Name: 細菌の付着と血清抵抗性ビトロネクチンの役割を研究するための試金 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶ細菌とビトロネクチンの相互作用解析法。フローサイトメトリーとELISAを用いて、病原体がヒトタンパク質を利用して感染を確立するメカニズムを解明し、宿主病原体相互作用の理解と新規治療戦略開発に貢献します。

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この作品は、アンナの財団とエドウィン ・ ベルガー、Lars Hierta、o. e.、Edla ・ ヨハンソン財団、スウェーデン医学研究評議会からの補助金によって支えられた (許可番号 K2015 57 X-03163-43-4、www.vr.se)、大学でがん財団マルメ ・家庭的社会 (性の基礎) とスコーネ郡評議会の研究・開発財団の病院。

1. 細菌の表面タンパク質のリガンドとしてベトナムの解析
<ol><li>
フローサイトメトリーを用いた細菌の表面で Vn 結合の検出 注意: フローサイトメトリーでを使用して前方散乱、側方散乱肯定的なイベントのゲートへ。Vn との相互作用を調べる Hif 臨床分離 (n = 10)エシェリヒア属大腸菌BL21 と共に選ばれた7 (DE3) (図 1A) のネガティブ コントロールとして。<ol>
<li>文化 Hif 臨床は、10 μ G/ml NAD と 200 rpm で振とうしながら 37 ° C でヘミン培脳心臓注入 (BHI) で分離されます。大腸菌14の文化へルリア ベルターニカミラ培地を使用します。中間ログ段階で Hif を収穫 (外径600 0.3 =)15、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の pH 7.2, 1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) (ブロック バッファーを含む内の細菌を再停止しなさいとPBS-BSA)。10 にサスペンションを調整9 CFU/mL。</li>
		<li>5 x 106 5 mL ポリスチレン丸底チューブ (12 × 75 mm2) CFU を含む因数を転送し、1 mL のブロック バッファーを追加します。、細菌を餌に 3,500 × gで 5 分間室温 (RT)16の懸濁液を遠心分離し、ペレットを乱すことがなく、上清を除去する慎重に吸引します。</li>
		<li>50 μ L 250 を含むバッファーを妨げるのと細菌のペレットを再懸濁します nM (ヴァイオリン) を振ることがなく常温 1 時間サンプルをインキュベートし、。インキュベーション後、3,500 x gで 5 分での遠心分離によって細菌を餌して PBS と同様の遠心分離手順を使用して 3 つのペレットを洗ってください。</li>
		<li>細菌のペレット PBS BSA で 1: 100 希釈でプライマリ羊抗ひと Vn ポリクローナル抗体 (Pab) の 50 μ L を追加します。常温では、1 h の懸濁液をインキュベートして 3 回非連結抗体 (1.1.3 のステップで説明します) を削除する PBS の細菌を洗ってください。</li>
		<li>次に、50 μ L の PBS BSA 含むかに (FITC) を追加-ロバ反羊 Pab (1: 100 希釈) を共役し、RT で暗闇の中で 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>空のコントロールを準備するには、バッファーのみと Vn なし Pab をブロックで細菌を培養します。</li>
		<li>3 回 1 mL のブロック バッファーを持つ細菌を洗浄し、セクション 1.1.2 で説明されているように、遠心分離によって懸濁液をペレットします。最後に、300 μ L の PBS による細菌のペレットを再懸濁し、流れ cytometry7によって分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ELISA 組換え PH とベトナムとの間の相互作用の解析 注: コントロールは、非特異的結合を除外する含まれる必要があります。人間要因 H (FH) または C4b 結合蛋白質 (C4BP) はそれぞれ正と負のコントロールとして使用されます。<ol>
<li>50 に分けて人間のタンパク質 (Vn、FH、C4BP) の各希釈トリス-HCl、pH 9.0 (コーティング バッファー) の nM。Polysorp マイクロ プレートの各ウェルにタンパク質溶液 100 μ L を分注します。蓋付きプレートを閉じ、マイクロタイター プレートの井戸に 4 ° C で一晩 (16 h) タンパク質の固定化を容易にするために保管します。</li>
		<li>シンク上の逆さまの傾きによってマイクロタイター プレートから液を捨て、PBS/ウェルの 300 μ L で 3 回洗浄します。2.5% (w/v) BSA (PBS-BSA) を含む PBS で RT で 1 h のコーティングの井戸をブロックします。</li>
		<li>ブロッキング液を除去した後 0.05% (v/v) トゥイーン 20 (pbst;) ウェルあたりを含む PBS の 300 μ L で 3 回洗浄します。50 nM 組換え各サンプルに彼の付けられた PH も、室温 1 時間インキュベートの 100 μ L を追加します。コントロール井戸のみ 100 μ L の PBS BSA を追加します。 注: Hif から PH lph遺伝子に PCR によって増幅され発現タンパク質の C 末端に 6 × His タグを追加します pET26b 発現ベクターにクローニングします。組換えのベクトルは、式のエシェリヒア属大腸菌BL21(DE3) に変身しました。Ni NTA 樹脂15組換え蛋白質を浄化するために使用されました。</li>
		<li>タンパク質溶液を破棄し、3 回の pbst; 300 μ L/ウェルと井戸を洗浄することにより自由な蛋白質を削除します。100 μ L の PBS BSA 含む西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) を追加-(1:10, 000 希釈) 反彼の Pab を共役し、室温 1 時間インキュベート</li>
