Name: 肝臓における大腸転移の高度な動物モデル：イメージング技術および転移性クローンのプロパティ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 学ぶ大腸がんの肝転移動物モデル。二重標識単一細胞株を用いて転移クローンの異質性を可視化し、オリゴ転移とポリ転移関連遺伝子を検出する手法です。転移性疾患の診断と治療改善に貢献します。

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我々はLuc2-tdTomatoプラスミドおよびHCT116細胞株、支援のための氏アニSolanki（動物資源センター）マウス管理のための、および博士ララレオニ博士ジェフリーL.グリーン（シカゴ大学）を感謝したいと思いますDLITと。蛍光および発光強度の定量化は、IVISスペクトラム上のシカゴ大学（パーキンエルマー、ホプキントン、MA）に統合された小動物イメージング研究リソースで行いました。この作品は、がん研究のためのバージニアとDKルートヴィヒ・ファンド、肺癌研究財団（LCRF）、前立腺癌基金（PCF）、およびがんセンターサポート助成金（P30CA014599）によってサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていません。

<ol><li>Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+score+for+predicting+recurrence+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+analysis+of+1001+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases.</a> Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).</li>
<li>Pawlik, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surgical+margin+status+on+survival+and+site+of+recurrence+after+hepatic+resection+for+colorectal+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases.</a> Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).</li>
<li>Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+Cancer%2C+Systemic+Inflammation%2C+and+Outcome%3A+Staging+the+Tumor+and+Staging+the+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host.</a> Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).</li>
<li>Veen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Follow-Up+and+Survivorship+After+Completing+Systematic+Surveillance+in+Stage+I-III+Colorectal+Cancer%3A+Who+Is+Still+at+Risk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastrointest.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk.</a> J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).</li>
<li>Siegel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+treatment+and+survivorship+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer treatment and survivorship statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).</li>
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<li>House, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+trends+in+outcomes+for+1%2C600+patients+during+two+decades+at+a+single+institution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Surg%22%5BJournal%5D)">Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution.</a> J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).</li>
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<li>Rajendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+bioluminescent+hepatic+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine bioluminescent hepatic tumour model.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Oshima, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+tumor+clones+with+differential+liver+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging of tumor clones with differential liver colonization.</a> Sci. Rep. 5 (10946), (2015).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Wang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analyses+identify+osteopontin%2C+LAMB3+and+ITGB1+as+critical+pro-metastatic+genes+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer.</a> PLoS One. 8 (2), e55714(2013).</li>
<li>Fidler, I. J., Kripke, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+results+from+preexisting+variant+cells+within+a+malignant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor.</a> Science. 197 (4306), 893-895 (1977).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Khodarev, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1+pathway+mediates+amplification+of+metastatic+potential+and+resistance+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy.</a> PLoS One. 4 (6), e5821(2009).</li>
<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-organ+microenvironment+interactions+in+the+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis.</a> Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligo-+and+polymetastatic+progression+in+lung+metastasis%28es%29+patients+is+associated+with+specific+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs.</a> PLoS One. 7 (12), e50141(2012).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+characterizes+oligometastasis%28es%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es).</a> PLoS One. 6 (12), e28650(2011).</li>
<li>Calon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+colorectal+cancer+on+a+TGF-beta-driven+program+in+stromal+cells+for+metastasis+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation.</a> Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).</li>
<li>Vanharanta, S., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+metastatic+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of metastatic traits.</a> Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).</li>
<li>Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways%3A+Interferon%2FStat1+Pathway%3A+Role+in+the+tumor+resistance+to+genotoxic+stress+and+aggressive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth.</a> Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-stimulated+gene+15+%28ISG15%29+is+a+trigger+for+tumorigenesis+and+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> J. Vis. Exp. (27), e51677(2014).</li>
<li>Evans, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mice+to+men%3A+Murine+models+of+colorectal+cancer+for+use+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

