Name: フィールド条件の下で種子発芽、休眠、および死亡率を評価するための信頼性の高い方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学ぶ フィールド条件での種子発芽・休眠・死亡率評価法。ラベル付き種子ストリップとTZ試験を用いて、種子生態学における個体の貢献度を定量化し、土壌種子バンクの動態を解明する。

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この作業は、Biotech Risk Assessment Grant Programの競争的グランド番号2006-39454-17438によって、米国農務省国立食糧農業研究所のA.スノウ、K.マーサー、H.アレクサンダーに支援されました。この方法を使用した実験は、カンザス生物学調査とカンザス大学の研究ユニットであるカンザス大学フィールドステーションで実施され、支援を受けました。著者は、この原稿の以前のバージョンについて有益なレビューをしてくださったP. Jourdan氏とE. Regnier氏に感謝します。さらに、この作業は、カンザス大学フィールドステーション、オハイオ州立大学(OSU)のウォーターマンファーム、OSUのUSDA観賞用植物生殖質センター、およびOSUの園芸作物科学部の種子生物学研究室のスタッフ、特にE.レンツェ、S.スティーブ、A.エバンスの貢献によって支援されました。 E. Grassbaugh は、技術サポートを担当しています。

1.複数の種または単一の種の制御された交雑から種子を収集注：母性（シード生成する）親として野生、ハイブリッド、および作物の種類を使用して、種ヒマワリの1年生内の15のクロスタイプ（ヒマワリ）から種子を使用この例。 <ol><li>生育期の終わりに、標識された袋に成熟種子の頭を収集します。標準形式での親のクロスタイプ（ すなわち 、母性のx父方）で標識された封筒での籾殻と場所、種子からクリーンシード。 </li><li>同一の親のクロスタイプの同数から種子の等量を使用して大規模な封筒で一緒にバルク種子。例えば、同じ母系と父系の両親と10のクロスタイプから100の種子。 （クロスタイプ）の情報を識別して封筒にラベルを付けます。これらの大きな封筒は、第2節に埋葬ストリップを充填で使用するためのシードマスターです。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody&gt; <tr><td></td><td colspan="3"> 母親の親 </td></tr><tr><td> 父方の親 </td><td>ワイルド：WxW </td><td> F 1：WXC </td><td>クロップ：CXC </td></tr><tr><td>ワイルド：WxW </td><td> 0％WxW </td><td> 25％F 1 XW† </td><td> 50％CXW† </td></tr><tr><td> BC：WxF1またはF1xW </td><td> 12.5％WxBC </td><td> 37.5％F 1 XBC </td><td> 62.5％CxBC </td></tr><tr><td> F 1：WXC </td><td> 25％WxF 1† </td><td> 50％F 1 XF 1 </td><td> 75パーセントのCxF 1† </td></tr><tr><td> F 2：F 1 XF 1 </td><td> 25％WxF 2 </td><td> 50％F 1 XF 2 </td><td> 75パーセントのCxF 2 </td></tr><tr><td>クロップ：CXC </td><td> 50％WXC† </td><td> 75％のF 1クロスシー† </td><td> 100％CXC </td></tr></tbody></table> 表1.親のクロストン手受粉。ひまわりの作物野生ハイブリッドクロスタイプから生産YPESはシード埋葬実験で使用するための人工授粉を用いて製造されました。