		<li>テトラメチルベンジジン 5% アセトンと 45% メタノール溶液中に溶解して溶液 20 mM を準備します。ソリューション B を準備するには、H2O 1,000 mL にクエン酸の 19.2 g を溶解、KOH を追加して 4.25 に pH を調整し、30% H2O2の 230 μ L を追加します。室温暗の両方のソリューションを格納します。使用する直前には、9.5 ml 溶液 elisa 法の検出試薬を準備するのソリューション B の 500 μ L をミックスします。</li>
		<li>3 回 PBST の 300 μ L/ウェルと井戸を洗浄し、elisa 法の検出試薬を 100 μ l 添加を各ウェルに追加することによって抗原抗体の複合体を検出します。</li>
		<li>1 M H2の 50 μ L を追加し、反応を停止する4/well。450 で井戸の光学密度を測定マイクロ プレート リーダーを使用して nm。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
遺伝子組換えの PH と Vn のバリを使用しての相互作用の速度論の研究
	<ol>
<li>製造元のガイドライン11によるとアミン反応性センサー結合法、アミンを使用して人間の Vn を固定します。</li>
		<li>PBS を使用すると、直列 4 μ M を 0 からリガンド (組換え PH) を希釈し、結果のソリューションを 96 ウェル黒、平底マイクロ プレートに転送します。バリ楽器17を使用して 30 の ° C で実験を実行します。</li>
		<li>バリ データ解析ソフトウェアで、データ フォルダーをロードします。センサー選択を選択します。その後、選択 'よく '(PBS で Vn 被覆センサー) の参照減算。</li>
		<li>'Y 軸のベースラインに整列'し'interstep 補正と協会に揃える」を選択します。[分析] タブが自動的に開きます「プロセス データ」を押します。</li>
		<li>[分析] タブでカーブ フィットの下「協会と解離」オプションを選択します。モデルを選択 ' 1:1 バインドとグローバル フィット '。『 カーブ フィット 』とエクスポート データ17をフィッティングを押します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細菌付着の Vn の役割のキャラクタリゼーション
<ol><li>
Vn コーティング ガラス表面の細菌付着に関する研究
	<ol>
<li>Vn の PBS とピペット 10 μ L ガラス顕微鏡にこの液の一滴としてスライドの 2 μ g/mL のソリューションを準備します。ネガティブ コントロールとしてひと血清アルブミン (HSA) とスライドしたコートで 30 分間スライドを乾燥させるドロップを許可します。</li>
		<li>タンパク質被覆ガラス スライドを 3 回洗浄コーティングされていない過剰なタンパク質を削除する PBS を含むビーカーに 2 秒間スライドを浸漬しました。滅菌プラスチック シャーレに新鮮な Hif 文化 (1.1.1 の手順で説明します) の 20 の mL を追加し、水没 Vn-/HSA コーテッド ガラス スライド培養培地で。20 rpm で振とうしながら 37 ° C 1 時間で料理を孵化させなさい。 注: Hif M10 と Hif M10Δlphは液体 BHI 培地やチョコレート寒天培地プレート上に育った。Lphの突然変異のための媒体は 10 μ G/ml カナマイシン15と補われました。</li>
		<li>インキュベーション後、PBS が入ったビーカーに 3 回スライドを水没によってバインドされていない細菌を除去します。前述のグラム染色で細菌を視覚化します。<ol>
<li>各スライドからそれを傾斜とティッシュ ペーパーの上に端に触れることによって余分な PBS を削除します。常温では、3-5 分用のスライドを風乾、各スライドの炎で 3 回を渡すことによって付着細菌を修正します。</li>
			<li>染色トレイの端を 2 本の指でスライドを保持し、2.3% クリスタル バイオレット溶液の 3-4 滴 (200-300 μ L) を追加します。待機 60 秒、し、タップの穏やかな流れの下でスライドが 3-4 秒の水洗浄します。</li>
			<li>スライドに 0.33% ヨウ素液の 3-4 滴を追加します。1 分を待ってから、水道水の穏やかな流れの下でスライドをすすいでください。慎重にあぶらとり紙でスライドを乾燥させます。</li>
			<li>75% イソプロピル アルコールのスライドに 25% アセトン脱色液の 3-4 滴を追加します。5-10 秒後に、水道水の穏やかな流れの下でスライドを洗います。</li>
			<li>基本的な carbolfuchsin ソリューションの 3-4 滴 (200-300 μ L) を追加します。1 分を待ってから、水道水の穏やかな流れの下でスライドをすすいでください。あぶらとり紙を使用してスライドを乾燥させます。</li>
			<li>100 倍率18倍の油浸対物レンズの選択、光学顕微鏡下で細菌を視覚化します。Hif WT と Vn と HSA コーティング ガラス表面に突然変異体の細菌の付着を比較します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vn 依存へ上皮細胞への細菌付着に関する研究 注: この効率的な付着試験は私たちの以前の研究の4,7で使用されました。<ol>
<li>10% (巻/巻) 牛胎児血清 (FCS) (完全培地) と 5 μ G/ml ゲンタマイシン F12 培と 75 cm2培養フラスコで培養 A549 細胞 (II 型肺胞上皮細胞)。80% 合流まで 3 日間の 37 ° C で 5% CO2インキュベーターでフラスコを孵化させなさい (の confluency は倒立顕微鏡による細胞表面被覆率の可視化による推定できます)。次の 4 つのステップでは、アッセイの19,20の上皮細胞を準備する方法について説明します。<ol>
