センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

この研究の全体的な目標は、遠心分離による連続プレーティングを使用して、末梢血単核細胞を人工多能性幹細胞に再プログラムすることです。もともとiPS細胞は、線維芽細胞のリプログラミングによって作られていました。今日、さまざまなものが再プログラミングに使用されています。

しかし、血液が入手しやすいため、PBMCは、薬物スクリーニング、論文モデリング、再生医療開発など、iPS細胞のさらなる応用には受け入れられない細胞源となる可能性があります。この研究を通じて、PBMCを使用して遠心力を加えることによりiPS細胞のリプログラミングに関するプロトコルを共有します。このプロトコルは、フローティングセルを再プログラミングする際に別のオプションを提供します。

手順のデモンストレーションには、私の研究室の大学院生であるNamを使用します。単球性細胞を単離するには、まず、細胞調製チューブで採取した血液から少なくとも10ミリリットルの新鮮な血液を採取します。次に、血液を新しい50ミリリットルの円錐管に移し、滅菌PBSで1対4の比率で希釈します。

その後、10ミリリットルの密度勾配培地を新しい50ミリリットルの円錐管に加え、希釈した血液を密度勾配培地の上に慎重に重ねます。次に、サンプルを750倍gで室温で30分間、遠心分離せずに遠心分離します。30分後、バフィー層を新しい50ミリリットルの円錐管に慎重に移します。

30ミリリットルのPBSを加え、細胞を洗浄します。次に、細胞を515倍gで室温で5分間遠心分離します。その後、PBSを廃棄し、細胞を0.5ミリリットルの血球培地に再懸濁します。

その後、細胞をカウントし、24ウェルプレートに播種します。蒸発を防ぐために、周囲の井戸にPBSを追加します。その後、形質導入前に細胞を摂氏37度で5日間安定化させます。

細胞を乱さずに、3日目から4日目にさらに0.5ミリリットルの新鮮な血球培地を追加します。この手順では、血球を15ミリリットルの円錐管に移し、血球計算盤を使用してそれらをカウントします。次に、形質導入用の細胞を10〜5個目の細胞に3倍調製し、細胞を515gで室温で5分間遠心分離します。

その後、吸引により上清を捨て、細胞を0.5ミリリットルの血球培地に再懸濁します。次に、細胞をコーティングされていない24ウェルプレートのウェルに移します。仙台ウイルス混合物を氷で解凍し、懸濁細胞に加えます。

プレートをシールフィルムで密封し、1.150gで30°C、30°Cで遠心分離します。遠心分離後、細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素中で一晩インキュベートします。24ウェルプレートをビトロネクチンでコーティングするには、翌日、ビトロネクチン溶液をPBSで希釈して、最終濃度が1ミリリットルあたり5マイクログラム

次に、1ミリリットルのビトロネクチンをウェルに加え、室温で少なくとも1時間インキュベートします。その後、コーティング溶液を取り除き、細胞とウイルスを含むすべての培地をコーティングされたウェルに移します。次に、残りの細胞を0.5ミリリットルの新鮮血球培地で収集し、細胞含有ウェルに加えます。

続いて、プレートを1,150倍gで35°Cで10分間遠心分離し、次いで細胞を5%二酸化炭素中で37°Cに一晩維持する。2回目の細胞移植では、前述のように、1ミリリットルあたり5マイクログラムのビトロネクチンでウェルをコーティングします。形質導入ごとにプレートの1ウェルを使用し、最初のプレートから細胞懸濁液を新しくコーティングしたビトロネクチンプレートに移します。

その間、メンテナンスのために1ミリリットルのiPS細胞培地を1ミリリットルのiPS細胞培地を1枚目のプレートのウェルに加え、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートし、毎日新しいiPS細胞培地と培地を交換します。コロニーは形質導入後、14日目から21日目に現れます。懸濁細胞を含む新たにコーティングされたプレートを、摂氏35度で1.150倍のgで10分間遠心分離します。

遠心分離後、細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素中で一晩インキュベートします。翌日、上清を取り除き、新しい人工多能性幹細胞培地と交換します。付着した細胞を、80%のコンフルエント度に達するまで、毎日の培地交換で維持します。

コロニーピッキングの1週間前に、ビトロネクチンでコーティングされた100ミリメートルの皿に10〜4番目の細胞を1回播種します。次に、ビトロネクチンをコーティングした60mm皿に2ミリリットルのビトロネクチン溶液を加えて調製し、室温で少なくとも1時間インキュベートします。顕微鏡で観察することにより、マーカーペンを使用してプレートの底のコロニーに明確な境界でマークを付けます。

新しいプレートからビトロネクチン溶液を取り出し、6ミリリットルの人工多能性幹細胞培地に加え、10ミリモルのRHOキナーゼを補充します。続いて、細胞から培地を取り出し、3ミリリットルのPBSで洗浄します。その後、iPS細胞コロニー剥離液1ミリリットルを加え、室温で30秒間インキュベー

その後、プレートから溶液を取り出し、室温でさらに30秒間インキュベートします。30分後、プレートから200マイクロリットルの培地を引き出し、ピペッティングで目的のコロニーを分離します。次に、散らばったコロニーを新しい60ミリメートル皿に移します。

細胞をインキュベートし、5%二酸化炭素中で摂氏37度に維持し、継代10に達するまで維持します。リプログラミングの初期段階では、iPS細胞を付着していないリプログラミングされていない分化細胞と混合しました。増殖する前は、iPS細胞と他の細胞は区別するために異なっていました。

細胞を低密度で播種することにより、ピッキングに十分な大きさのコロニーが得られました。コロニーを単離した後、細胞塊を単一細胞に解離させ、培養しました。その後、純粋なiPS細胞コロニーが見られた。

純粋な人工多能性幹細胞が増殖した後、細胞の品質が試験されました。細胞をアルカリホスファターゼで染色し、誘導された多能性幹細胞の未分化状態を確認しました。単離された人工多能性幹細胞に由来するコロニーは、すべて陽性染色を示しました。

多能性マーカーは免疫蛍光染色により確認されました。再プログラムされた細胞は、SSEA4、Oct4、Sox2、TRA-1-81、Klf4、そして最も重要なことにTRA-1-60などの多能性マーカーを高発現し、多能性マーカーの発現をRTPCRによって確認しました。遠心分離によるシリアルメッキを使用して、トランジットのアタッチメントはPBMCを使用し、メトリックコーティングされたプレートに取り付けます。

ド通りであり、iPS細胞コロニーは精製のために繰り返されます。このプロトコルを使用すると、PBMCから1か月以内にiPS細胞を生成できます。このプロトコールは、形質導入細胞の接着に必要な時間を短縮し、それ自体で接着できなかった再プログラムされた細胞の損失を防ぎます。

しかし、この手順を試みる際には、完全に再プログラム化されたコロニー形成iPS細胞の精製が重要となる場合があります。以前、このプロトコルを使用してPBMCと単核細胞の再プログラミングに成功しました。生成された血球由来のiPCは、さまざまな研究分野で幅広く利用することができます。

このプロトコルは、他のタイプのフローティングサスペンションセルのリプログラミングプロセスを支援し、さらなるアプリケーションや研究を行うことができます。