すべてのクロスタイプの場合、母体の親が最初にリストされ、父方の親は、第二記載されています。 †でマークされたクロス型は同じ％の作物の対立遺伝子が異なる母方の両親との相互クロスタイプのペアの一部です。ペース、BA ら ：表は、以前に公開されています。 （2015）15。 2.カスタムシード埋葬ストリップを作成します。 注：この例では、3除去日付トリートメントや15の反復を持っていたので、我々は合計45ストリップを必要としました。この例では、ストリップあたり15区画はので、私たちは15、7×10cmの区画を収容するために十分な細かいメッシュのポリエステル布や蚊帳を必要と使用しています。 図1を参照してください。 <ol><li>各シードストリップのための布の20×10センチメートルのストリップを切断することによって起動します。 </li><li>その後、半分に生地を折る、測定し、区画をマーク。 HIGを使用しましたH-温度グルーガンは、1ショート（10センチメートル）の端をシールします。接着剤が少しではなく、完全に冷えたら、シールを作成するために一緒に生地の側面を押してください。 注意：皮膚との接触が延長される場合は高温接着剤や接着剤銃のヒントは、火傷を引き起こす可能性があります。 </li><li>各区画マークで開いた短い方の端に折り畳まれた縁から、グルーライン。コンパートメント間の穴がないシールを確実にするために接着剤の線に沿って2つのファブリックの側面を押してください。コンパートメントの間の移行種子は実験誤差に寄与する。 注：今の区画が作成されていることを、折り畳まれていないエッジが開いて種子とその識別情報（クロスタイプ名）を受信する準備ままにしてください。 </li><li>ランダムに各ストリップのための区画にシードクロスタイプを割り当てます。 <ol><li>種子の背番号（各区画20は、この例で使用されている）でシードコンパートメントを埋めます。ラベルには、彼らがすることができるようにカットツーフィットプラスチックの庭のダーツに産業マーカーを使用埋葬に耐えます。 注意：代替的標識法を使用することができます。 </li><li>各区画は、種子及びそのラベルで充填された後、高温の接着剤銃で直ちに区画をシール。全体シードストリップが完全に密封されるまで進みます。複製、ブロックおよび/または治療情報と第一の区画で、全体的なストリップにラベルを付けます。 注：私たちは時間的な除去、ブロックを持っていたし、ブロック内のストリップを複製するため、私たちの研究のために、私たちはこの情報のすべてが含まれていました。 </li><li>次のストリップに移動する前に、必要に応じて区分し、スポット接着剤の間のギャップを確認してください。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54663/54663fig1.jpg" /> 図1.埋葬シードストリップ概略図。個々の区画のためのクロスタイプ識別を示す埋葬ストリップの例。母親の親は、第二の列挙され父方の親と最初に表示されます。色は異なる母体の親子関係を示し、作物のためのF 1雑種のための青、野生の黄色、赤と。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54663/54663fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 3.フィールドにシードストリップベリー<ol><li>家のストリップに指定された深さにプロットを掘ります。分析におけるサブプロットとしてストリップはランダム除去日がメインプロットと区画IDとして使用されることを可能にするために配置された個々のブロック（この例では、十字型）にストリップを割り当てます。 </li><li>地球とストリップをカバーしています。カット金属メッシュのハードウェア布が埋設されたストリップの上にプロットし、場所10cmよりも大きくなるように。地球とエッジとカバーの布端を固定するU-ピンを使用してください。 