RNAの測定方法 N 6 -methyladenosine変更
2016年12月5日
N 6 -methyladenosine（メートル6 A）RNAに修飾を測定するための修正されたノーザンブロット法が記載されています。現在の方法は、様々な実験デザインの下で多様なRNAおよびコントロールで変更を検出することができます。
修正ノーザンブロッティング技術の全体的な目標は、RNAのN6-メチルアデノシン、n6A修飾を測定し、多様なRNAの修飾を検出することです。この方法は、N6-メチルアデノシン修飾などのRNAエピジェネティクスの役割における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、RNAの効果的な分離、実験デザインの標準化、およびRNAのn6A修飾の明確な描写を提供することです。
この方法は、RNAのn6A修飾に関する洞察を得ることができ、異なる検出抗体を持つ他のRNA修飾にも適用できます。実験を開始するには、リボヌクレアーゼ除染液をペーパータオルにスプレーし、ピペットと実験ベンチの表面を拭きます。ペーパータオルをヌクレアーゼフリーの水で濡らし、ピペットとラボベンチの表面を再度拭き取ります。
摂氏4度に維持されたRNA単離溶液を入手し、約75ミリグラムのマウス組織に1ミリリットルの溶液を加えます。オーバーヘッドスターラーを使用して、組織を均質化します。次に、サンプルホモジネート1ミリリットルあたり100マイクロリットルの1-ブロモ-3-クロロプロパンまたはBCPを追加します。
チューブを15秒間激しく振とうし、全RNA単離に進みます。分光光度計を使用して、260ナノメートルと280ナノメートルの吸光度に注目してRNA濃度を決定します。0.8%アガロースゲル電気泳動を行い、RNAサンプルの品質を確認します。
すべての電気泳動装置をジエチルピロカーボネートまたはDEPC水ですすいでください。2.5グラムのアガロース、次に215ミリリットルのDEPC水を三角フラスコに混ぜ合わせ、混合物を電子レンジで完全に溶かします。溶液が溶けたら、12.5ミリリットルの10X MOPSバッファーを追加します。
そしてフラスコに37%ホルムアルデヒドの22.5ミリリットル。次に、厚さ1.5ミリメートルの櫛で溶液を電気泳動装置に注ぎます。きれいなコームを使用して、気泡をゲルの端に押し込みます。
ゲルを室温で固化させます。次に、あらかじめ調製した1X MOPSランニングバッファーを使用してゲルのウェルをすすぎ、ゲルを事前にランします。RNAサンプルをゲルのウェルにロードし、ゲルを泳動します。
翌日、UVライトの下でゲルを調べて撮影します。転写を準備するには、ゲルをカットし、未使用の部分を取り除きます。500ミリリットルの10倍生理食塩水クエン酸ナトリウムまたはSSC緩衝液を調製します。
ゲルを10X SSCバッファーで2回洗浄します。ゲルを覆うのに十分な大きさの濾紙シートを1枚カットします。ろ紙をジェルと同じ大きさに4枚カットします。
次に、プラスに帯電したナイロンメンブレンをゲルと同じサイズに1枚カットします。ゲルとメンブレンに切り込みを入れてマーカーとして印をつけ、適切な向きを確保します。メンブレンを2X SSCバッファーに浸します。
500ミリリットルの10X SSCバッファーをトランスファートレイに注ぎます。大きな濾紙シートをガラスプレートの上に置き、濾紙を転写バッファーで濡らします。次に、ピペットを使用して気泡をロールアウトします。
カット済みの濾紙2枚を転写バッファーに浸し、濾紙の中央に置きます。気泡があれば取り除きます。次に、ゲルの上面を下にして濾紙の上に置き、ゲルとメンブレンのノッチを揃えながら、ゲルの上にメンブレンを置きます。
次に、あらかじめカットした濾紙を2枚、メンブレンの上に置きます。レイヤー間の気泡をすべて取り除きます。ジェルにラップを巻き付けて、タオルがゲルとメンブレンを通過する緩衝液のみを吸収
するようにします。次に、濾紙の上にペーパータオルを積み重ねます。タオルの上に特大のガラスプレートを置き、スタックの上に重りを置き、RNAがゲルからメンブレンに一晩移動するのを待ちます。転写後、メンブレンを2X SSCバッファーで湿らせてください。
2枚の濾紙を10X SSCバッファーに浸し、UVクロスリンカーにセットします。RNA吸収面が上を向いていることを確認し、濾紙の上にメンブレンを置きます。オートクロスリンクモードを選択し、スタートボタンを押すと照射が開始されます。
UVゲルイメージキャッチャーでメンブレンとゲルを検査し、ゲルからメンブレンへのRNA移動を確認します。TBSTバッファー中の5%脱脂乳でメンブレンを室温で1時間ブロックします。メンブレンをm6A抗体溶液で摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、TBSTバッファーでメンブレンを3回15分間洗浄します。次に、メンブレンをHRP標識ロバ抗ウサギ抗体溶液に室温で1時間インキュベートします。1時間後、TBSTバッファーでメンブレンを3回15分間洗浄します。