<li>穏やかな旋回で 20 mL の PBS で 2 回フラスコ内でセル単一層を洗います。フラスコ表面から細胞をデタッチするには、細胞剥離酵素溶液 2 mL を追加し、37 ° C で 5 分間フラスコを孵化させなさいプラスチックの表面から細胞をすべて外しに手のひらでフラスコをタップします。上下に数回、また細胞塊を分散させます。</li>
			<li>F12 完全培地の 18 mL をフラスコに追加し、全体の細胞懸濁液を 50 mL の滅菌ファルコン チューブに転送します。RT で 200 x gで 5 分間細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します。F12 完全培地 10 mL に細胞ペレットを再懸濁します。</li>
			<li>細胞懸濁液の 10 μ L を削除し、エッペン チューブに配置、トリパン ブルー溶液 90 μ L を追加します。診断にサンプルを読み込む (深さ 0.1 mm)、coverslip を配置した後。</li>
			<li>エリア A、B、C、および D のすべての実行可能なセルをカウント (16 の正方形から成っている各フィールドとそれぞれの正方形は、0.0025 mm2の面積を持つ)、平均細胞数を計算 ([A + B + C + D]/4)。次の式を使用しての 1 ミリリットルあたりのセル数を計算します。 実行可能な細胞/ml = 平均セル数 × 104 × 希釈率20。 注: ここでは、希釈倍率は 10 です。</li>
			<li>103セル/mL 完全の含んでいる 5 μ G/ml ゲンタマイシン媒体を使用して x 5.0 に細胞懸濁液を希釈します。24 ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、細胞懸濁液 500 μ L を調剤します。セルが 90% 合流までは、37 ° c 5% CO2で板を孵化させなさい。</li>
		</ol>
</li>
		<li>細菌の感染前に井戸からメディアを削除し、(FCS)、なし F12 媒体を追加し、37 ° C で一晩インキュベート</li>
		<li>RT。 場所氷の上のプレートに 500 μ L の PBS を使用して 3 回細胞膜を洗浄し、中古冷蔵 F12 培 1 h 4 ° C でヴァイオリン加温プレートの 10 μ G/ml の 100 μ L を追加します。コントロールの井戸、F12 媒体のみを追加します。</li>
		<li>インキュベーション後、ピペッティングにより液を捨て、新たに育てられた Hif M10 の文化でルートを再懸濁します 1 mL の PBS で 2 回細胞層を洗う (ステップ 1.1.1) F12 中 (2 × 108 CFU/mL)。各ウェルにこの細菌懸濁液 100 μ L を追加し、37 ° C で 2 時間版を孵化させなさい 注: それぞれはよく約 2 × 105 A549 細胞を含まれています。感染症、細菌 CFU が追加された、2 × 10 の7 100 の感染症の多様性に対応します。</li>
		<li>ピペッティングでメディアを削除し、PBS で 3 回 A549 細胞を洗ってください。50 μ L/ウェルの細胞剥離液を追加し、37 ° C で 5 分間プレートを孵化させなさい</li>
		<li>次に、F12 あたりも酵素反応を停止する完全な媒体の 50 μ L を追加します。4 つのガラス玉を含む 6 mL ガラス管に各ウェルから上皮細胞 (≈100 μ [すなわち、全体ボリューム]) を転送します。2 分間ボルテックスによる RT で細胞を溶解させます。</li>
		<li>細胞ライセートの 10 μ L を 100 倍希釈 F12 媒体の 990 μ L に溶解液の 10 μ L を追加することによって。チョコレート寒天培地プレート上に希釈したサンプルの 10 μ L をプレートします。</li>
		<li>37 ° C でチョコレート寒天培地プレートを一晩インキュベートし、コロニーをカウントします。各植民地は、1 CFU を表します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ひと血清の殺菌活性に Vn 依存的抵抗性の解析
<ol><li>商業ソースから NHS で購入。上記12として VDS を準備します。180 と VDS を補充する nM Vn Vn NHS の存在に相当します。</li>
	<li>56 ° C、30 分で補体蛋白質を不活性化するために NHS を加熱して熱非動化血清 (HIS) を準備します。 注: 最適な血中濃度 (5%) と 3.3 – 3.7 の手順に記載されている試金のための培養時間 (15 分) は、Hif15経験的に決定されたこれらのパラメーター可能性がありますその他の細菌性の病原体によって異なります。</li>
	<li>中間ログ相に (この場合、Hif M10 と変異 Hif M10Δlph) の細菌の文化 (外径600 = 0.3)。3,500 x gで 10 分間遠心分離によって細菌をペレットします。</li>
	<li>1 ブドウ糖ゼラチン Veronal バッファー (DGVB ++; pH 7.3) 含む 2.5% (w/v) グルコース、MgCl22 mM、0.15 mM CaCl2、および 0.1 %wt/vol のゼラチン量で細菌のペレットを再懸濁します。</li>
	<li>追加 1.5 x 103 5% 血清を含む DGVB ++の 100 μ L に細菌の CFU (NHS、彼、VDS または VDS + 180 nM Vn)。300 rpm で振とうしながら 15 分の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>0 分 (T0サンプル)、15 分 (Ttサンプル) チョコレート寒天培地プレートで反応混合物から 10 μ L 分注を削除します。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、プレートに表示されるコロニーをカウントします。細菌の割合を殺した12次の方程式を使って計算: (CFU Tt)/(T0CFU) × 100。</li>
</ol>

