Name: の除去ショウジョウバエ筋肉組織 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫の筋肉組織除去法による免疫蛍光解析の改善。Drosophilaの樹状突起ニューロンと表皮組織の可視化を向上させ、超解像顕微鏡の利用を可能にする技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは顕微鏡上で有用な議論のためのゲイリーLaevskyに感謝します。 NIHによって資金を供給されたこの作品は、ERGにR01GM061107とR01GM067758を付与します

注：筋肉を除去するための手順（ 図1）は、幼虫のフィレットを調製するための前述の方法の変形例です。先行すると筋肉の除去を以下の手順を簡単に概説されており、読者はより詳細な説明については、前の作業10、11と呼ばれています。 冷生理食塩水で1解剖幼虫<ol><li>冷たいHL3.1生理食塩水15または低温のCa 2+を含まないHL3.1生理食塩水11（ 表1）の作業希釈を準備します。皿の底をカバーするだけの十分な冷生理食塩水とシリコーンエラストマー皿に幼虫を置きます。 注：生理食塩水の選択についての議論を参照してください。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1×HL3.1生理食塩水（pH7.2）で</td></tr><tr><td> 5 mMのHEPES </td></tr><tr><td> 70 mMのNaClを</td></tr><tr&gt; <td> 5のKCl </td></tr><tr><td> 1.5 mMのCaCl 2を（のCa 2+を含まない生理食塩水のために省略します） </td></tr><tr><td> 4のMgCl 2 </td></tr><tr><td> 10mMのNaHCO 3を</td></tr><tr><td> 5 mMのトレハロース</td></tr><tr><td> 115 mMのスクロース</td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 4℃でのフィルター滅菌し、店舗</td></tr><tr><td>注：組成を模倣昆虫血リンパ</td></tr></tbody></table> 冷生理食塩水の表1の組成物。 <ol start="2"><li>腹側を上にして幼虫を置きます。幼虫の腹面は、前方から後方に実行されている主要な幼虫の気管チューブによって腹部denticalベルトと背側によって同定することができます。前後方向に幼虫を伸ばし、頭と尾をピン虫ピンを使用して皿を解剖シリコーンエラストマー。一方の端で始まり、他方に向かって進行し、腹側正中線に沿って切断するために微細な解剖ハサミを使用してください。 注：この向きはDAニューロンの一般的に研究背クラスタを保持します。 </li><li>幼虫が切り開かれた後、本を開いたかのように解剖皿に四隅を固定します。 CNS、腸、気管などの内臓を取得し、削除するために鉗子を使用してください。フィレットがピンと張ったが、最大限に延伸されないように虫ピンを調整します。 注：筋肉セグメント境界で体壁に固定されています。筋肉は、体壁の大部分をカバーするが、これらは、背側正中線近くの狭い領域に存在しません。 </li></ol> 2.筋肉の取り外し<ol><li>筋肉組織が存在しない幼虫の背側正中線の位置を確認します。それは平坦可能向きで筋肉組織の下に挿入することができるように、単一の鉗子の突起を配置します。 </li><li>始まります背側正中線は、セグメントの前方境界付近に、慎重に鉗子と表皮の間の接触を最小限に抑えるように注意しながら、筋肉と表皮の間に鉗子突起をスライドさせます。 </li><li> 1アンカーポイントで体壁に筋肉の付着を破壊するために上向きに鉗子を引き出します。関心の残りの半セグメント（複数可）のためにこのプロセスを繰り返します。 注：このプロトコルは、各ダニューロン樹状突起フィールドの後方の保存を最適化します。デンドライトフィールドの前部を維持するためには、各セグメントの後端に鉗子の突起を挿入するのが最善です。 </li><li>幼虫フィレットを最大限にすべての方向に延伸されるように、虫ピンを再調整。 </li><li>それはまだ25分間、PBS中の寒い、新たに調製した4％ホルムアルデヒドを使用して、解剖皿に固定されている間にフィレットを修正しました。 </li><li> PBSで5回洗浄します。 </li><li>コンタを最小限に抑えるように注意しながら、慎重に残りのアンカーポイントから筋肉組織を離れて引っ張るために鉗子を使用して、表皮とCT。 </li><li>固定を解除し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに解剖皿からフィレットを削除します。以前に11を説明したように、すべてのその後の洗浄、ブロッキング、および免疫蛍光染色の手順を実行します。 </li></ol> 3.マウント幼虫フィレ<ol><li>まずできるだけサンプルは限り平坦にするために微細な解剖ハサミを使用して、頭と尾を削除します。カバーガラスに面したフィレットの内面と退色防止封入でカバースリップ上のフィレットをマウントします。 </li><li>カバースリップ上の顕微鏡スライドを配置し、封入剤を分散させるために軽く押してください。以上の顕微鏡スライドを裏返して、マニキュアを使用して、スライド上にカバーガラスをシール。スライドは、少なくとも1ヶ月間-20℃で保存することができます。 </li></ol>

