Name: 生きているバイオ フィルムにおける電子輸送特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶ 生きた微生物バイオフィルムの電気伝導性測定法。インターディジテート電極を用いて電子輸送メカニズムを解明し、微生物電気化学研究に貢献します。

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M.D.Y、S.M.G S と主張を認める、海軍研究局 (賞 #N0001415WX01038 ・ N0001415WX00195)、海軍研究所と海軍研究所ナノサイエンス研究所M.Y.E. N米国部門のエネルギー付与デ-FG02-13ER16415 はサポートされています。

1. 櫛型電極アレイ (IDA) 準備
<ol><li>市販の井田に非導べ電性基板上に電極を取得またはそれらを合成平版の標準的な方法を使用して。28 注: 井田寸法や材料変えることができるさまざまな実験に必要な条件に基づいて。IDAs はここで使用される商業的に得られ、配列の両端に大きな電極パッドに接続されているガラス基板上パターン 2 つの櫛型金電極から成っていた。電極は、大きい接触パッドに電極を接続するバス路線は薄い絶縁材料で被覆されている間にさらされています。IDAs 使用ここで 2 つの構成は、10 μ m 幅と 2 mm 長い金電極バンド (ソースおよびドレイン) のセットの間隔 5 μ m 離れてフラット ガラス表面の模様します。IDAs 使用ここ 65 電極対で (130 合計櫛型バンド) を持っていた。縞模様は、配列の両端の電極パッドに接続されます。</li>
	<li>ワイヤーし、井田を絶縁<ol>
<li>導電性銀エポキシを使用して各大きな電極パッドにワイヤを接続します。<ol>
<li>(手順は製造元によって異なる場合があります) 混合の棒またはピペット チップの使用に特定のエポキシの製造元の指示に従って導電性エポキシを準備します。</li>
			<li>実習テープを使ってその場でセキュリティで保護された金パッドごとに線を配置します。銀エポキシ混合ロッドまたはピペットの先端を使用してワイヤーとパッドをカバーします。</li>
			<li>慎重に治療法や治療法の使用特定の導電性銀エポキシの製造元の推奨事項に基づいた 1 h の 80 ° C のオーブンに移動します。</li>
			<li>エポキシが硬化後は、マルチメータを使用ワイヤーの端とパッドの間の電気接続を確保します。ワイヤーとパッドの間の抵抗は、&lt; 5 Ω をする必要があります。また、マルチメータを使用して、配列を短いこれ導電性エポキシは複数の電極パッドを接続なしを確認します。導電性エポキシが複数のリードを接続している場合は、スクライブを使用してリード線を切り離します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>熱、電気、および防水絶縁材料との接続をコーティングすることにより epoxied 接続を絶縁しなさい。難燃性ポリウレタン樹脂は、適しています。<ol>
<li>絶縁材料の金型として (約 2.5 mL マーク) で 15 mL の円錐形遠心管の先端を取り外します。21 g の針を使用してを介して突出するワイヤーのための底の 2 つの小さい穴を作る。</li>
			<li>金型と金型の下の穴からワイヤーに IDA を挿入します。</li>
			<li>特定の絶縁材料を準備します。得られる特定の樹脂と共に提供された指示に従います。</li>
			<li>銀エポキシが完全に、金型内に絶縁体をピペット (~2.5 mL) をカバーし、製造元の仕様に従って乾燥することができます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 電気化学リアクターのセットアップ、テスト、および接種
<ol><li>電気化学セルを設定します。<ol>
<li>井田、カウンター電極、参照電極を電気化学セルに挿入します。 注: 電極のすべてが収まる限り、電気化学リアクターを使用することができます広く、異なります。1 つの考慮事項は、参照電極が作用電極に可能な限り近い与えられるべきこと原子炉の実用的な限界です。ここでは、電極から参照電極 2 ~ 3 cm 単室炉を使用します。また、対向電極は、それは、システムで制限されていませんように作用電極より大きくなければなりません。</li>
		<li>純粋培養で作業する場合、内部カウンター電極が付いているリアクターを殺菌します。10 分と 10 分間滅菌脱イオン水 5 の漂白剤に浸漬した IDA を滅菌するために漂白剤に浸漬によって参照電極を殺菌しなさい s に続いて 10 の無菌純水原子炉に挿入する前に s。</li>
		<li>滅菌中のバイオ フィルムの成長に最適な電気化学セルを入力します。G. sulfurreducens17,18, フマル酸を除く淡水媒体を使用します。Biocathode MCL、9人工海水培地を使用します。9
</li>
		<li>Bipotentiostat に電極を接続します。カウンターのリードに作業鉛 1 井田電極、ワーキング リード 2 に他の井田電極、参照電極基準リードを対向電極を接続します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
IDAs の電気化学的テスト。 注: このテストの主な目的は、2 つの電極は電気的に絶縁を確認してくださいすることです。すべての電気化学的手法が、bipotentiostat を制御するために使用するソフトウェアで使用可能です。<ol>
<li>適切な IDA 機能、bipotentiostat を使用するために (前のバイオ フィルムの成長) に、制御導電性テストを実行します。<ol>