<ol><li>Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+in+bacterial+pathogenesis%3A+a+host+protein+used+in+complement+escape+and+cellular+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion.</a> Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).</li>
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著者は金融利益相反があります。

細菌性病原体は、細胞表面に Vn を募集し、補足物の要因の成膜および膜の攻撃の複合体2の完了を防ぐためにこの補完するレギュレータを利用します。Vn は、上皮細胞の表面に付着し、その後内面化を仲介する病原体ができ細菌の表面タンパク質とホスト細胞の表面の受容器、ブリッジの分子としても機能します。本研究では血清抵抗性および強化を提供する i) へのバインド (ヴァイオリン) の細菌細胞、ii) 蛋白質蛋白質の相互作用および親和性定数の表面および iii) Vn の機能的役割を推定するためのプロトコルについて述べる宿主細胞の表面に付着します。
フローサイトメトリーは、Vn を細菌にバインドを検証する一般的に使用される量的手法です。ただし、Vn 濃度を最適化する必要が、Vn 結合容量 (と種々 の受容体) は菌種によって異なることが。ここで説明アッセイ、1-100 μ g/mL (ヴァイオリン) の線形結合と彩度パラメーターを推定する使用されました。WT Hif のバインドのパターン、Hif M10Δlph変異陰性対照...

ビトロネクチン (Vn) は、線溶系の調節することによる恒常性の維持に関与する重要なひと糖です。Vn は 7 C5b6 複合体形成と C9 重合中に端末の補体経路を阻害することによって補完する調節因子としても機能します。いくつかの細菌性病原体は、抵抗補完沈着1,2,3の手段として細胞表面にヴァイオリンを募集する示されています。また、Vn は病原体2,4、5の内面化とホスト上皮細胞受容体、それによって促進付着細菌の「サンドイッチ」分子として機能します。Vn のバクテリアの細胞表面へのバインドは、他の現在正体不明の蛋白質によって媒介されます。完全にホースの免疫の回避で Vn バインディングの機能的役割の解明が必要になります (ヴァイオリン) 募集タンパク質の同定。
Vn 結合蛋白質を識別するに最初のステップは、関心の病原体は精製フローサイトメトリー ヴァイオリンをバインドできるかどうかをテストするのには、Vn が病原体のセルにバインドされているかどうかを決定するための便利で簡単な方法です。本研究では様々 なヘモフィルスタイプ f (Hif) 臨床分離株6の Vn の結合を評価しました。記載方法、定量細菌株の様々 の結合容量を区別するために使用することができます。以前の研究ではタンパク質 Hif の H (PH) を Vn 結合タンパク質7として特徴付けられます。したがって、本研究では野生型 (WT) Hif と Hif M10Δlphの突然変異体の Vn 結合のポテンシャルは、記述されていたプロトコルを用いて比較した.
Vn を病原体にバインドそれが決定されると、2 番目のステップは、潜在的な Vn 結合蛋白質を識別するために表面のプロテオームを特徴付けるためです。この目的8,9には、さまざまなアプローチを使用できますが、これらの方法論は、このレポートに記載されていません。Recombinantly大腸菌の選択した細菌の表面タンパク質の表現し、親和性クロマトグラフィーによる浄化する蛋白質蛋白質の相互作用を調べることに最も適した方法です。ここでは、メソッドを説明するために PH と Vn の分子相互作用を使用します。遺伝子組換えの PH とベトナム間の相互作用は、酵素免疫測定法 (ELISA)7とバイオ層干渉 (結合)10,11として知られている最近開発されたラベル無料手法を用いた特徴付けられました。Elisa は、タンパク質間相互作用を確認する使用ことができます、一方、バリは相互作用の速度論的パラメーターに関する詳細なデータを提供します。
細菌付着の Vn の機能的役割を勉強するには、2 つの異なるアッセイを利用できます。2 番目の分析検査上皮細胞の表面への付着に対し、ここで説明した最初の試金は Vn コーテッド ガラス表面の細菌付着の直接測定です。最初の試金のためスライド ガラスは、Vn でコーティングした、WT や Hif の突然変異系統のバインディングはグラム染色と顕微鏡で評価しました。この手法は、容易に Vn12をバインドする機能に基づく細菌を区別します。哺乳動物細胞への細菌の付着に II 型肺胞上皮細胞の単層培養菌を追加して分析しました。細菌付着がコロニー形成数を数えることによって評価されたユニット (CFUs)。付着、内面化された細菌は、Vn4,13の有無で区別できます。
Vn 細菌血清抵抗性獲得の役割は、(すなわち、血清殺菌) 血清殺害の試金を使用して評価しました。血清抵抗性で、Vn 買収の意義を評価するには、Vn 枯渇血清 (VDS) の殺菌活性は、正常ひと血清 (NHS) と比較した.容易に使用法は血清抵抗性に基づく拘束力のない細菌対 Vn バインディングを区別します。いくつかの細菌性病原体4,12の血清抵抗性の Vn の役割を研究するこのメソッドを使いました。
宿主-病原体相互作用を研究するための多数の方法を報告されています。ここでは、一連のすべての病原体の研究に Vn の病態での役割を評価するために簡単に合わせることができるプロトコルについて述べる。我々 は様々 な病原体を使用してこれらのプロトコルをテストし、Hif はこのレポートのための例として選ばれました。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL サーモミクスター</td><td>Eppendorf</td><td>5355</td><td>ドライブロック加熱および冷却シェーカー</td></tr><tr><td>5 mL ポリスチレン丸底チューブ&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>60819-138</td><td>12 &times; 75 mm スタイル</td></tr><tr><td>5% CO2 供給インキュベーター&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>BBD6220</tr><tr><td>6mLポリスチレン丸底チューブ&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89000-478</td><td>12 &times; 75 mm スタイル キャップ付き</td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>BD ファルコン</td><td>08-772-1H</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>30% 過酸化水素 (H2O2) 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>ラボ分析グレード</td></tr><tr><td>75 cm2 組織培養フラスコ</td><td>BD ファルコン</td><td></td><td>BD353136 ベント</td></tr><tr><td>96ウェルブラックフラットボトムプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td>組織<td>培養処理&マイクロ;透明な黒色のプレート</td></tr><tr><td>A549 細胞株ヒト</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86012804-1VL</td><td></td></tr><tr><td>細胞剥離酵素 (Accutase)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-500ML</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>AR2G