肝臓における大腸転移の高度な動物モデル：イメージング技術および転移性クローンのプロパティ

このアプローチの全体的な目的は、大腸がんから生じた転移性腫瘍クローンによる肝臓への定着をモデル化し、このモデルを用いて肝転移の診断と治療を向上させることです。臨床的な観察結果は、転移性疾患の不均一性を示しています。本モデルでは、この不均一性を捉えることで、少数の転移（oligometastatic）および多数の転移（polymetastatic）を伴う疾患に関連する遺伝子を検出することが可能です。

そして、この知見を転移の早期発見と治療の向上に役立てることです。本手法の主な利点は、大腸がん患者由来の二重標識モノクローナル細胞株を用いることで、肝転移の進展をin vivoおよびex vivoの両方で観察できる点にあります。本手法の意義は、転移性疾患の治療法への応用へと広がります。

これにより、転移病変の数と各病変の増殖キネティクスの定量的評価を用いて、あらゆる潜在的な薬剤を試験することが可能になります。テキストプロトコルに従って、ルシフェラーゼおよびtdTomatoで標識したHCT116細胞を生成し、培地、試薬、および器具を準備した後、トランスフェクションした細胞を96ウェルプレートに、1ウェルあたり以下の密度で3連（triplicate）で播種します。細胞を5時間インキュベートした後、デスクトップでイメージングソフトウェアを起動し、IVISシステムを用いてtdTomatoの蛍光強度を定量します。

「Initialize」ボタンをクリックして、撮影時間、メディアビニング、F値に2、励起フィルターに535、蛍光フィルターに580を初期設定します。96ウェルプレートをイメージングステーションに設置し、「Acquire」をクリックして撮影を開始します。画像取得後、ツールパレットの「ROI tools」をクリックし、スリットアイコンから「12x8」を選択します。

96ウェルプレートの画像上のシグナル領域をカバーするように12x8のスリットを作成し、「Measurements」タブをクリックします。1秒間あたり、1ステラジアンあたり、1平方センチメートルあたりの光子数という単位でROI測定値のテーブルが表示されるウィンドウを確認します。細胞が70〜80%のコンフルエンシーに達したら、脾臓への注入の約1時間前に、0.05%トリプシンと0.53 mM EDTAを細胞に加えて解離させます。

細胞を3〜5分間インキュベートした後、等量のC-DMEMを用いてトリプシンを中和します。凝集を防ぐため、培養液を十分にピペッティングし、自動細胞計数装置を使用して細胞数をカウントします。懸濁した細胞を1x DBPS中で100 µLあたり1.2〜2 × 10⁶ cellsの濃度で凍結させます。その際、凝集を避けるため十分にピペッティングしてください。

その後、注入まで細胞を氷上に保持し、時々チューブ内で再懸濁させます。テキストのプロトコルに従って、6〜8週齢の雌の無胸腺ヌードマウスに鎮痛剤を投与し、麻酔をかけた後、左側腹部の皮膚越しに外部から紫色の領域として確認できる脾臓を特定し、臓器の直上の皮膚に8 mmの左側腹部切開を加えます。次に、腹壁を持ち上げ、小さな切開を加えます。

腹腔内に空気を送り込み、内臓を切開部位から遠ざけます。次に、腹壁の切開口を約5 mmまで広げます。ここで実演する注入の手順は、本処置において極めて重要です。

注入時に腫瘍細胞が漏出すると、肝外転移を引き起こす可能性があります。門脈血栓症を防ぐため、注入は150万個以下の細胞を用い、30〜60秒かけてゆっくりと行ってください。綿棒で切開部の周囲を軽く圧迫し、脾臓を露出させます。

必要に応じて、脾臓を損傷させないように膵臓の脂肪を慎重に操作して術野を確保します。27ゲージの針を装着した1 mLシリンジを用い、30〜60秒かけて、露出した脾臓の先端に100 µLの細胞を注入します。注入終了後、注入した細胞懸濁液の漏出を防ぐため、針を抜く前に脾臓にマイクロクリップを装着し、5分間そのままにします。

注入5分後、手持ちの電気焼灼器を使用して、止血のために脾臓摘出術を行います。まず、脾門の前側から、血管の近位側を隣接する脂肪組織とともに予備凝固させます。注入部位から脾出血が起こる可能性があります。

腫瘍細胞の漏出を防ぎ、脾臓からの出血を制御するために、脾臓にマイクロクリップを装着します。止血方法には、電気凝固、3〜5分間の圧迫止血、および必要に応じた縫合結紮が含まれます。5.0吸収性編み糸を用い、水平単結節縫合で腹壁を閉鎖します。

次に、4.0の非吸収性モノフィラメント縫合糸を使用し、同様に単一の水平縫合で皮膚を閉鎖します。テキストプロトコルに従って、術後の動物を観察します。生物発光イメージングを行うには、テキストプロトコルに従ってマウスを麻酔した後、あらかじめ調製したホタルルシフェリン150 microlitersを動物に腹腔内投与します。