<li>1 分の各電極の開回路電位を測定。 注: いくつかの楽器の開回路電位達成されなければならない定電流コレクション プログラムを使用して、電流を 0 に設定して mA。</li>
			<li>電極 2 20 mV/s でサイクリックボルタンメトリー (彼女) 対 +0.6 V に 0.2 V 間 1 電極上の実行中の開回路電位を測定。 注: 必要な場合他の境界と CV のスキャン料金を使用することがことができます。しかし、水素または酸素の生成につながる可能性を避けるため。</li>
			<li>電気化学測定装置のソフトウェアを使用して履歴書の中に 2 電極で測定開回路電位が電極 1 の可能性を反映しないを確認します。 注: 電極 2 の開回路電位を変更可能性がありますが、それは電極 1 の可能性の独立したする必要があります。</li>
			<li>2 電極と電極 1 の開回路電位測定の可能性、制御を除いて 2.2.1.3 を通じて 2.2.1.1 手順を繰り返します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bipotentiostat ソフトウェアを使用して関連するゲルロボットのバイオ フィルムの必要な成長の可能性に電極の可能性を設定します。たとえば、 Geobacter sulfurreducensまたは biocathode MCL の (彼女) 対 +0.31 V の 0.5 V (彼女) の対を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>関連するゲルロボットのバイオ フィルムを成長します。<ol>
<li>標準的な無菌微生物技術を使用して目的の電気化学的活性微生物のストックの文化/濃縮から電気化学リアクターを接種します。標準的なテストのために、1:20 で接種率 (原子炉ボリュームに接種) 外径600 = 0.5 文化。</li>
		<li>必要なレベル (~ 200 rpm) とインキュベーターに原子炉で攪拌を設定/興味のバイオ フィルムの成長条件に基づいて所望の温度を水のお風呂。G. sulfurreducens、最適な成長のため、30 ° C を使用します。</li>
		<li>バイオの 2 つの電極を分離するギャップを埋めるまで、関心の糖化の特定の要件に基づいてシステムを孵化させなさい。定常のg. sulfurreducensバイオ フィルム、7 〜 10 日間孵化させなさい。Biocathode MCL、~ 7 日を孵化させなさい。それぞれのケースで 30 ° C に温度を制御します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 電気化学的ゲーティング実験
<ol><li>ゲート測定用電流-電位依存性を決定するため使用する実験的パラメーターを選択します。
	<ol>
<li>ゲート システムの潜在的な (EG) 曲線と (ISD) 伝導電流を取得する IDA に適用されますゲート電位の範囲を決定します。 注: 可能な酸化還元活性を持つすべての電位は、ゲート電位検査の範囲がカバーするべき。興味のシステムに関する情報がない場合広い潜在的な範囲は使用される (+0.6 V 対彼女に-0.55) をする必要があります。調査の下でシステムに基づく範囲を微調整する試行錯誤手法を使用できます。潜在的なゲート、として定義されます。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq1.jpg"> EDはドレイン電極の潜在性、ESはソース電極の潜在性。使用されるゲート電位の範囲は、要件および興味の特定のシステムの制限事項によって制限されます。18 注: これらのプロセスは、バイオ フィルムを損傷することとして、酸素と水素の進化になりますソース ・ ドレイン電位を避けるべき。</li>
		<li>ソースからドレインにフィルムを通して電子輸送の原動力として使用、ソース ・ ドレイン間電圧 (VSD) を決定します。ソース ・ ドレイン間電圧、として定義されます。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq2.jpg"> 注:、VSDに比例して私のSDは、ソース ・ ドレイン間電圧を十分に小さくなければなりません。17
</li>
		<li>EGはシステムで各ゲート電位の定常状態で近似できるので、私はSDの独立した時間と線形変更されたスキャン レート (v) を選択します。 注: より小さい 0.002 V/秒のスキャン レートは生物学的システムのよく使用されます。29,30
</li>
		<li>ゲートの測定を実行する bipotentiostat ソフトウェアをセットアップ (すなわち掃引ゲート潜在的な) 選択範囲、選択したソース ・ ドレイン間電圧、上記の考慮事項に基づいて目的のスキャン率。 注: g. sulfurreducens、17,19 EGを使用した前のゲート測定の (彼女)、対 0.6 V まで-0.55 V = VSD = 0.01 V または 0.1 V、v = 0.001 V/s。EG Biocathode MCL の = 0.25 V (彼女)、対 0.7 V を VSD = 0.002 V は、v = 0.0002 V/s。<ol>
<li>さらに、VSDとベースライン測定を実行 = 0.000 V (すなわち、同時に撮影した各個々 の電極で CV) 3.1.3 のステップで選択した同じ v で。</li>
		</ol>
</li>
		<li>3.1.4 (水溶性の電子供与体と受容体の存在) の両方の売り上げ高の下で条件と非回転率 (水溶性電子供与体や受容体) なしの条件を使用してゲートの測定を実行します。 注: 非回転条件が有利な測定は酸化や細胞代謝の可溶性化合物の還元によって隠されていないので後使用条件に関係なく同様の結果を得ることが必要バック グラウンド電流 (3.1.8 の詳細) を減算します。<ol>