センサー</td><td>Pall Life Science</td><td>18-5095</td><td>アミノカップリングによる固定化タンパク質へのセンサー&nbsp;</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>VWR</td><td>97064-786</td><td>分析グレードの</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td>細胞<td>培養に適した</td></tr><tr><td>ビビュラスペーパー&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28511-007</td><td></td></tr><tr><td>バイオ層干渉計</td><td>ポールライフサイエンス</td><td>FB-50258</td><td>二層干渉計 測定装置</td></tr><tr><td>クリスタルバイオレット溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td></td></tr><tr><td>C4BP (C4b binding protein)</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A109</td><td>冷凍液体形態として購入</td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>カルボルフクシン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT8018-250ML</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500G</td><td>アメリカ化学会 (ACS) グレードの</td></tr><tr><td>脱色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>E. coli host (E. coli BL21)</td><td>Novagen</td><td>69450-3</td><td>Protein expression host</td></tr><tr><td>F12 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>Cell Culture Grade Flow cytometer</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>651154</td><td>研究用途向けの細胞解析グレード&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td>細胞培養に適した</td></tr><tr><td>正常ヒト血清(NHS)</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>NHS</td><td>Pooled human serum</td></tr><tr><td>FITC-conjugated donkey anti-sheep anti-diesbodies&nbsp;</td><td>AbD セロテック</td><td>STAR88F</td><td>ポリクローナル</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>細胞培養に適した</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>マリエンフェルド</td><td>640210</td><td></td></tr><tr><td>HRP標識抗Hisタグ抗体</td><td>アブカム</td><td>ab1269</td><td>ポリクローナル</td></tr><tr><td>ヒト因子H</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A137</td><td></td></tr><tr><td>C4BP</td><td>Complement Technology, Inc.</td> から冷凍液体として購入<td>A109</td><td>凍結溶液</td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1653-10G</td><td>凍結乾燥粉末</td></tr><tr><td>ヒスチジンアフィニティー樹脂カラム (HisTrap HP)</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>17-5247-01</td><td>Ni セファロー</td></tr>ス <tr><td>His-タグ付きPH</td><td></td><td></td>を充填したカラム 当社の<td>研究室で再組換え発現および精製された</td></tr>ヨ<tr><td>ウ素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT902-8FOZ</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>VWR</td><td>BDH1135-1LP</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>&nbsp;顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX73</td><td>倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>プレーン、サイズ 25 mm &times; 75 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-1KG</td><td></td></tr><tr><td>バックボーンに C 末端 6x His-tag を含む プラスミド (pET26(b))</td><td>Novagen</td><td>69862-3</td><td>DNA vector</td></tr><tr><td>Polysorb microtitre plates&nbsp;</td><td>ELISA</td>水酸化カリウム(KOH)用<td>シグマ-アルドリッチ</td><td>M9410</td></tr>シ<tr><td></td><td>グマ-アルドリッチ</td><td>6009</td><td>アメリカ化学会(ACS)グレード</td></tr><tr><td>羊抗ヒトVn抗体</td><td>AbDセロテック</td><td>AHP396</td><td>ポリクローナル</td></tr><tr><td>シェーカー&nbsp;</td><td>Stuart Scientific</td><td>STR6</td><td>プラットフォームシェーカー</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ</td><td>BD Falcon</td><td>3175167</td><td>75 cm2</sup</td></tr><tr><td>>&nbsp;サーモミキサー&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3317</td><td>ドライバック加熱および冷却シェーカー</td></tr><tr><td>テトラメチルベンジジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860336-100MG</td><td>ELISAグレード</td></tr><tr><td>ヒト血漿からのビトロネクチン(Vn)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V8379-50UG</td><td>細胞培養グレード</td></tr></tbody></table>