注：このカバーは穴を掘るシード捕食者を排除するためです。別の選択肢として、マーサーら 13を構築し、その分野のLOCAに強烈なゴーファーの圧力に起因するシードストリップを囲まれたハードウェア布の箱を埋める。） </li><li>ストリップの場所と除去の日付が明確に書かれたレコードを補完するために区別するために着色された測量のフラグを配置します。 </li></ol> 4.ストリップを発掘し、種子を評価<ol><li>与えられた除去の日付に割り当てられたシードストリップを掘ります。彼らは種子の評価が行われる実験室に到達するまでクールな湿った環境でストリップを維持します。これは、湿った新聞にストリップを包装及び輸送または翌日配達のためにクーラーに置くことによって達成することができます。 </li><li>ストリップは、外部破片があいまい種子ないことを十分にきれいになるまで水でストリップからの泥や土を洗い流してください。 </li><li>一度にオープンつの区画をカットするはさみを使用してください。発芽した種子をカウントし、それらを削除します。明らかに死んだ種子（ 例えば、腐敗、または腐敗の種子）をカウントします。さらに、未発芽休眠、および死んだ種を区別するために標識、濡れたペトリサイズ吸取紙に未発芽種子を置きます。 <ol><li>発芽してペトリ皿を置きます25°C / 10°C 12時間の昼/夜：標準的な発芽条件のための成長チャンバセットに種子。シード1週間が発芽することを許可します。でもそれ、彼らは野外条件下で発芽しなかったので、これらのような生存したが、未発芽をカウントします。 </li></ol></li><li>成長チャンバ処理後、試験はテトラゾリウムクロリド（TZ）13を用いて生存率を未発芽種子の残り。これを達成するために、AOSAテトラゾリウム試験ハンドブック14を用いた研究の種のためのTZの適切なのパーセント溶液を作ります。この例では、1％溶液が使用されます。 <ol><li>半分に未発芽種子をカットし、半分を置き、胚と胚乳は（種子が浮くことがあり、これは大丈夫です）種子をカバーするのに十分なTZ溶液を含むペトリ皿に表示されました。 </li><li> 30℃に設定したインキュベーターにTZペトリ皿を置き、3時間を待ちます。注：必要であれば、より高い温度は、より速い反応になりますが、過度染色は危険です。 </li></ol></li> &lt;LI&gt;インキュベーターからペトリ皿を削除し、評価します。染色されていない種子が死んでいる一方で、その胚で赤色に染色されている種子は、発芽可能です。マージナル例および特定の種を区別について詳しくは、AOSAテトラゾリウムテストハンドブックを参照してください。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、フィールド内の予め選択された期間での種子発芽、休眠および多様な種株式の死亡率を観察するために、シード埋葬ストリップを使用するための方法を提示します。個々のパケットは、個々のパケットの作成以上のストリップとコンパートメント構造の（1）の速度にあるのではなくストリップを使用することの利点。 （2）パケットを省略したり、意図せずにいずれかを除去する危険性なしに一つの動きで複数の区画を除去する容易さと速さを。土が硬く、フィールド条件が冷えているときに、ここで示す例で除去日付の2は、冬の間だったように、この方法は、労働と人間のミスの可能性の両方を低減します。種子のストリップはまた、研究者がフィールドにヒューマンエラーによって変更することができないようにして、実験室でのコンパートメントの位置をランダム化することを可能にすることによって、実験の物流を支援します。我々が予測された自然発芽倍の幅を包含除去時間の選択によって種子バンクのダイナミクスにおける当社の例ハイブリッド種子は、種子バンクに固執し、将来の集団に貢献するための可能性について推論を行うことができます。この方法の1つの制限は、区画間の種子の一部の移動が、種子の大きさに応じて、避けら...