<li>電極の細菌の増殖の使用として同じ原子炉媒体を使用して売り上げ高の条件を達成します。この媒体には、 g. sulfurreducens、17またはアクセプター Biocathode MCL の酸素などの酢酸などの水溶性の電子供与体が含まれています。</li>
			<li>水溶性電子ドナーやアクセプタを省略すると、同じの原子炉媒体を除き、電極の細菌の増殖に使用することによって非回転条件を達成します。ポテンショスタットがオフであることを確認、したら無菌培地を削除し、陽極システム用電子供与体やカソード用アクセプターなし新鮮な培地で追加します。また、連続的な流れのシステムはゆっくりと nonturnover 条件の目的の中でメディアの交換を設定できます。 注: 場合、酸素 (biocathode MCL) は水溶性の電子アクセプター、sparge ~ 15% CO2と 85% N2 (または媒体で正しい pH を維持するガスの混合物) の混在するシステム。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ゲートの測定が完了したら、再 (2.2.2 と同じ値を使用して) を安定させるためのシステムを許可するように潜在的な成長に戻る各電極の電位を設定するのにポテンシオスタット ソフトウェアを使用します。</li>
		<li>上記のすべての条件が満たされた場合 (私SD v とは無関係ですが、VSDに比例) 前述31として次の方程式を用いた電気伝導SD値を変換私 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq4.jpg">
</li>
		<li>ここで G はコンダクタンスと S スケール ファクターはシステムに依存し、電極サイズ、ギャップ サイズ、およびバイオ フィルムの高さなどの変数の要因です。特定のシステムは、あらかじめ決められた方程式から S を決定できます。31また、S で計算できます数値モデリング ソフトウェア詳細として以前。17
</li>
		<li>形状と伝導電流の大きさを識別するためにバック グラウンド電流を減算します。VSDで発生する電流を引くか =0.00 V VSDで生成された、現在から 0.01 V または VSDで生成する現在のソースからドレインを電流を引く削除いずれかメソッド バック グラウンド電流で、残して (動) 0.01伝導の電流だけ。</li>
	</ol></li>
	<li>温度依存の電気化学的ゲーティング測定
	<ol>
<li>興味の温度の範囲を決定します。この範囲、しかし生理学的関連性の高い温度を使用する必要があります調査の下でシステムに大きく依存。 注: 以前の研究は中温微生物の生理学的条件下での電子輸送の研究に 10 ° C ~ 30 ° C の温度範囲を使用しています。17
</li>
		<li>循環式水槽や原子炉温度とセット ポイントと媒体の実際の温度が同じであることを確認するコントロールの原子炉を規制するインキュベーターを取得します。<ol>
<li>井田はどこにある温度計か熱電対を制御原子炉に配置します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>私の売り上げ高の下で選択した温度および nonturnover (3.1.5 の手順で説明します) の範囲 (3.1.4 参照)SD測定を行う条件を以下の 2 つの手順のいずれか、次の bipotentiostat を使用します。<ol>
<li>(3.1 参照)、上記私の EG曲線対SDを生成興味の温度範囲にわたって各温度の。G. sulfurreducensと Biocathode MCL, 各温度からピーク電流を使用して、私の T 依存性対SDを決定など、導電性酸化還元を展示材料。 注: このメソッドは、完全私 EG対SDは各温度のカーブが、2 番目のオプションより多くの時間を必要がありますを生成する使用は。</li>
			<li>代わりに、設定を押し実施の最大の収穫で潜在的なゲート IDA 現在、bipotentiostat を使用して (私のSDから得られる対 EGカーブ、ステップ 3.1.4) しながら bipotentiostat を使用して最大の伝導電流を記録温度が温度水浴やインキュベーターのオンボードのコントロールを使用して選択範囲内の循環します。 注: ここでは、電極/原子炉ジオメトリを持つ私SDと T が安定するまで少なくとも 20 分・平均私はSDを安定のため、各温度に使用されます。もっとまたはより少なく安定時間必要があります特定のシステムに基づきます。このメソッドは、最初のものより高速ですし、バイオ フィルムに少ないストレスの原因します。ただし、完全ゲーティング曲線は生成されません。</li>
			<li>他に 1 つのセット ポイントから温度をサイクルし、オンボードのコントロールを使用して、再度バックアップ孵卵器の温度を確保することへの反応の可逆性を決定するため風呂の水循環に害のないバイオ フィルム。</li>
		</ol>
</li>
		<li>インキュベーターまたは水浴のオンボードのコントロールを使用して正常な成長温度に温度をリセットでき、システムを安定させます。 注: 酸化還元コンダクターの私のSDと 1/T のデータが適合するアレニウス率式で次のように活性化エネルギーの計算を可能にします。 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq6.jpg"> 場所 E、隣接する酸化還元補因子とkとの間の電子移動の活性化エネルギーはボルツマン定数。</li>
	</ol></li>
</ol>