細菌の付着と血清抵抗性ビトロネクチンの役割を研究するための試金

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

細菌はホストの免疫反応を回避するための手段として補完するレギュレータを利用します。ここでは、ホストの免疫抵抗性の細菌の細胞の表面の再生の役割ビトロネクチン獲得を評価するためのプロトコルについて述べる。流れの cytometry の実験は、ヘモフィルスタイプ f の受容器の細菌外膜蛋白 H のリガンドとしてひと血漿ビトロネクチンを識別されます。酵素抗体法を用いて精製組換え蛋白質 H とビトロネクチン、蛋白質蛋白質の相互作用を特徴付けるし、バイオ層干渉法を用いて評価した結合親和性。正常およびビトロネクチン枯渇のひと血清で血清抵抗試金を使用してホストの免疫の回避の細菌の細胞表面タンパク質 H ビトロネクチンのバインディングの生物学的重要性を確認した.グラム染色に続いてビトロネクチン コーティングなしとスライド ガラスを使って細菌付着におけるビトロネクチンの重要性を調べた。最後に、ヒトの肺胞上皮細胞膜に細菌の付着を調べた。ここで説明されているプロトコルは興味の任意の細菌種の研究に容易に適応することができます。

細菌の表面に Vn バインディングは、フローサイトメトリーによって決定されました。すべて Hif 臨床分離株におけるテストは、細胞表面に Vn を採用しました。大腸菌陰性対照ひずみ (図 1A)、Vn 細胞表面との相互作用はみられませんでした。図 1Bに示すように、PH は表面 Hif 細胞の主要な Vn 結合蛋白質。WT Hif ひずみによるベトナムのバインド M10 シフトを引き起こしました、人口で一方 Hif M10Δlph Vn がバインドされないコントロールに同じような出現します。
PH と Vn の蛋白質蛋白質の相互作用は、elisa 法とバリで推定されました。人的要因 H、Vn、C4BP とバインドする許された組換え ...

このレポートでは、細菌の外膜タンパク質とひと補体レギュレータ ビトロネクチンの相互作用を特徴付けるためのプロトコルについて説明します。この結合反応およびビトロネクチン値の任意の細菌種の生物学的機能を研究するプロトコルを使用できます。