現在のレポートに表示される動物モデルは、二つの主要なアプローチに基づいています。まず、コロニーを形成し、肝臓で増殖するために、異なる傾向と転移性クローンを観察する能力を確保するために、非常に不均一なモノクローナル細胞株のパネルは、むしろ確立未分画の癌細胞株12,13よりも、設立されました。転移の開発に対するモノクローナルアプローチは、最近のゲノム・データ14によって正当化され、正常に転移プロセスの10,15,16をモデル化するために以前に使用されました。第二に、ルシフェラーゼおよびtdTomatoマーカーによって親細胞株の二重標識は、 インビボおよびエキソビボの両方の転移性増殖の増強分析を提供するために設立されました。発光および蛍光標識は、詳細な解剖学的検査および（肝臓colonizatioの周波数または有効性として考え転移性腫瘍の量の両方の潜在的な定量を可能にしますn）と、任意の個々のコロニーの大きさ。後者は、容易に工程2に記載の単純な較正手順を使用して細胞の実際の数に変換され、2 10</...

原発性結腸直腸癌（CRC）から肝転移を有する患者は予後不良によって特徴づけられます。 12％の5 -肝転移（IV期）の患者は、わずか8の5年生存率を有するが、88％の3,4 -一次非転移性CRCの5年生存率（ステージは、I - III）75と推定されています、6。しかし、転移性の患者は、転移と異なる再発時間の異なる数を呈する、異種の基を表します。臨床観察は、と（地元の成長率に比例する）任意の単一の転移のサイズ（コロニー形成能力や定着の周波数に比例してもよい）、転移の数が独立した予後因子1,7であることを示しています。言い換えれば、肝臓をコロニー形成、転移性クローンの成功は、2つの主要な特性に依存する：増殖能と肝微小環境に普及し、生き残るために能力を。 デザイン転移性クローンの特性を捕捉し、定量化する能力を持つ成功した臨床モデルで大幅に肝転移生物学の我々の理解を改善し、潜在的な治療アプローチの設計のための効果的なツールを提供することができます。実験的肝転移のモデルは、以前に8,9を報告されているが、それらのいずれも定量的に捉えるおよびin vivoおよびex vivo の両方で個々の転移性クローンのプロパティを記述するための機能を提供しました。 ここでは、異なる肝臓のコロニー形成効率と成長特性を有する腫瘍クローンの生成を含んで肝転移の新しい、先進的なモデルを提示します。我々は、転移能力の本質的な相違を有するモノクローナル細胞株の生成でルシフェラーゼおよびtdTomato蛍光タンパク質で癌細胞の二重標識の組み合わせを用います。この実験モデルでは、データは、開発することを示します肝転移は、コロニー形成頻度の条件および臨床観察と一致する倍加時間（TD）で記述することができます。このモデルの定量的性質は、創薬や診断目的のために、それは容易に採用可能になります。

<table><tbody><tr><td>IVIS Spectrum In Vivoイメージングシステム</td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td>124262</td><td>In Vivoイメージングシステム</td></tr><tr><td>LivingImage 4.0ソフトウェア</td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td>128165</td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>VAD-MGX 研究用麻酔器</td><td>Vetamac</td><td>VAD-MGX</td><td>吸入麻酔器</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>細胞培養試薬</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>細胞培養試薬</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン、液体(10,000ユニットペニシリン;10,000 &MU;g streptomycin)</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>細胞培養試薬</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>24020117</td><td>細胞培養試薬</td></tr><tr><td>Buprenex Injection (0.3 mg/mL)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>ブプレノルフィン塩酸塩</td></tr><tr><td>Gemini Cautery System</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>脾臓摘出術用ハンドヘルド焼灼</td></tr><tr><td>マイクロクリップ;直;70グラムの圧力;クリップ幅1.5mm;顎の長さ10mm</td><td>ロボズ 手術器具</td><td>RS-5426</td><td>ヘモクリップ脾臓注射後の止血器具</td></tr><tr><td>D-ルシフェリン、カリウム塩</td><td>ゴールドバイオ技術</td><td>LUCK-1G</td><td>ルシフェリン カリウム塩</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 減量血清培地</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>減量血清培地</td></tr><tr><td>TC20 自動セルカウンター</td><td>BIO-RAD</td><td>1450102</td><td>自動セルカウンター</td></tr><tr><td>JMP10ソフトウェア&nbsp;</td><td>SASインスティテュート</td><td></td><td>データ解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>BD FACSAria II セルソーター</td><td>BD Biocsiences</td><td></td><td>セルソーター</td></tr></tbody></table>