<ol><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+Drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li>
<li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li>
<li>Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+regulates+a+developmental+transition+in+epithelial+cells+that+restricts+sensory+dendrite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth.</a> Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).</li>
<li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermis-derived+Semaphorin+promotes+dendrite+self-avoidance+by+regulating+dendrite-substrate+adhesion+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111(2011).</li>
<li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li>
<li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC%2C+NANCHUNG%2C+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここでは、プロトコルは、ショウジョウバエの幼虫の切り身から筋肉組織を手動で除去するために記載されています。このプロトコルは、以前幼虫の解剖技術10,11を説明し修正します。幼虫は、シリコーンエラストマー皿に切開した後、背側正中線が配置されています。単一鉗子プロングは、その平坦可能な向きに、慎重に背側正中線近くに、筋組織と表皮との間に挿入されます。鉗子を穏やかに関心のある各幼虫のセグメントに1アンカーポイントから筋肉組織を分離するために上向きに引っ張られます。幼虫のフィレットは、その後、鉗子は、残りのアンカーポイントから筋肉を引き離すために再び使用された後、冷ホルムアルデヒド中で固定されています。 筋肉の除去手順の後固定の全体を実行するために魅力的ですが、私たちは、延伸筋肉は、一度固定し、レンダリング、平坦化されたままと密接にさえアンカーポイントから剥離した後、表皮に並置することを見つけますそれは困難な下にある組織を損傷することなく操作します。さらに、我々の経験では、固定された筋肉組織は脆く、体壁からの完全な除去を防止し、簡単に涙。対照的に、筋...

ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンは、それらの遺伝子操作に従順し、それらが画像化することができる容易さに神経発達を研究するための貴重なモデルを提供します。これらの感覚ニューロンは、樹状突起の形態形成1-3を制御する多数の経路の同定に尽力してきました。 ダニューロンの4つのクラス（クラスI - IV）幼虫の表皮を支配します。これらのニューロンは、それらの樹状突起が大きく二次元アレイ4,5を形成することで、基底膜と表皮の間にあります。 4つのクラスのうち、クラスIV DAニューロンは、最も高度に分岐したアーバを持っていると、他の動物の感覚ニューロンのように、これらのアーバーの精緻化は、本質的な要因だけでなく、その開発6-9ため、隣接組織からの合図、特に表皮を、必要とします。 どのような神経細胞や余分な神経事実を決定するための研究ORS免疫蛍光法により、in situでタンパク質の発現を検出する能力の樹状突起の形態形成効果を制御します。幼虫の外側のキューティクルは、抗体に不可解ですが、この障害は、簡単に十分に確立された解剖法10,11を介して幼虫のフィレットの作成によって克服されます。しかし、基底膜のすぐ内側にある体壁筋肉組織は、DA神経細胞と表皮細胞の可視化に向けていくつかの課題を提示します。体壁のほとんどは、非常に神経または上皮組織から発せられる蛍光シグナルを不明瞭線まず、筋肉組織、。これは、実質的に、試料中の信号対雑音比を低下させます。第二に、多くの関連タンパク質は、筋肉組織ならびに神経細胞または表皮で発現させてもよいです。この筋肉由来の蛍光シグナルは、ニューロンまたは表皮からの蛍光シグナルのさらなる曖昧検出する可能性があります。最後に、無顕微鏡技術の進歩サブ回折分解能で試料のワット許可イメージングと神経細胞と周囲の上皮細胞12,13に発現されるタンパク質の局在を見分ける際に特に有用であろう。しかし、雑音比とカバースリップに、試料の近接に強い信号から超解像顕微鏡の利点を介してイメージング。信号対雑音比を減少させることに加えて、幼虫の体壁筋の距離それによって超解像顕微鏡法を用いて達成することができる改善された画像の解像度を制限するカバースリップからのDAニューロン。免疫蛍光分析のための課題に加えて、筋肉組織は、幼虫の体壁内の感覚ニューロンからの電気生理学的記録に対する障壁を提示します。その除去は、したがって、感覚ニューロン14の神経生理学的な操作に利益をもたらします。 ここでショウジョウバエ幼虫の筋肉組織を手動で除去するための方法が記載されています。私たちは、プロトコルPことを実証していますさもなければ筋肉組織によって覆い隠されているタンパク質のermits免疫蛍光イメージングは​​、クラスIV DAニューロンの可視化のための信号対雑音比を向上させ、より良いDAニューロンにおけるタンパク質及び細胞構造の空間的関係を判別する超解像顕微鏡法の使用を可能と表皮。