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

この方法は、細菌病原体がヒトタンパク質を利用してヒトで病気を引き起こす方法など、宿主と病原体の相互作用分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、任意の病原体が宿主の感染を確立するためにビトロネクチンを利用できる場合に答えることができる。細胞外マトリックスに関与する宿主タンパク質であるビトロネクチンに焦点を当てるが、補体活性化の決定経路において補体阻害剤としても機能する。これらの事実は、ヒトの病気を引き起こす病原体にとって非常に重要であり、非常に魅力的です。フローサイトメトリーの準備のために、250ナノモルビトロネクチンを含むブロッキングバッファーの50マイクロリットルで細菌ペレットを再懸濁します。次いで、試料を振らず室温で1時間インキュベートする。インキュベーション後、3,500gで5分間の遠心分離により細菌をペレット化した。次いで、PBSおよび同様の遠心分離工程を用いてペレットを3回洗浄する。洗浄後、PBS BSAで1〜100希釈で細菌ペレットに50マイクロリットルの原生羊抗ヒトビトロネクチンポリクローナル抗体を加える。懸濁液を室温で1時間インキュベートする。次いで、PBSで細菌を3回洗浄し、非結合抗体を除去する。次に、フルオレセインイソチオシアネート結合ロバ抗羊ポリクローナル抗体をペレットに含むPBS BSAの50マイクロリットルを添加する。暗闇の中で1時間室温でインキュベートする。最後に、3回の洗浄工程の後、細菌ペレットを300マイクロリットルのPBSで再懸濁し、フローサイトメトリーで分析する。ELISAの準備のために、ポリソープマイクロテイタープレートの各ウェルにタンパク質溶液の100マイクロリットルを分配します。蓋でプレートを閉じ、マイクロタイタープレートウェルにタンパク質を固定化するために一晩摂氏4度で保管します。シンクの上に逆さまに傾けることによってマイクロティタープレートから溶液を捨てます。その後、井戸あたり300マイクロリットルのPBSで3回井戸を洗います。2.5重量%BSAを含むPBSで室温で1時間コーティングされた井戸をブロックします。ブロッキング溶液を取り除いた後、井戸あたり300マイクロリットルのPBSTでウェルを3回洗います。次に、10マイクロリットルの50ナノモル組換えPHを各サンプルに加えます。コントロールウェルには、PBS BSAの100マイクロリットルのみを追加します。プレートを室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、タンパク質溶液を廃棄し、ウェルあたり300マイクロリットルのPBSTでウェルを3回洗浄することによって結合していないタンパク質を除去する。次いで、抗ヒスポリクローナル抗体をコンジュゲートした馬根ペルオキシダーゼを含有するPBS BSAの100マイクロリットルを添加する。室温で1時間インキュベートした後、井戸あたり300マイクロリットルのPBSTでウェルを3回洗います。各ウェルに100マイクロリットルのELISA検出試薬を添加して抗原抗体複合体を検出します。次いで、反応を停止するためにウェルあたり1モル硫酸の50マイクロリットルを加える。マイクロプレートリーダーを使用して、450ナノメートルでウェルの光学密度を測定します。メーカーのガイドラインに従ってアミンカップリング法を使用して、アミン反応性センサーにヒトビトロネクチンを固定化します。PBSを使用して、組換えPHリガンドをゼロから4マイクロモルに連続して希釈し、得られた溶液を96ウェルブラックフラットボトムマイクロタイタープレートに移します。バイオ層干渉計装置を使用して、30°Cで実験を実行します。ピペット10マイクログラムの1ミリリットル/2マイクログラムのPBSで、ガラス顕微鏡スライド上に1滴としてスライドする。スライドの下に、室温で30分間乾燥させます。タンパク質コーティングされたガラススライドをPBSを含むビーカーに2秒間浸して3回洗浄し、過剰なコーティングされていないタンパク質を除去します。次に、新鮮なヒフ文化の10ミリリットルを無菌プラスチックペトリ皿に加え、コーティングされたガラススライドを培養液に沈めます。20 RPMで振って1時間摂氏37度で調理します。インキュベーション後、テキストプロトコルに記載されているようにグラム染色によって結合細菌を可視化する前にPBSで満たされたビーカーにスライドを3回浸すことによって、任意の結合されていない細菌を除去する。テキストプロトコルに記載されているように培養A549上皮細胞。1回の洗浄と細胞のトリプシン化を摂氏37度で行った後、1ミリリットル当たり5マイクログラムのゲンタマイシンを含む完全な培地を用いて、細胞懸濁液を1ミリリットル当たり5,000細胞に希釈する。細菌感染の前に、ウェル内の培地をF12培地に交換し、摂氏37度で一晩インキュベートする。細胞単層を室温で1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。次に、氷の上にプレートを置き、ビトロネクチンの1ミリリットル当たり10マイクログラムを含む予冷F12培地の200マイクロリットルを置きます。プレートを摂氏4度で1時間インキュベートした後、ピペット処理して溶液を捨て、室温で1ミリリットルのPBSで細胞層を2回洗浄します。各井戸にF12培地で成長したばかりのヒフ野生タイプの100マイクロリットルを追加します。プレートを摂氏37度で2時間インキュベートします。次いで、培地をピペットで吸引し、PbsでA549上皮細胞を3回洗浄する。細胞剥離液の井戸あたり50マイクロリットルを加え、摂氏37度で5分間のインキュベーションに従ってください。次に、F12完全培地を50マイクロリットルの完全な培地に加えて酵素反応を停止します。上皮細胞を各ウェルから4個のガラスビーズを含む6ミリリットルのガラスチューブに移します。室温で細胞を2分間渦を起分させる。細胞ライセートを100倍に希釈した後、10マイクロリットルの希釈したサンプルをチョコレート寒天板にプレートする。摂氏37度で一晩のインキュベーションに続いてコロニーを数えます。ヒト血清の殺菌活性に対するビトロネクチン依存性の解析を行うために、第一の培養およびペレットの細菌をテキストプロトコルに記載した。遠心分離後、デキストロースゼラチン-ベロナルバッファーの1つの体積で細菌ペレットを再懸濁します。次に、1,500 CFUの細菌をDGVBプラス5%血清を含む100マイクロリットルに加えます。300 RPMで振って15分間摂氏37度でサンプルをインキュベートします。反応混合物から10マイクロリットルのアリコートをゼロ分および15分で取り出す。チョコレート寒天にアリコートを置き、一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。チョコレート寒天プレートのインキュベーション後、プレートに現れるコロニーを数え、テキストプロトコルに記載されているように殺された細菌の割合を計算する。この研究で試験されたすべてのHif臨床分離株は、フローサイトメトリーによって決定されるように細胞表面にビトロネクチンを募集した。野生型ヒフ株によるビトロネクチンの結合は集団のシフトを引き起こしたのに対し、変異体はビトロネクチンを結合しなかった。主要なビトロネクチン結合タンパク質PHとビトロネクチンとのタンパク質相互作用は、ELISAによって推定された。結果は、PHとビトロネクチンの両方と陰性対照に対する陽性対照との間の有意な相互作用を示す。PHとビトロネクチンの相互作用は、バイオ層干渉法を用いてリアルタイムで2.2マイクロモルの親和性を有すると推定された。さらに、細胞表面上のPHの発現不足の細菌は、野生型細胞と比較してビトロネクチン被覆ガラス表面への付着性を低下させた。さらに、上皮細胞の表面にビトロネクチンが存在すると、Hifの付着が著しく高まりました。ビトロネクチンの補体阻害活性を推定するために、血清媒介性殺死を検討した。野生型Hif細胞は変異細胞よりも高い血清抵抗性を示した。熱不活化血清の存在下で細菌は殺されなかった。興味深いことに、野生型ヒフはビトロネクチン枯渇血清中の生存率の低下を示し、ビトロネクチンの補充は細菌生存率を増加させた。しかし、変異株はビトロネクチンを細胞表面にリクルートできなかったため、ビトロネクチンの枯渇に反応しなかった。一度習得, この技術は、任意の病原体のために3〜4日で行うことができますし、細菌病原体の新鮮な培養を使用することを忘れないでください.このビデオを見た後, 病原体に結合ビトロネクチンを分析する方法についてよく理解している必要があります。.この技術に加えて、ビトロネクチン結合表面タンパク質の細菌は、プロテオミクスおよびウェスタンブロッティングを用いて同定することができる。この技術は、宿主と病原体の相互作用の分野の研究者にとって重要であり、また細菌の病原性のメカニズムを探求する。