この方法の全体的な目的は、確実に、フィールド条件下で経時的に種子の生存率を評価することです。 土壌シードバンクは、一過性または長年1,2持続し得るいずれかの土壌表面上に、表面のゴミの中、または土壌断面内に分散分散し、実行可能な、まだ未発芽種子の予備です。ここに提示されたものと同様のシード埋葬方法は数十種を使用して17年間の研究に適用されたときに、生存可能な種子は、3試験の種の多くで発見されました。種子休眠は生存実生のための条件の適切な組み合わせは、4を発生するまで、発芽をシードするブロックです。休眠リリースのための外部トリガが発芽することが可能になるまで休眠残って、種子がそのような低い冬の気温、栄養制限、または季節の干ばつなどの過酷な条件を、生き残るために許可することができます。休眠リリースのトリガーはfで左拡張寒さ、化合物への暴露から変化させることができます怒り、または動物の胃の酸5との磨耗や接触による種皮の物理攻撃。発芽手がかりは、属または種特異的であることと、多くの場合、過去の自然淘汰の結果でわかるように、不適応種子発芽が不適切なときに発生し、種子や苗木死亡または悪い苗の成長につながる可能性があることです。休眠は休眠リリース（ 例えば 、物理的休眠、生理的休眠）のメカニズムに基づいて種類数に分類されてきたが、6種子休眠は、少なくともの1植物生物学のトピックを理解まま。したがって、個々の種または関連する生態学的条件の下で種子のグループの状態の評価を可能にするフィールドの研究は、単に実験室での標準的な発芽試験に依存しているものよりも高い説明力を持っています。 既知の種特性の搾取は休眠のメカニズムへの洞察を提供することができます。種子休眠の制御は共同です生理学的および形態学的要因の遺伝的制御を含むmplex、。休眠機構の幅を完全に理解するにはまだ解明されていないが、一般的なモデルは、2つの植物ホルモンジベレリン（GA）とアブシジン酸（ABA）7間のフィードバック関係を含む、浮上しています。 ABAは休眠状態を維持する働きをしながら、彼らの休眠に対する生理的成分を有する種子のためのこの一般化モデルでは、GAは、休眠解除のための信号となります。母性遺伝的影響だけでなく、母体の成長環境は母系生成組織と発生シグナル8を介して、休眠やサイズなどの他の種子の特性に影響を与えることができます。母性発生した外部構造体（または種子被覆材）は、生理的手がかりと組み合わせた時刻に、休眠を維持することができます。母体由来シード材が母植物の遺伝子によって制御されているので、彼らは、種子の実際の核の遺伝子構成を反映していない場合があります。私達は私達を持っていますED作物野生ハイブリッドの配列からヒマワリの1年生の痩果は9,10。このように、多様な種、十字型、または遺伝子型を含む研究デザインについての情報を収集することができますシードの特性上、これらの母体の対胚遺伝的影響を引き出すために交差します種子休眠、発芽および生存の生態と遺伝。 種子発芽および生存の表現型は、人口動態に影響を与えることができる方法の重要な例は、作物野生ハイブリッドゾーンで見ることができます。栽培植物の栽培時の選択はほとんど休眠性を排除し、成長期の外で生き残るために種子の能力を低下させます。しかし、作物の野生ハイブリッドゾーンの栽培と野生型間の遺伝子流動、またはハイブリダイゼーションは、種子バンクのダイナミクスの潜在的な影響で、野生集団に作物の対立遺伝子（または遺伝子変異体）を再導入することができます。栽培と近縁野生種間の雑種は、潜在的に有することができる作物野生ハイブリッドゾーンで発見しますわずか数栽培の外部条件を生き残るために期待される表現型（ 例えば 、冬季）11との中間休眠の表現型の多様性、。 この原稿の目的は、私たちが現場条件の下で彼らの自然な変化を調査するために、異なる期間で発芽、休眠、および種子の種類の範囲の生存を評価することができるシード埋葬ストリップ法を使用して、方法を示すことです。私たちは種子の特性上、母体と胚遺伝的影響に興味を持っているので、この例では、15作物野生ハイブリッドクロスタイプからヒマワリの種を採用しました。