肝臓における大腸転移の高度な動物モデル：イメージング技術および転移性クローンのプロパティ

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

肝転移および進行の遅い速度の限られた数の患者が正常局所治療で治療することができる1,2に近づきます。しかし、ほとんどは、肝転移の不均一性については知られており、個々の転移性コロニーの発達を評価することが可能な動物モデルが必要です。ここでは、定量的に肝臓内の個々の腫瘍クローンの開発を可視化し、それらの増殖速度と植民地化効率を推定する機能を提供し肝転移の高度なモデルを提示します。我々は安定してルシフェラーゼおよびtdTomatoと異なる成長特性を有するで標識したHCT116ヒト結腸直腸癌細胞のモノクローナル誘導体のパネルを生成しました。脾臓摘出に続いて脾臓注射で、これらのクローンの大部分は肝転移を生成することができますが、植民地化の異なる周波数及び様々な成長率を持ちます。 in vivoイメージングのSysteを使用して、M（IVIS）は、in vivoでの発光を用いて、転移の発達を可視化し、定量化することが可能であり、ex vivoでの蛍光イメージング。また、拡散発光イメージング断層撮影（DLIT）は、in vivoでの肝転移の3D分布を提供しています。収穫肝臓のex vivo蛍光イメージングは、肝臓のコロニー形成の頻度の評価と成長動力学を考慮して、個々の肝転移コロニーの定量的測定を提供します転移の。モデルは、臨床的に観察された肝転移と同様であるので、肝転移に関連する遺伝子を検出するための、肝臓の転移性疾患のための潜在的な切除またはアジュバント治療を試験するための様式としての役割を果たすことができます。

この実験の目的は、in vivoでの転移性腫瘍負荷のシリアル定量化のためと肝転移を開発するのコロニー形成頻度と成長速度の推定のための潜在的と一致し、容易に再現可能な動物モデルを確立することであった。、2-6フィギュア伝説で、クリエイティブ・コモンズのCC-BYライセンスの10の下で私たちの以前の出版物から提供されています。 二重標識された腫瘍細胞の単クローンの生成まず、発光および蛍光標識されたモノクローナル細胞株のパネルは、異なる転移能力を用いて生成しました。親HCT116結腸直腸癌細胞で成功した発光のトランスフェクション（Luc2）と蛍光（tdTomato）タンパク質に続いて、16二重標識モノクローンは、親HCT1を希釈することによって生成されました1細胞/ 96...

転移性クローンが遠く離れた場所にコロニーを形成する能力は、その増殖能力および/または大きな増殖なしに宿主の微小環境で生き残る能力に依存します。ここでは、転移性クローンによる両方のタイプの肝臓コロニー形成を定量的に可視化できる動物モデルを紹介します。

