまで培養・維持します。リプログラミングの初期段階では、iPSCsは接着した非リプログラミング分化細胞と混在しています。増殖させる前に、iPSCsとその他の細胞を識別して区別します。細胞を低密度で播種することにより、ピッキングに十分な大きさのコロニーが得られました。コロニーを単離した後、細胞塊を単一細胞に分散させて培養しました。その後、純粋なiPSCコロニーが確認されました。純粋な人工多能性幹細胞を増殖させた後、細胞の品質を確認した。人工多能性幹細胞が未分化状態であることを確認するため、細胞をアルカリホスファターゼで染色した。単離された人工多能性幹細胞由来のコロニーはすべて陽性反応を示した。多能性マーカーを免疫蛍光染色により確認した。再プログラミングされた細胞は、SSEA4、Oct4、Sox2、TRA-1-81、Klf4、そして最も重要なTRA-1-60などの多能性マーカーを高発現しており、これらの多能性マーカーの発現はRT-PCRによって確認された。遠心分離による連続播種を用いて、PBMCをマトリックスコートしたプレートに接着させた。添付された手順に従い、iPSCコロニーを精製のために継代します。本プロトコルを用いることで、PBMCから1か月以内にiPSCを生成することが可能です。このプロトコルは、導入細胞の接着に要する時間を短縮し、自力で接着できなかったリプログラミング細胞の喪失を防ぎます。しかしながら、この手順を試みる際、完全にリプログラミングされたコロニー形成能を持つiPSCの精製が極めて重要となる場合があります。以前、我々は本プロトコールを用いてPBMCおよび単核細胞のリプログラミングに成功しました。こうして作製された血液細胞由来のiPCは、幅広い研究分野で活用することが可能です。このプロトコルは、さらなる応用や研究に向けて、他の種類の浮遊懸濁細胞のリプログラミング工程に役立てることができます。

induced-pluripotent-stem-cell-generation-from-blood-cells-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

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エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

学ぶ、遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞を生成する効率的なプロトコル。センダイウイルスによる遺伝子導入と遠心処理により、浮遊細胞の接着を促進し、創薬スクリーニングや再生医療への応用が可能なiPSCを樹立する方法を解説する。

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

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