マウスをIVISに仰臥位で配置し、隣接するマウスへの信号干渉を最小限に抑えるために動物の間にスペーサーを置きます。ルシフェリン注入の3分後、IVISを起動し、「luminescent（発光）」、露光時間「1 second」、「medium binning」を選択します。「Acquire」ボタンをクリックしてイメージングを開始し、必ずルシフェリン注入から3分後にイメージングが行われるようにしてください。

画像の取得が完了し、イメージウィンドウとツールパレットが表示されたら、「ROI tools」をクリックし、撮影したマウスの数に合わせて、円形アイコンから1から5の数字を選択します。ROIを定義するには、マウスの腹腔内にあるルミネッセンス信号の信号領域を円で囲み、ROIの測定値として放射輝度の任意単位をクリックします。また、バックグラウンド用に別途ROIの円を追加してください。

注入から4週間後、拡散ルミネッセンスイメージングトモグラフィー（DLIT）を実施するため、IVISを起動し、Imaging WizardからBioluminescenceを選択してNextをクリックします。DLITを選択し、Nextをクリックします。Firefly Probesを選択し、Nextをクリックします。

Image SubjectにMouseを、Exposure ParameterにAutoを、Field of ViewにC-13 Centimeterを、Subject Typeに0.5 Centimeterを選択し、Nextをクリックします。次に、Acquireボタンをクリックしてイメージングを開始します。画像を撮影した後、Analyzeタブ内のDLIT 3D Reconstructionタブを選択し、Reconstructをクリックして3D再構成画像を生成します。

「ツール」および「3Dアニメーション」をクリックします。次に、3Dアニメーションウィンドウで「Y軸を中心に反時計回りに回転」を選択します。「録画」および「保存」をクリックし、ファイルをmov形式で保存します。

ex vivo蛍光イメージングを行うには、テキストプロトコルに従ってマウスから肝臓を採取し、解剖した後、IVISを用いて各腫瘍コロニーの蛍光強度を測定します。Fluorescence（蛍光）を選択し、Exposure Time（露光時間）を4秒、Binning（ビニング）をMedium、F/Stopを2、励起フィルターを535、蛍光フィルターを580に設定します。Acquireボタンをクリックしてイメージングを開始します。

画像を取得後、ツールパレットにある画像ウィンドウを確認します。「ROI Tools」をクリックし、円形アイコンから「1」を選択します。ROIを設定するには、画像上の個々の腫瘍コロニーのシグナル領域を円で囲みます。

背景の関心領域（ROI）の円を追加で取得し、「ROIの測定値」をクリックして輝度の任意単位として取得します。背景のROIの円をさらに追加で取得します。最後に、テキストプロトコルに従って計算を行います。

ここでの生物発光によって示されているように、脾臓注射の3週間後、HCT116 L2TクローンのP1およびP2は、クローンO1およびO2と比較して、腫瘍負担がより大きくなっていました。これらのデータは、クローンO1およびO2が寡量転移性疾患を模倣できる一方で、P1およびP2は肝臓への侵襲的な広範な転移性定着を表していることを示しています。脾臓注射から4週間後の肝臓のex vivo蛍光定量により、P1およびP2の肝臓はO1およびO2の肝臓と比較して高い蛍光強度を持つことが確認されました。腫瘍クローンの蛍光標識により、肝臓における個々の転移コロニーの数と大きさが特定されました。

全体として、ex vivoでの蛍光画像は肉眼的な所見と一致していましたが、表面下に隠れた小さなコロニーは蛍光イメージングの方がより良好に検出されました。ここで示すように、各肝臓における転移コロニーの数とサイズを計数および測定し、各モノクローンごとに各転移コロニーのex vivo蛍光イメージングを行いました。これらのグラフに示されているように、転移の総数はP1がP2、O1、O2と比較して多かった一方、個々のコロニーの平均サイズはP2がP1、O1、O2よりも大きくなっていました。本モデルは、転移の分子的な不均一性に関連する新たな説得遺伝子（persuasion genes）を特定するためのアプローチを提供するものです。

これらの遺伝子は、転移治療への新たなアプローチの標的として利用可能です。また、本モデルは、現在の大規模な臨床データベースから得られているものの、転移性疾患の文脈においてまだ機能的に定義されていない、さまざまなタンパク質コード遺伝子および非コード遺伝子の検証にも利用できます。一般的に、動物手術の繊細さから、この手法に不慣れな方は習得に苦労する可能性があります。

しかしながら、習熟すれば短時間で良好な結果を得ることが可能です。本手順を行う際は、動物手術ガイドラインに従い、出血を慎重にコントロールし、腫瘍細胞懸濁液の漏出を防ぐことが重要です。