<table><tbody><tr><td>デュモン#5ピンセット</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72701-D</td><td></td></tr><tr><td>マイクロはさみ、8 cm、ストレート、5 mmブレード、0.1 mmチップ</td><td>ワールド精密機器</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td>3097358-1004</td><td>解剖プレート</td></tr><tr><td>用 アウステルリッツ昆虫ピン、0.1 mm</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Fostec 8375 光源</td><td>Artisan Technology Group</td><td>62792-4</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 退色防止封入剤</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>共焦点顕微鏡用</td></tr><tr><td>Prolong Diamond 色あせ防止封入剤</td><td>Life Technologies</td><td>P36970</td><td>構造化照明顕微鏡用</td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス、22 x 22mm, No. 1.5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 顕微鏡スライド, 25 x 75 x 1.0 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗コラクル抗体</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>C615.16</td><td>上清, 希釈 1:50</td></tr><tr><td>Mouse anti-Discs large antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>上清, 希釈 1:50</td></tr><tr><td>ウサギ抗dsRed抗体</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>希釈 1:1,000</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ抗体, Alexa Fluor 568 標識サー</td><td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11011</td><td>希釈 1:1,000</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス抗体, Alexa Fluor 488 標識</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11001</td><td>希釈 1:500</td></tr></tbody></table>

の除去<em&gt;ショウジョウバエ</em感覚ニューロンおよび表皮細胞の免疫蛍光分析のための幼虫の切り身から&gt;筋肉組織

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンは、神経形態形成のメカニズムを調べるための人気モデルです。 DAニューロンは、彼らが免疫蛍光によってタンパク質を発現し、両方のneuronallyと表皮のその場可視化から支配するので、それらの分析の利点表皮細胞と通信して開発しています。免疫蛍光実験のための幼虫フィレットを製造する従来の方法は、ニューロンおよび表皮タンパク質を画像化するためにいくつかの課題を提示し、体壁の大部分をカバーする筋肉組織をそのまま残します。ここでは、 ショウジョウバエの幼虫の切り身から筋肉組織を除去する方法について説明します。このプロトコルは、他の方法で筋肉組織によって覆い隠されているタンパク質の画像化を可能にする信号対雑音比を改善し、DAニューロンの発達を研究するための超解像顕微鏡の使用を容易にします。

私たちは一緒に膜マーカーで標識されたクラスIV DAニューロンと中隔結合タンパク質網代舟（コーラ）とディスク大（DLG）の同時可視化するために、免疫蛍光実験で信号対雑音比を改善するための筋肉の取り外し手順の有用性を実証しているCD4 - tdTomato。 コーラは、以前に、DAニューロンの樹状突起は、表皮細胞によって囲まれており、DAニューロンの形態形成および機能に関連して研究されてきた多くの識別された表皮の要因の一つは4,6-9,16の樹状突起れるトラクトを特定するために使用されています。ニューロン（赤）を検出するために、抗DsRedを用いた免疫染色および抗コーラ抗体（緑）は、筋肉削除（筋肉オフ）で、筋肉無傷の（筋肉オン）と幼虫の切り身で実施しました。各条件については、クラスIV DAニューロンの樹状突起の後方視野を、レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて画像化しました。画像は、IDを使用して得られました両方の条件のためのentical撮像パラメータ。我々はさらに、筋肉の筋組織からの干渉を補償す...

ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンを用いて、神経細胞の形態形成の研究は、免疫蛍光によって、神経や表皮タンパク質のその場可視化で恩恵を受ける。私たちは、幼虫の体壁から筋肉組織を除去することにより、ダニューロンと周囲の表皮細胞の免疫蛍光分析を向上させる手順を説明します。

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

この手順の全体的な目的は、ショージョウバエ幼虫の樹状突起分枝（da）ニューロンおよび表皮組織の免疫蛍光解析に向けた準備として、幼虫から筋肉組織を除去することです。本ビデオでは、樹状突起の形態形成に関与するニューロンおよびニューロン外因子の可視化を向上させる手法を実演します。この手法の主な利点は、通常は筋肉組織に遮られて見えないタンパク質の免疫蛍光イメージングが可能になること、S/N比が向上すること、そして超解像顕微鏡の使用が可能になることです。まず、シリコンエラストマー製ディッシュに、底面が覆われるまで十分な量の冷やした生理食塩水を加えます。対象となる幼虫をディッシュに入れ、実体顕微鏡下に配置します。その際、照明が適切に当たっていることを確認してください。腹側を上に向けた状態で幼虫を配置します。腹側は腹部歯帯（abdominal denticle belts）によって識別可能です。幼虫を前後の方向に伸ばし、昆虫ピンを用いて頭部と尾部をディッシュの底に固定します。精細な解剖用はさみを用い、幼虫の腹側正中線を端から端まで切り開きます。幼虫を広げ、角皮組織の四隅をピンで固定して平らにします。ピンセットを用いて、中枢神経系（CNS）、腸、気管を含む内臓を取り除きます。フィレが適度に張り、過度に伸展しすぎないように昆虫ピンを調整します。幼虫の背側正中線（筋肉組織が存在しない部位）を確認し、ピンセットの先端をこの境界の内側に配置します。表皮への接触を最小限にするよう注意しながら、先端を筋肉と表皮の間に滑り込ませます。表皮への損傷を最小限に抑えるため、可能な限り平坦な先端のピンセットを使用して解剖し、カルシウムを含む生理食塩水中で解剖することを推奨します。これにより、筋肉と表皮の間にスペースを作りやすくなります。次に、ピンセットを上に引き上げ、1箇所の固定点において筋肉と体壁の接着を切り離します。関心のある残りの筋節についても、この操作を繰り返します。昆虫ピンを調整し、幼虫のフィレをあらゆる方向に最大限に伸展させます。フィレを固定するには、まず生理食塩液を取り除き、次に、シャーレの底が浸るまで、冷やして調製したばかりの4%ホルムアルデヒド（PBS溶液）を加えます。室温で25分間インキュベートします。PBSでフィレを5回すすぎ、余分なホルムアルデヒドを除去します。次に、ピンセットを用いて、残りの固定部位から筋肉組織を慎重に剥がします。この際も、表皮への接触を最小限に抑えてください。最後に、フィレのピンを抜き、解剖皿から取り出します。それを清潔な1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに入れます。以降の洗浄、ブロッキング、および免疫染色は、このチューブ内で行ってください。イメージングのためにフィレットを封入するには、マイクロ遠心チューブからサンプルを取り出し、PBSの液滴を入れたカバーガラス上に内面を下に向けて配置します。頭部と尾部を切り離します。次に、ラボワイプで吸収させてPBSを除去します。アンチフェード封入剤を1滴加えます。カバーガラスの上に顕微鏡スライドを置き、ラボワイプで軽く押さえて封入剤を分散させます。スライドを裏返し、各端に透明なマニキュアを塗布してカバーガラスを密封します。これらの共焦点画像は、隔壁接合タンパク質であるCoracle（またはCora）およびdaニューロンを可視化するための免疫蛍光実験の結果を示しています。ここでは、筋肉を除去した組織と筋肉が保持された組織の画像を、同一のレーザー出力条件下で撮影しました。筋肉が保持された組織では、筋肉による干渉を補い、同等の画像を得るためにレーザー出力を上げました。筋肉を除去したフィレットから得られた画像では、クラス4のdaニューロン樹状突起に沿った断続的な軌跡の表皮細胞境界において、coraを明確に検出することができました。そして、ニューロンの細胞体（soma）の輪郭が描かれています。対照的に、これらのドメインにおけるcoraの局在は、筋肉のサンプルではほとんど検出されませんでした。ここでは、coraは主に筋肉、気管、および神経筋接合部で視認され、これらの組織からの蛍光によって、ほとんどの表皮のcoraが遮られていました。筋肉の除去が高解像度での視認性を向上させるかどうかを判断するため、3D構造照明顕微鏡を用いたサンプルのイメージングも行いました。ここでも、筋肉が保持されたサンプルでは、筋肉による干渉を補うために、より高い出力と露光時間での視覚化が必要となりました。筋肉を除去したサンプルでは、画像の解像度がより鮮明になり、アーティファクトも少なく観察され、樹状突起経路のcora染色の解像度がより容易に得られました。筋肉が弛緩した状態では、樹状突起膜は114 nanometersで測定される場合があります。一方で、筋肉が収縮したフィレでは、幅が272 nanometersであるように見えます。この手順を行う際は、固定前に解剖する幼虫の数を制限し、経過時間が25 minutesを超えないようにすることが重要です。このビデオを視聴することで、ショウジョウバエ幼虫から筋肉組織を除去する方法について十分に理解できるはずです。このプロトコルは、幼虫の感覚ニューロンおよびそれらが支配する表皮細胞の免疫蛍光分析に役立ちます。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