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著者が明らかに何もありません。

IDA のセットアップ中に、ソースとドレインを短絡していない一緒に電気化学のゲート計測前に EGカーブ対私にSDを変えるし、誤った結果と解釈につながるテストに不可欠です。また、現在が線形的 VSDに依存し、v の独立になるよう VSDと v を選択する重要です。そうでない場合は、伝導率を計算する上記方程式を利用することはできません。
少なくとも 2 つのバック グラウンド電流を考慮、電流計測を実施から削除する必要があります。最初のゲートの電位を掃引として酸化還元補因子のファラデー充電/放電のため現在の背景です。レドックスの電極表面に接続されている電気的アクセスされる補因子の量現在背景が大きく影響します。第二の背景現在、二重層キャパシタです。現在 3 番目のバック グラウンドは、代謝電子アクセプタ/ドナー細胞の売り上げ高によるものです。この背景の現在のみ売り上げ高条件の下で適用されます。本研究ではバック グラウンド電流が VSDで得られた電流から現在のソースを減算することによ...

細胞外の電子輸送 (EET) は特定の微生物の細胞内の代謝プロセスと不溶性の電子アクセプターやドナーから天然ミネラルを細胞外に存在する電子を輸送することができるプロセス電極。いくつかのケースでは、EET は、電極との直接接触ではなく細胞まだそれを利用できる代謝電子アクセプターやドナーとして、電極表面に導電性複数セル厚バイオ フィルムを形成する微生物を使用できます。7,8,9ストレージとリモート エネルギー生成不純物検出/除去、微生物ポリパラフェニレンなど様々 な用途のための電極触媒としてこのようなバイオ フィルムが注目されて ,10、11,12,13,14 のため微生物と微生物バイオ フィルムと比較しての耐久性によって実行される代謝過程の多様性酵素ベースの bioelectrodes。15,16また、EET 経路自然発生した電気制御または信号の変更に利用できる可能性がありますまたは、たとえば、目的の製品または検出の生産に関与する微生物の代謝過程を遺伝子組み換えターゲット analyte の刺激。他の生物学的材料から離れてそれらをセット、電極触媒のバイオ フィルムの電気伝導度は、電極触媒特性の中央部分で、まだ少しは電極では、基になる EET プロセスについて理解知られているが、競合の多い。17,18,19,20,21,22,23,24
櫛型電極アレイ (IDAs) を用いた生活、電極製のバイオ フィルムを通して電気伝導度を測定するため 2 電極法は、ここで説明しました。その結果の配列の両側に接続されているすべての他のバンドにフラットなガラス面に関連する並列長方形電極から成っている IDAs (ソースおよびドレイン) 2 つの電極の。慎重に審査、井田 (例えば、見なさい ref #1 の図 6.12b) 前後 2 つの電極を分離するアレイ全体を編む 1 つのギャップ形成するような方法で接続されている隣接するバンドを分離するギャップはまた明らかにします。結果は長くて狭いギャップ導電性材料が形成、キャスト、重合、または配列 (ここでは考慮するバイオ フィルムのタイプ) の場合成長してとき非常に高いソース-ドレイン電流を降伏、ソース ・ ドレイン電極を分離することです。さらに、電極のサイズが小さいが小さな背景する導電性材料の量が必要なので、潜在的なゲートの変更導電性材料の酸化状態の変化と静電容量の充電のために現在の結果します。IDAs を用いた測定はとても小さいです。井田ベースの技術は薄膜導電性ポリマーの特徴を開発電気化学的ゲーティング紹介、2,3,4,25はごく最近生きているシステムに適用されています。18生活バイオ フィルムの電気伝導度を測定するために使用する別の手法は、分割ソース ・ ドレイン電極とソース メートル潜在的なゲートを設定する大規模な形式を利用されています。26,27しかし、これらのメソッドに対する懸念が詳述されている以前。18
以下のプロトコルは、リビングの電気伝導度測定を行うと私たちの経験をカプセル化しますGeobacter sulfurreducensと biocathode の MCL バイオ フィルム。G. sulfurreducensは唯一代謝電子受容体として電極を含む不溶性材料を使用することができる有機体を減らすモデル電極です。また、陽極細胞外長距離電子移動の研究に理想的なモデル生物となって、複数のセルの長さ以上の電子を輸送することができるバイオ フィルムの厚さを形成します。我々 は、biocathode MCL, 底生微生物燃料電池のカソードから分離された好気性独立栄養混合コミュニティ バイオ フィルムの調査のための詳細も含めます。(3 つの主な成分- Marinobacter、 Chromatiaceaea 、 Labrenziaの名前) Biocathode MCL はその唯一の電子供与体として電極の酸化、複数のセルの長さで電子を運ぶことができることそれを勉強する興味深い防食システム。さらに、biocathode MCL が生活システムのこれらのメソッドを使用して日付への最も高い報告された伝導率です。このプロトコルではこれらの多様な電子活性バイオ フィルムの包含は、この方法がすべて生きているバイオ フィルムの電気電極と対話することを通して電子の輸送現象を計測に適用されることを強調するものです。