assays-for-studying-role-vitronectin-bacterial-adhesion-serum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このプロトコルは、培養細胞に付着している細菌のコロニー形成単位の数を数えるに構成された単純な細菌の接着アッセイです。アッセイは堅牢であり、アドヘシンの独立は学び、数多くのバリエーションが細菌性病因に取り組む多くのラボで使用されています。...

哺乳類上皮細胞上に細菌付着のインビトロアッセイ

このビデオでは、固定化された最初のタンパク質への2番目のタンパク質の結合を測定することにより、2つのタンパク質間のタンパク質間相互作用を検出するELISAベースの技術について説明しています。結合した第2のタンパク質は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素で標識された特異的抗体を使用して検出されます。...

ELISAを用いたベイトタンパク質とプレイタンパク質の相互作用解析法

このビデオでは、宿主上皮細胞へのインフルエンザ菌の付着におけるビトロネクチンの役割を研究するためのアッセイを実演します。...

宿主上皮細胞への細菌付着におけるビトロネクチンの役割を研究するためのアッセイ

このビデオは、ヒトの血清糖タンパク質であるビトロネクチンが細菌耐性に果たす役割を示しています。血清中の抗体は、細菌の表面タンパク質と相互作用し、補体タンパク質を活性化して膜攻撃複合体を形成し、細菌細胞の溶解を引き起こします。細菌の膜タンパク質に結合するビトロネクチンは、膜攻撃複合体の形成を防ぎ、細菌の生存をもたらします。...

ヒト血清の殺菌活性に対する細菌耐性におけるビトロネクチンの役割の決定

このビデオでは、蛍光顕微鏡を使用してがん細胞の好中球細胞外トラップ(NET)への付着を検出するアッセイを実演しています。試験ウェルでは、NETsに付着する蛍光標識がん細胞の数が顕著に増加していますが、DNaseで処理されたウェルでは、NETsへのがん細胞の接着が減少しています。...

がん細胞の好中球細胞外トラップへの付着を検出するためのin vitro接着アッセイ

このビデオは、ビトロネクチンと細菌表面タンパク質との相互作用の検出を示しています。フローサイトメトリー解析では、ビトロネクチンに結合した蛍光標識抗体の蛍光シグナルを測定し、細菌表面での存在を確認します。この手法は、宿主と病原体の相互作用と潜在的な細菌感染治療に関する洞察を提供します。...

フローサイトメトリーを用いた細菌表面へのビトロネクチン結合の検出

感染部位における活性化内皮への好中球の順守は、ホストの炎症反応に不可欠なコンポーネントです。を可能にした好中球結合アッセイは、この報告書に記載...

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

せん断応力下での細菌と血管との相互作用を研究するために、血管接着に寄与する細菌と宿主因子を解剖することを可能にするフローチャンバーとin vivo腸間膜生体内顕微鏡モデルが説明されています。...

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

宿主細胞への細菌の付着は、宿主のコロニー形成と感染の間の重要なステップです。このプロトコルは、ポリマー共役組換えアドヘシンの生成を生体模倣材料として説明し、他の細菌要因とは無関係に、これらのプロセスへの個々のアドヘシンの寄与の分析を可能にします。...

細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

ウイルス感染HeLa細胞単層への付着に対する王国間の関連性と競争(細菌および真菌)を決定するための方法がここに記載されています。このプロトコルは、原核生物、真核生物、およびウイルスの複数の組み合わせに拡張できます。...

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

RGD官能基化されたアビジン-ビオチンテザーを使用して、密度を調整可能な単一の移動血小板をイメージングするための詳細なプロトコルが提供されており、血小板がアビジン-ビオチン結合を破裂するのに十分な力を生成することが明らかになりました。...

RGD官能化アビジン-ビオチンテザーを用いた血小板遊走を研究するためのIn vitroアッセイ

学ぶ細菌とビトロネクチンの相互作用解析法。フローサイトメトリーとELISAを用いて、病原体がヒトタンパク質を利用して感染を確立するメカニズムを解明し、宿主病原体相互作用の理解と新規治療戦略開発に貢献します。

細菌の付着と血清抵抗性ビトロネクチンの役割を研究するための試金

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