removal-drosophila-muscle-tissue-from-larval-fillets-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、分析する方法を示しています...

ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

このビデオでは、感覚樹状突起樹状突起形成(da)ニューロンとそれらに関連する表皮細胞を視覚化するために使用される幼虫の切り身を準備する方法について説明します。このプロトコールでは、細胞の形態を維持しながら体壁から筋肉組織を切除する方法を詳細に示しており、これにより、不明瞭なdaニューロンや表皮細胞の免疫染色と可視化が改善されます。...

幼虫の切り身の準備:無傷の感覚ニューロンと関連する表皮細胞を視覚化する方法

ショウジョウバエの飛行筋は、筋肉の発達と生理学のモデルシステムとして使用されます。このビデオでは、成体の飛行筋組織について説明し、蛹からのRNAシーケンシングに適した発達中の間接飛行筋を解剖するためのプロトコルに焦点を当てています。...

ショウジョウバエ後期蛹間接飛行筋(IFM)解剖:ハイスループット組織収集の方法

この動画では、ショウジョウバエの幼虫の神経線維をFM色素に浸し、細胞膜脂質に結合させています。吸引された微小電極と電気パルスはエンドサイトーシスプロセスを刺激し、FM色素を新しく形成されたエンドサイトーシス小胞に組み込みます。この方法は、神経伝達のシナプス前段階を可視化するもので、シナプス機能や神経伝達物質の放出を研究するのに役立ちます。...

ショウジョウバエ幼虫神経細胞における微小電極媒介FM色素のローディングとアンローディング

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

ショウジョウバエの成体構造は、虚数円盤と呼ばれる袋のような構造に由来します。これらのディスクの解析により、組織決定、コンパートメント境界の確立、細胞増殖、細胞運命の仕様、平面細胞の極性など、多くの発生過程に関する洞察が得られます。このプロトコールは、光/蛍光顕微鏡用の架空ディスクを調製するために使用されます。...

解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ

ショウジョウバエ飛行筋は、転写調節、代替スプライシング、代謝、およびメカノバイオロジーを研究するための強力なモデルです。我々は、プロテオミクスおよび深いシーケンシングに最適な高濃縮サンプルを生成するために、生きている子犬から蛍光標識飛行筋を解剖するためのプロトコルを提示する。これらのサンプルは、筋肉の発達の多様な側面に重要な機械的洞察を提供することができます。...

オミクスアプローチに対するショウジョウバエメラノガスター飛行筋肉の解剖

このレポートは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部を視覚化するための新しいサンプル調製手順を提供します。この方法は、従来の方法と比較してサンプルのカールを防ぐのにより効果的であり、 ショウジョウバエの...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

ショウジョウバエは、筋形成の基本的なメカニズムを理解するための強力なモデルです。胸部半切片の解剖と調製のためのこのプロトコルは、蛹と成虫の両方の段階からの間接飛行筋の顕微鏡分析を可能にします。このプロトコルは、細胞形態、タンパク質局在化、筋肉構造、および筋形成の他の複数の側面の共焦点イメージングを可能にします。...

顕微鏡アプローチのための ショウジョウバエ の間接飛行筋の解剖

学ぶショウジョウバエ幼虫の筋肉組織除去法による免疫蛍光解析の改善。Drosophilaの樹状突起ニューロンと表皮組織の可視化を向上させ、超解像顕微鏡の利用を可能にする技術です。

の除去

さらに動画を探す