<table><tbody><tr><td>小さなコイン封筒</td><td>大きな</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コイン封筒</td><td>細かい</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メッシュのポリエステル蚊帳</td><td>高温</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルーガン</td><td>高温</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スティックのリフィル</td><td>工業用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パーマナントマーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック、庭のラベル</td>、<td>は</td><td></td><td></td></tr><tr><td>さみ</td><td>、シャ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベル</td><td>、金属</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メッシュ、硬い布</td><td>、測量</td><td></td><td></td></tr><tr><td>士の旗、複数の色</td><td>、濡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>れた新聞</td><td>、クーラー</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>、</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブロッターペーパー</td><td></td><td></td><td></td></tr> 任意の<tr><td>ペトリ皿</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温度制御成長チャンバー</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カミソリの刃</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化テトラゾリウム</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>熱インキュベーター</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

フィールド条件の下で種子発芽、休眠、および死亡率を評価するための信頼性の高い方法

Reliable Method for Assessing Seed Germination, Dormancy, and Mortality under Field Conditions

私たちは、Helianthus annuusを例に研究種を使用して、シードバンクのダイナミクスを経時的に近似する技術について説明します。透過性ポリエステル生地と接着剤のストリップを折りたたんで接着すると、土壌浸出水、水、微生物、および周囲温度との接触を可能にしながら、種子と識別情報を収容するコンパートメントのストリップを構築できます。ストリップは、幅広いコンパートメント数とサイズで構築でき、研究者は、単一の種、異なる種、または異なる処理を受けた種子内のさまざまな遺伝子型を収容することができます。個々のシードパケットとは対照的に、ストリップはユニットとしてより簡単に取得できます。 レプリケート パケットをストリップに含めることもできますが、異なるストリップをブロックとして機能させたり、シードの動作を経時的に観察するために異なる時間に取得したりできます。高温のグルーガンを使用してコンパートメントを描き、ブロックと除去時間を識別するシードとタグが挿入されたらストリップを密封しました。次に、種子のストリップを目的の深さでフィールドに埋め、後で除去するために場所にマークを付けました。穴を掘る動物の捕食者は、土壌表面に金属メッシュのハードウェアクロスのカバーを使用して効果的に排除されました。埋葬のために選択された時間間隔の後、ストリップが掘り出され、種子の発芽、休眠、および死亡率が評価されました。明らかに死んだ種子は、発芽していない生きている種子と目で区別できることがよくありますが、休眠中の種子は、種子の生存率に関する標準的な塩化テトラゾリウム比色試験を使用して最終的に特定されました。

多様母体の親子と作物の対立遺伝子の割合がクロスタイプ（ 表1）は、パーセントで除去日付を横切って異なった未発芽、発芽、および死んだ種子（ 図2及び3）。第三の除去（スプリング）により未発芽すべての種子が本当に休止状態であることが判明した一方で未発芽種子のTZテストを使用して、我々は、第二の除去（早春）（ 表2）で、いくつかの真の休眠種子を発見しました。 一般的に、低い作物の対立遺伝子の割合は、晩秋に不適応な発芽を減少させた（ 図2）。早春の除去では、すべてのクロスタイプは高い発芽していたが、その割合は死んでいない未発芽（ 図3）が異なっていました。母体の野生のクロスタイプは未発芽残ることが多かった一方で、特に、作物母体の親子関係とのクロスタイプはより高...

ここでは、埋葬、標識されたシードストリップ及びテトラゾリウムクロリド（TZ）生存性テストを使用して、フィールド条件の下で種子生存率、発芽と休眠を評価するためのプロトコルを提示します。

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester ...