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

このアプローチの全体的な目的は、大腸がんから生じた転移性腫瘍クローンによる肝臓への定着をモデル化し、このモデルを用いて肝転移の診断と治療を向上させることです。臨床的な観察結果は、転移性疾患の不均一性を示しています。本モデルでは、この不均一性を捉えることで、少数の転移（oligometastatic）および多数の転移（polymetastatic）を伴う疾患に関連する遺伝子を検出することが可能です。そして、この知見を転移の早期発見と治療の向上に役立てることです。本手法の主な利点は、大腸がん患者由来の二重標識モノクローナル細胞株を用いることで、肝転移の進展をin vivoおよびex vivoの両方で観察できる点にあります。本手法の意義は、転移性疾患の治療法への応用へと広がります。これにより、転移病変の数と各病変の増殖キネティクスの定量的評価を用いて、あらゆる潜在的な薬剤を試験することが可能になります。テキストプロトコルに従って、ルシフェラーゼおよびtdTomatoで標識したHCT116細胞を生成し、培地、試薬、および器具を準備した後、トランスフェクションした細胞を96ウェルプレートに、1ウェルあたり以下の密度で3連（triplicate）で播種します。細胞を5時間インキュベートした後、デスクトップでイメージングソフトウェアを起動し、IVISシステムを用いてtdTomatoの蛍光強度を定量します。「Initialize」ボタンをクリックして、撮影時間、メディアビニング、F値に2、励起フィルターに535、蛍光フィルターに580を初期設定します。96ウェルプレートをイメージングステーションに設置し、「Acquire」をクリックして撮影を開始します。画像取得後、ツールパレットの「ROI tools」をクリックし、スリットアイコンから「12x8」を選択します。96ウェルプレートの画像上のシグナル領域をカバーするように12x8のスリットを作成し、「Measurements」タブをクリックします。1秒間あたり、1ステラジアンあたり、1平方センチメートルあたりの光子数という単位でROI測定値のテーブルが表示されるウィンドウを確認します。細胞が70〜80%のコンフルエンシーに達したら、脾臓への注入の約1時間前に、0.05%トリプシンと0.53 mM EDTAを細胞に加えて解離させます。細胞を3〜5分間インキュベートした後、等量のC-DMEMを用いてトリプシンを中和します。凝集を防ぐため、培養液を十分にピペッティングし、自動細胞計数装置を使用して細胞数をカウントします。懸濁した細胞を1x DBPS中で100 µLあたり1.2〜2 × 10⁶ cellsの濃度で凍結させます。その際、凝集を避けるため十分にピペッティングしてください。その後、注入まで細胞を氷上に保持し、時々チューブ内で再懸濁させます。テキストのプロトコルに従って、6〜8週齢の雌の無胸腺ヌードマウスに鎮痛剤を投与し、麻酔をかけた後、左側腹部の皮膚越しに外部から紫色の領域として確認できる脾臓を特定し、臓器の直上の皮膚に8 mmの左側腹部切開を加えます。次に、腹壁を持ち上げ、小さな切開を加えます。腹腔内に空気を送り込み、内臓を切開部位から遠ざけます。次に、腹壁の切開口を約5 mmまで広げます。ここで実演する注入の手順は、本処置において極めて重要です。注入時に腫瘍細胞が漏出すると、肝外転移を引き起こす可能性があります。門脈血栓症を防ぐため、注入は150万個以下の細胞を用い、30〜60秒かけてゆっくりと行ってください。綿棒で切開部の周囲を軽く圧迫し、脾臓を露出させます。必要に応じて、脾臓を損傷させないように膵臓の脂肪を慎重に操作して術野を確保します。27ゲージの針を装着した1 mLシリンジを用い、30〜60秒かけて、露出した脾臓の先端に100 µLの細胞を注入します。注入終了後、注入した細胞懸濁液の漏出を防ぐため、針を抜く前に脾臓にマイクロクリップを装着し、5分間そのままにします。注入5分後、手持ちの電気焼灼器を使用して、止血のために脾臓摘出術を行います。まず、脾門の前側から、血管の近位側を隣接する脂肪組織とともに予備凝固させます。注入部位から脾出血が起こる可能性があります。腫瘍細胞の漏出を防ぎ、脾臓からの出血を制御するために、脾臓にマイクロクリップを装着します。止血方法には、電気凝固、3〜5分間の圧迫止血、および必要に応じた縫合結紮が含まれます。5.0吸収性編み糸を用い、水平単結節縫合で腹壁を閉鎖します。次に、4.0の非吸収性モノフィラメント縫合糸を使用し、同様に単一の水平縫合で皮膚を閉鎖します。テキストプロトコルに従って、術後の動物を観察します。生物発光イメージングを行うには、テキストプロトコルに従ってマウスを麻酔した後、あらかじめ調製したホタルルシフェリン150 microlitersを動物に腹腔内投与します。マウスをIVISに仰臥位で配置し、隣接するマウスへの信号干渉を最小限に抑えるために動物の間にスペーサーを置きます。