<table><tbody><tr><td>IDAs</td><td>CHインスツルメンツ</td><td>012125</td><td>ALS-Japan製 販売元 CHインスツルメンツ</td></tr>社 <tr><td>Wire</td><td>Digikey</td><td>W7-ND</td><td></td></tr><tr><td>導電性銀エポキシ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>12670-EE</td><td></td></tr><tr><td>絶縁材料</td><td>3M</td><td>2131-B</td><td>スコッチャスト難燃剤</td></tr><tr><td>15mL 円錐形遠心管</td><td>VWR</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>21g針</td><td>VWR</td><td>BD-305165</td><td></td></tr><tr><td>5 mLピペットチップ</td><td>VWR</td><td>82018-842</td><td></td></tr><tr><td>5 mLピペット</td><td>VWR</td><td>89079-976</td><td></td></tr><tr><td>淡水媒体成分</td><td>Sigma Aldrich</td><td>すべての標準的な実験用化学薬品</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;塩化</td><td></td><td></td><td></td>アンモニウム</tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;リン酸ナトリウム一塩基性</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;重曹</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人工海水 中型成分</td><td>Sigma Aldrich</td><td>すべての標準的な実験室用化学薬品</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;塩化</td><td></td><td></td><td></td>ナトリウム</tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;塩化マグネシウム六水和物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;硫酸マグネシウム七水和物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;塩化</td><td></td><td></td><td></td>カリウム</tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;重炭酸</td><td></td><td></td><td></td>ナトリウム</tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;塩化カルシウム二水和物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;塩化</td><td></td><td></td><td></td>アンモニウム</tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;リン酸カリウム二塩基性</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl参照電極</td><td>Basi</td><td>MF-2079</td><td></td></tr><tr><td>グラファイトロッド対電極</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70230</td><td></td></tr><tr><td>再循環水浴</td><td>Thermo Scientific</td><td>152-5256</td><td></td></tr><tr><td>Bipotentiostat</td><td>Pine Instruments</td><td>WD-20</td><td>http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user</td></tr><tr><td>攪拌子</td><td>VWR</td><td>58947-114</td><td></td></tr><tr><td>G.硫黄還元剤培養</td><td>ATCC</td><td>51573</td><td></td></tr><tr><td>ジャケット付き原子炉</td><td>松器械</td><td>RRPG085</td><td></td></tr></tbody></table>