本手順の全体的な目的は、圃場条件下における種子の発芽、死亡、および休眠を、時間経過とともに直接観察し定量化することである。この手法は、異なる種や種内のエコタイプが次世代の個体群にどのように苗を供給するか、あるいは、永続的な土壌種子バンクに個々の種子がどのように寄与するかといった、種子生態学分野における重要な疑問を解決するのに役立つ。この手法の主な利点は、任意の数の実験設計、種、処理、または回収日をフィールドに容易に配置でき、埋設から数週間から数ヶ月後に完全な反復として回収できることです。まず、種子ストリップ用に20 x 105 cmの布片をカットします。巻尺を使用して、ストリップ上にコンパートメントを書き込みます。布を半分に折り、高温グルーガンを使用して短い端の一方に接着剤を塗布します。接着剤を少し冷ましてから、2つの面を押し合わせて密封します。折り目から反対側の開いた短い端に向かって、各区切り線に沿って接着剤を直線状に塗布します。コンパートメント間に隙間がないよう、接着線に沿って2枚の布地を押し合わせて密閉します。各ストリップのコンパートメントに、種子の交配タイプをランダムに割り当てます。次に、一定数の種子を数え、各コンパートメントに配置します。プラスチック製のガーデンダートを使用して、コンパートメントに種子の種類をラベル付けします。グルーガンを用いて、コンパートメントをしっかりと密封します。ストリップに沿って、すべてのシードポケットが満たされ、密封されるまで、一つずつ充填、ラベル付け、および密封を行います。次に進む前に、コンパートメント間に隙間がないか確認し、必要に応じて接着剤を点付けしてください。埋設試験を行うには、まず実験計画に基づいて、ストリップを収めるための区画を指定の深さに掘ります。種子ストリップを地面に配置し、土で覆います。次に、埋設種子プロットよりも各辺が10 cm大きいサイズの金属メッシュハードクロスのパネルを切断します。メッシュクロスの端を土で密封してください。この被覆により、種子を掘り起こして食べる捕食者を排除します。最後に、回収日を記載し、記録と照合できるよう色分けした色付きプラスチックプロットラベルを設置場所に配置します。指定の回収日に、対象の種子を掘り起こします。湿り気を保つため、ストリップを濡らした新聞紙で包み、輸送用にクーラーボックスに入れます。研究室に持ち込んだ後、ストリップを水ですすいで、コンパートメント内の種子が見えるまで外部の汚れやゴミを取り除きます。ハサミを使用して、コンパートメントを1つずつ切り開きます。発芽した種子の数をすべて数え、それらを取り出します。明らかに死滅している種子を数えて取り除きます。最後に、残りの未発芽種子をすべて回収し、ラベルを貼ったペトリ皿内の湿らせたブロッティングペーパーの上に置きます。発芽させるため、これらの皿を成長チャンバーに入れ、1週間放置します。種子を調べ、発芽したものを特定して計数します。これらの種子はフィールド条件下で発芽しなかったため、「生存しているが未発芽」として記録します。残りの種子を半分に切り、テトラゾリウム塩化物を適用して生存試験を行います。胚と胚乳が見える状態で、種子の半分をペトリ皿に置きます。種子の半分が浸るまで十分な量の塩化テトラゾリウムを加えます。この皿を30 °Cに設定したインキュベーターに入れ、3時間置きます。最後に、種子の半分を評価します。胚に赤色の染色が見られる種子は発芽可能であり、染色されていない種子は死滅しています。このグラフは、晩秋に埋設した後の最初の回収日における、ヒマワリ栽培種と野生種の交雑型の発芽率を示しています。交配タイプは作物アレル比率の昇順に配置され、各交配における母本が示されています。一般的に、作物アレル比率が低いほど、晩秋における不適応な発芽が抑制されました。早春の回収時には、すべての遺伝子型で高い発芽率が認められましたが、未発芽種子または死滅種子の数には有意な差が見られました。特に、栽培種を母親とする交雑型では死亡率が高く、野生種を母親とする交雑型では発芽しないままとなる傾向が強かった。春までに、一部の交雑型で発芽率が低下した。これは、早期に発芽した交雑型において、埋設帯内での種子の死亡が起こったためと考えられる。その結果、作物親から作られた作物に近い交雑型ほど、死亡率が高くなりました。この手法を習得すれば、設計に応じて数時間で組み立てることが可能です。ストリップの評価には、通常1コンパートメントあたり数分しかかかりませんが、これに成長室での処理時間とTZ試験でのインキュベーション時間が加わります。本手順を実施する際は、成長室を通過し、その後のTZ試験で生存可能であると判定された種子のみが、真に休眠状態にあると考えられることを忘れないでください。成長チャンバー内で発芽した種子は、未発芽とみなされます。本手順に続き、種子の生存が種子の出芽やライフサイクルの完遂につながるかどうかなど、追加の疑問を解決するために、苗の研究などの他の手法を並行して実施することが可能です。このビデオを視聴することで、種子の発芽、死亡率、および休眠に関する圃場評価の実施方法について十分に理解できるはずです。テトラゾリウム塩化物は刺激物であるため、本手順の実施中は常に手袋の着用などの予防策を講じてください。

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