ナノ粒子神経毒性を決定するために、代理バイオセンサーとしてミクログリア

このプロトコルの全体的な目標は、ナノ粒子に対するミクログリア応答を試験するためのin vitro代理バイオセンサーを記述することです。次に、ナノ粒子で刺激されたミクログリアから馴染みのある媒体に曝露した後の神経毒性を決定します。この方法は、神経毒性についてナノ粒子がどの程度積極的にスクリーニングされているかなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、私たちのモデルが、高価な長期のげっ歯類研究を使用せずに、ミクログリアを直接活性化し、分泌因子が神経毒であるかどうかを判断する能力を提供することです。しかし、この方法は、微粒子曝露後のミクログリア誘発性細胞死についての洞察を提供することができます。また、潜在的な神経毒性環境汚染物質の試験という文脈で、神経変性疾患の他のモデルにも適用できます。

一般に、この方法に不慣れな個人は、条件媒体のろ過ステップに苦労します。なぜなら、ナノ粒子の大きさや形状、濃度によってろ過効率が異なる場合があるからです。準備として、10%FBSと1%PSNを補給したDMEMを摂氏37度まで温めます。

次に、継代18 25から得られた凍結BV2ミクログリア細胞を取り、摂氏37度で急速に解凍します。次に、解凍した細胞を10ミリリットルの培地が入った75平方センチメートルの通気フラスコに静かに移し、フラスコをインキュベートします。24時間後に培地を交換し、70-80%の合流点に達するまで細胞を成長させ続けますこの時点で培地を吸引し、温かい1元トリプシンEDTA溶液の500マイクロリットルを追加します。

フラスコをさらに数分間インキュベートした後、スクレーパーを使用して細胞を5ミリリットルの温かいDMEMに集めます。次に、70ミクロンのストレーナーを使用してフラスコから細胞をろ過します。同じストレーナを使用してこのろ過を3回繰り返し、細胞を50ミリリットルのチューブに集めます。

ろ過したら、細胞をカウントし、200マイクロリットルのDMEMを補充したウェルあたり8000個の細胞を黒壁の透明な底板に播種します。24時間のインキュベーション後、ウェル内の培地を無血清DMEMと交換して、ミクログリアを飢餓状態にします。さらに24時間のインキュベーション後、ミクログリアの活性化に進みます。

これを行うには、まず、銀ナノ粒子を無血清DMEMで目的の使用濃度に希釈します。次に、100マイクロリットルの培地を治療用コンパウンドと交換します。ナノ粒子を含まない希釈ビヒクル溶液のネガティブコントロールを必ず含めてください。

次に、インキュベーションを24時間続けて、分析を進めます。まず、各プレートウェルから200マイクロリットルの上清培地を収集し、それをフィルターにロードして、マイクロ遠心チューブの上に置かれたナノ粒子を除去します。ナノ粒子をろ過する際には、そのサイズ、形状、濃度が融合効率の要因であることを覚えておくことが重要です。

したがって、事前にろ過をテストすることをお勧めします。次に、チューブを室温で14000gで15分間回転させます。次に、ナノ粒子を含むフロースルーを廃棄し、フィルターを逆さまにして新しい収集チューブに入れます。

フィルターを1000gで逆さまに2分間回転させ、サイトカインを含む濃縮馴化培地を収集します。次に、作りたての補助DMEMでコレクションの量を400マイクロリットルに増やし、チューブを氷上に保管します。濾過された媒体から残留硫黄ナノ粒子を確実に除去するには、無血清DMEMでブランクから0.2マイクログラム/ミリリットルまでの濃度の範囲で濾過されていないナノ粒子標準試料を調製します。

次に、ろ過したサンプルと各標準試料の50ミリリットルを黒壁の透明な底板に分注し、390〜410ナノメートルの吸光度を測定します。サンプル中のTNF-αの濃度を測定するには、市販のキットで残りの半分を使用します。このアッセイでは、凍結ストックから視床下部細胞を樹立します。

ミクログリア培養を確立するために説明したのと同じ方法を使用します。最終的には、それらを使用して、200マイクロリットルのDMEMを補充したウェルあたり5000個の細胞を黒壁の透明な底板に播種します。24時間の培養後、100マイクロリットルの培地を取り出し、活性化ミクログリア細胞培養物から採取した100マイクロリットルのろ過濃縮培地と交換し、標準条件下でプレートを24時間インキュベートします。

翌日、各ウェルに22マイクロリットルのレサズリン試薬を加え、20分間インキュベーションを続けます。次に、マルチモード分光光度計を使用して蛍光測定を行い、相対的な蛍光単位で細胞の生存率を推定します。概説されたプロトコルにより、ミクログリア機能は、ナノ粒子に対する脳の応答の代理バイオセンサーとして使用できます。

ミクログリアによるTNF-アルファの分泌は、スライバーナノ粒子への曝露後に有意に増加しました。視床下部ニューロンが銀ナノ粒子活性化ミクログリアからの馴化媒体に曝露されると、ニューロンの生存率は著しく低下した。原則として、銀ナノ粒子への曝露は、ミクログリアをM1炎症誘発性状態に活性化しました。

次に、放出された炎症誘発性サイトカインが周囲の細胞死に寄与します。このビデオを見れば、ナノ粒子に対する反応をテストするための代替バイオセンサーとしてミクログリアを使用する方法と、この応答が神経毒性であるかどうかについて十分に理解できるはずです。一度マスターすると、このテクニックは適切に実行されれば3〜4日で完了することができます。

この手順に続いて、ミクログリアの活性化状態を表現型化するために、ミクログリアの活性化後に他の分泌されたサイトカインをプロファイリングするなどの他の方法を実施することができる。