生きているバイオ フィルムにおける電子輸送特性評価

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

ここで関連する生理学的条件下で電極成長細菌によるバイオ フィルムの電気伝導性を特徴付けるために使用して電気化学的ゲーティング法を示します。1これらの測定値は水溶液中にソースを使用して生きているバイオ フィルムに対して実行され、ドレイン電極の櫛型電極 (IDA) 配列と呼ばれる特殊な構成でガラス表面のパターンします。バイオ フィルムは、ソースとドレインを接続するギャップを横切っている栽培されています。電位 (ESと ED) 電極に適用される電極間バイオ フィルム (ISD) ソース ・ ドレイン間の電流を生成します。ゲート電位に電気伝導度の依存性 (EGソース ・ ドレイン電位の平均値 = [ED + ES]/2) 体系的に潜在的なゲートを変更して結果のソース ・ ドレイン間の測定によって決定されます現在の。潜在的なゲートで導電性の依存関係は、機構調査中特定のバイオ フィルムの電気伝導率の基になる細胞外の電子輸送過程についてを説明します。ここで説明、電気化学的測定法の基づく M. S. Wrighton2,3と同僚と r. w. マレー4,5,6の同僚によって使用に直接1980 年の薄膜導電性高分子を調査します。

IDAs いた有線、絶縁および 2 つの電極がお互い (図 1) から電気的に絶縁を確認するテストします。原子炉完成、 g. sulfurreducens、接種、バイオ フィルム、電極間のギャップを橋渡しするまでインキュベートしました。G. sulfurreducensバイオ フィルムは配列をカバーすることを視覚的に見ることができます。他のバイオ フィルムは、研究者は 2 つの電極を電気的に接続されているかどうかを電気化学的ゲーティング測定を行う必要があります。配列の電極との間の接続を確認する顕微鏡を使用もする必要があります。電気化学的ゲーティング実験は EG (図 2) 私はSDの依存性を決定するため行われました。生活映画の伝導性ゲーティングの実験で測定実施の電流を使用して計算されます。精度とこれらの測定値の精度が高い信号対雑音比井田構成可能のため高かった。私はS...