ルシフェリン注入の3分後、IVISを起動し、「luminescent（発光）」、露光時間「1 second」、「medium binning」を選択します。「Acquire」ボタンをクリックしてイメージングを開始し、必ずルシフェリン注入から3分後にイメージングが行われるようにしてください。画像の取得が完了し、イメージウィンドウとツールパレットが表示されたら、「ROI tools」をクリックし、撮影したマウスの数に合わせて、円形アイコンから1から5の数字を選択します。ROIを定義するには、マウスの腹腔内にあるルミネッセンス信号の信号領域を円で囲み、ROIの測定値として放射輝度の任意単位をクリックします。また、バックグラウンド用に別途ROIの円を追加してください。注入から4週間後、拡散ルミネッセンスイメージングトモグラフィー（DLIT）を実施するため、IVISを起動し、Imaging WizardからBioluminescenceを選択してNextをクリックします。DLITを選択し、Nextをクリックします。Firefly Probesを選択し、Nextをクリックします。Image SubjectにMouseを、Exposure ParameterにAutoを、Field of ViewにC-13 Centimeterを、Subject Typeに0.5 Centimeterを選択し、Nextをクリックします。次に、Acquireボタンをクリックしてイメージングを開始します。画像を撮影した後、Analyzeタブ内のDLIT 3D Reconstructionタブを選択し、Reconstructをクリックして3D再構成画像を生成します。「ツール」および「3Dアニメーション」をクリックします。次に、3Dアニメーションウィンドウで「Y軸を中心に反時計回りに回転」を選択します。「録画」および「保存」をクリックし、ファイルをmov形式で保存します。ex vivo蛍光イメージングを行うには、テキストプロトコルに従ってマウスから肝臓を採取し、解剖した後、IVISを用いて各腫瘍コロニーの蛍光強度を測定します。Fluorescence（蛍光）を選択し、Exposure Time（露光時間）を4秒、Binning（ビニング）をMedium、F/Stopを2、励起フィルターを535、蛍光フィルターを580に設定します。Acquireボタンをクリックしてイメージングを開始します。画像を取得後、ツールパレットにある画像ウィンドウを確認します。「ROI Tools」をクリックし、円形アイコンから「1」を選択します。ROIを設定するには、画像上の個々の腫瘍コロニーのシグナル領域を円で囲みます。背景の関心領域（ROI）の円を追加で取得し、「ROIの測定値」をクリックして輝度の任意単位として取得します。背景のROIの円をさらに追加で取得します。最後に、テキストプロトコルに従って計算を行います。ここでの生物発光によって示されているように、脾臓注射の3週間後、HCT116 L2TクローンのP1およびP2は、クローンO1およびO2と比較して、腫瘍負担がより大きくなっていました。これらのデータは、クローンO1およびO2が寡量転移性疾患を模倣できる一方で、P1およびP2は肝臓への侵襲的な広範な転移性定着を表していることを示しています。脾臓注射から4週間後の肝臓のex vivo蛍光定量により、P1およびP2の肝臓はO1およびO2の肝臓と比較して高い蛍光強度を持つことが確認されました。腫瘍クローンの蛍光標識により、肝臓における個々の転移コロニーの数と大きさが特定されました。全体として、ex vivoでの蛍光画像は肉眼的な所見と一致していましたが、表面下に隠れた小さなコロニーは蛍光イメージングの方がより良好に検出されました。ここで示すように、各肝臓における転移コロニーの数とサイズを計数および測定し、各モノクローンごとに各転移コロニーのex vivo蛍光イメージングを行いました。これらのグラフに示されているように、転移の総数はP1がP2、O1、O2と比較して多かった一方、個々のコロニーの平均サイズはP2がP1、O1、O2よりも大きくなっていました。本モデルは、転移の分子的な不均一性に関連する新たな説得遺伝子（persuasion genes）を特定するためのアプローチを提供するものです。これらの遺伝子は、転移治療への新たなアプローチの標的として利用可能です。また、本モデルは、現在の大規模な臨床データベースから得られているものの、転移性疾患の文脈においてまだ機能的に定義されていない、さまざまなタンパク質コード遺伝子および非コード遺伝子の検証にも利用できます。一般的に、動物手術の繊細さから、この手法に不慣れな方は習得に苦労する可能性があります。しかしながら、習熟すれば短時間で良好な結果を得ることが可能です。本手順を行う際は、動物手術ガイドラインに従い、出血を慎重にコントロールし、腫瘍細胞懸濁液の漏出を防ぐことが重要です。

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Cancer Research

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