生理学的に関連する条件の下で生きている細菌によるバイオ フィルムの電気伝導率測定のためのプロトコルが表示されます。

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

この実験手順の全体的な目標は、その場で生体材料を介して伝導できる電流の量と、その電流を輸送するために生体材料が採用するメカニズムを決定することです。この方法は、特定のバイオフィルムがどのようにして電子を数百ミクロン以上移動させて細胞代謝をサポートすることができるかなど、微生物電気化学の分野における重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この手法の主な利点は、インターディジット電極が非常に高いS/N比を提供し、多くの異なるリアクタ構成に適合するようにスケーリングできることです。これらの方法は、バイオフィルム中のマルチセル長の細胞外電子輸送に関する洞察を提供します。また、導電性ポリマーフィルムなどの他のシステムにも適用できます。この方法に不慣れな研究者は、両方の電極の電位を別々に設定し、各電極の電流を別々に測定するためにバイポテンショスタットが必要なため、苦労するでしょう。まず、非導電性基板上にパターン化された市販のIDA電極を入手するか、標準的なリソグラフィー法を使用してそれらを合成します。製造元の指示に従って、ミキシングロッドまたはピペットチップを使用して導電性銀エポキシを準備します。次に、各金色のパッドにワイヤーを配置し、ラボテープを使用して所定の位置に固定します。ミキシングロッドまたはピペットチップを使用して、ワイヤーとパッドを銀エポキシで覆います。装置を摂氏80度のオーブンに慎重に動かして1時間硬化させます。エポキシ樹脂が硬化したら、マルチメータを使用して、ワイヤの端とパッドの間の電気伝導率を確認します。ワイヤとパッドの間の抵抗は5オーム未満である必要があります。また、マルチメータを使用して、導電性エポキシが複数の電極パッドを接続していないことを確認します。これは、アレイが短絡する可能性があるためです。導電性エポキシが複数のリード線を接続している場合は、スクライブを使用してリード線を分離します。次に、15ミリリットルの円錐形遠心チューブの先端を取り外して、断熱材の型として使用します。21ゲージの針を使用して、ワイヤーが突き出るように、金型の底に2つの小さな穴を開けます。IDAを金型に挿入し、金型の底の穴にワイヤーを挿入します。次に、熱電気および防水絶縁材料を準備します。難燃性ポリウレタン樹脂が適していることがよくあります。インシュレーターを型にピペットで入れて、銀エポキシが完全に覆われ、メーカーの仕様に従ってインシュレーターが乾燥するようにします。電気化学セルをセットアップするには、IDA、対電極、および参照電極を電気化学セルに挿入します。バイオフィルムの成長に適した滅菌培地で電気化学セルを充填します。Geobacter sulfurreducensには、フマル酸塩を除く淡水培地を使用してください。次に、電極をバイポテンショスタットに接続します。一方のIDA電極を作動リード線1本に接続し、もう一方のIDA電極を作動リード線2本に接続し、参照電極を参照リード線に、カウンター電極をカウンターリード線に接続します。電極1でサイクリックボルタンメトリーを実行し、電極2を開回路で保持して、電極が接続されていないことを確認することにより、制御実験を実行します。関連する電気活性バイオフィルムを成長させるには、標準的な無菌微生物学的技術を使用して、所望の電気化学的に活性な微生物のストック培養または濃縮から電気化学反応器に接種します。標準試験では、接種物と反応器の容量を1対20の比率で接種します。反応器内の攪拌を所望のレベルに設定し、インキュベーターまたはウォーターバスを目的のバイオフィルムの成長条件に基づいて所望の温度に設定します。対象微生物の特定の要件に基づいて、バイオフィルムが2つの電極を隔てるギャップを埋めるまで、システムをインキュベートします。静止Geobacter sulfurreducensバイオフィルムの場合、摂氏30度で7〜10日間インキュベートします。テキストプロトコルで説明されているように、ゲーティング測定の現在の電位依存性を決定するために使用される実験パラメータの設定を開始します。バイポテンショスタットソフトウェアをセットアップして、選択したソースドレイン電圧と目的のスキャンレートで選択した範囲でゲーティング測定を実行します。さらに、テキスト プロトコルで説明されているようにベースライン測定を実行します。ターンオーバー下で同じ条件を使用して、可溶性電子供与体またはアクセプターが非ターンオーバー状態で存在し、可溶性電子供与体またはアクセプター条件なしでゲーティング測定を行います。制御リアクターを入手して、媒体の設定値と実際の温度が同じであることを確認します。IDAがある制御リアクターに温度計または熱電対を置きます。次に、バイポテンショスタットを使用して、ターンオーバー条件と非ターンオーバー条件で選択した温度範囲でソースひずみ電流を測定します。これを行うには、バイポテンショスタットを使用して、IDAを最大伝導電流が得られるゲート電位に設定し、保持します。ビポテンショスタットを使用して最大伝導電流を記録し、その間、ウォーターバスまたはインキュベーターのオンボードコントロールを使用して選択した温度範囲間で温度を循環させます。温度を1つの設定値から別の設定値に循環させ、インキュベーターまたはウォーターバスのオンボードコントロールを使用して戻します。これにより、温度サイクルがバイオフィルムに害を及ぼさないように、反応の可逆性が決まります。最後に、温度を通常の成長温度にリセットし、システムを安定させます。ここに示されているのは、淡水媒体で適切に機能しているIDAの代表的な結果です。一方、電極が短絡しているもの。Geobacter sulfurreducensバイオフィルムに対して、ソースひずみ電圧が10ミリボルトの非ターンオーバー条件下で実施された代表的な電気化学的ゲーティング測定は、酸化還元伝導性の特性であるピーク形状の伝導電流対ゲート電位曲線を示します。ここで、代表的な生データは、伝導電流が反応器媒体の温度に依存することを示しています。温度の低下に伴う伝導電流の減少も、酸化還元導体の特徴です。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約2日で完了します。この手順を試みる際には、原子炉に接種する前にIDAバンドが短絡していないことを確認することを忘れないでください。この技術の意味は、バイオフィルム形成病原体の細胞代謝を妨害する方法を研究するために適用すると、治療にまで及びます。この手順は、バイオフィルムのrefologyと導電率の相関関係などの追加の問題に対処するために、電子を輸送できる任意の生体材料に適用できます。

characterizing-electron-transport-through-living-biofilms

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

出典:Tokunou, Y. ら、『Shewanella oneidensis MR-1における細胞外電子輸送における重水素の動態同位体効果の電気化学的検出』。J. Vis.

電気化学反応器を用いた細菌単分子層バイオフィルムの発生

バイオフィルム内の3つの細胞および細胞外成分の同時定量と比較のためのプロトコルが提示されます。この方法論には、共焦点レーザー走査型顕微鏡、バイオフィルム構造解析および視覚化ソフトウェア、および統計解析ソフトウェアの使用が含まれます。...

バイオフィルムの細胞内および細胞外成分の同時定量(英語)

ポテンショスタットによって制御される3電極セットアップを使用したフェッドバッチリアクターでの陽極電気活性微生物バイオフィルムのクロノアンペロメトリック成長が実証されています。細胞外電子移動は、電子供与体の存在下および電子供与体の存在下でのサイクリックボルタンメトリーを用いて特徴付けられます。基本的なデータ分析が実証されています。...

廃水由来の電気活性微生物バイオフィルム:成長、維持、および基本的な特性評価

この方法の論文の目的は、典型的にはヒト歯肉縁上の歯垢内で識別種を含む多種バイオフィルムの開発のための微小流体システムの使用を説明することである。バイオフィルムのアーキテクチャ、バイオフィルムの生存率、および文化に依存またはカルチャに依存しない解析が強調表示されるための収穫バイオフィルムへのアプローチを記述するための方法。...

ハイスループットの使用<em&gt;インビトロ</emオーラル多種バイオフィルムを開発するために&gt;マイクロ流体システム

バイオフィルムは、周囲の環境と複雑な相互作用を持っています。バイオフィルムと環境の相互作用を包括的に研究するために、バイオフィルム開発のための不均一な化学環境を作り出すための一連の方法、局所的な流速の定量化、およびバイオフィルムコロニー内および周囲の物質輸送を分析するための一連の方法を紹介します。...

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

この研究は、バイオフィルム阻害剤とそのBacillus...

研究のための方法論<em&gt; B。枯草菌</em小分子バイオフィルム阻害剤を特徴付けるためのモデルとしての&gt;バイオフィルム

マイクロ流体リアクター、液体真空界面解析システムにより水和状態の化学マッピングのための in situ飛行時間二次イオン質量分析のためのバイオ フィルムの成長のための手法を提案します。緑色蛍光タンパク質を持つシェワネラ oneidensis氏 1...

その場でサルヴィ、TOF-SIMSシェワネラ oneidensis MR1 バイオ フィルムの特性

ここで全細胞外膜シトクロムシェワネラ oneidensis氏-1 複合体を介して細胞外の電子輸送の速度へのプロトン輸送の貢献を研究する電気化学実験のプロトコルを提案する.

電気化学検出の重水素速度論的同位体効果シェワネラ oneidensis氏 1 の細胞外電子輸送

視覚的クラスタ リングと組み合わせてフローサイトメトリー水生バイオ フィルムを研究するための使いやすい高速メソッドを提供しています。バイオ フィルムの特性評価、バイオ フィルムのコミュニティ構造の変化の検出とバイオ...

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

ここでは、3電極、2チャンバーの生体電気化学システムを使用して、乳酸菌の媒介細胞外電子移動(EET)を特徴付けるためのプロトコルを紹介します。この方法を Lactiplantibacillus plantarum...

乳酸菌における媒介細胞外電子移動の特性評価 3電極2チャンバー生体電気化学システムによる

学ぶ 生きた微生物バイオフィルムの電気伝導性測定法。インターディジテート電極を用いて電子輸送メカニズムを解明し、微生物電気化学研究に貢献します。

生きているバイオフィルムにおける電子輸送特性評価

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