強化された化学発光基質を塗布します。デジタルイメージャーで化学発光をキャプチャします。最後に、m6Aの定量に移り、画像を使用して相対的なm6A化学発光強度を測定します。J.Mouse肝臓RNAを4時間間隔でサンプリングし、修正ノーザンブロッティング法で研究しました。
rRNA、mRNA、およびsmall RNAのメチル化が明確に検出されました。代表的なm6Aブロットは、野生型マウスの肝臓由来の全RNAおよびrRNAを含まない全RNAに対して行いました。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば4日で習得できます。
その開発後、この技術は、RNAエピジェネティクスの分野の研究者が概日リズムと肥満に関連するヒトの生理機能への影響を調査する道を開きました。
概要
本記事では、RNA中のN6-メチルアデノシン（m6A）修飾を測定するための、改良型ノーザンブロッティング法について解説します。本手法により、多様なRNAサンプルにおける修飾の検出が可能であり、さまざまな実験デザインに適用できます。
研究の主要構成要素
科学分野
- RNAエピジェネティクス
- m6A修飾
- 実験手法
背景
- N6-メチルアデノシンは重要なRNA修飾である。
- RNA修飾を理解することは、遺伝子調節に関する知見を得るために極めて重要である。
- m6Aを検出する現在の手法には限界がある。
- 本改良手法は、検出および解析の向上を目的としている。
研究目的
- RNAにおけるm6A修飾を検出するための信頼性の高い手法を開発すること。
- RNAエピジェネティクスへの理解を深めること。
- さまざまな実験デザインに適用可能な標準化されたアプローチを提供すること。
使用した手法
- マウス組織からのRNA抽出。
- RNA品質評価のための電気泳動。
- ナイロン膜へのRNA転写。
- m6A抗体および化学発光を用いた検出。
主な結果
- rRNA、mRNA、およびsmall RNAにおけるm6A修飾の検出に成功。
- さまざまなRNAサンプルにおけるm6A修飾の明確な記述。
- 本手法は4日間で効率的に実施可能。
結論
- 改良されたノーザンブロッティング法は、RNA修飾の研究に有効です。
- この手法は、RNAエピジェネティクス研究の新たな道を切り開きます。
- 潜在的な応用例として、概日リズムや肥満に関する研究が挙げられます。
よくある質問
産業上の重要性
RNAのN6-メチルアデノシン（m6A）修飾を正確に測定することは、エピトランスクリプトーム制御の定量的な評価を可能にし、RNAエピジェネティクスにおけるターゲットバリデーションを強力に支援します。本手法は、m6Aと概日リズムや代謝などの生理的プロセスを結びつけるメカニズム研究において、予測の信頼性を向上させます。また、創薬生物学における治療仮説のリスクを低減するための、標準化され再現性のあるプラットフォームを提供します。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：m6A依存的なRNAの安定性、翻訳、およびスプライシングの解析を可能にし、遺伝子発現ネットワークにおけるエピジェネティック制御因子の機能的役割を明らかにします。
- 実用的価値：RNA種全体におけるm6Aの明確な記述を可能にし、疾患モデルにおけるバイオマーカーに関連する標的の同定を支援します。
- 予測的価値：m6Aレベルの用量反応およびタイムコース解析を容易にし、標的へのエンゲージメントおよびパスウェイ調節における信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 実験条件間の比較解析を可能にする、高解像度イメージングに対応した定量的化学発光読み取り値を生成します。
- 運用の価値： ナイロンメンブレンと抗体ベースのプローブによるRNA転写および検出を標準化し、修飾プロファイリングにおけるばらつきを低減します。
- アッセイの準備状況： 修飾RNAと非修飾RNAコントロールの直接的な比較を可能にし、エピジェネティック・スクリーニング・キャンペーンにおけるアッセイのバリデーションをサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：肝臓RNAにおけるm6A動態を代謝および概日表現型に結びつけ、前臨床モデルにおけるトランスレーショナルバイオマーカーの探索を支援します。
- 運用的価値：生理学的リズムに関連する時間的修飾パターンを捉えるため、縦断的なサンプリング（例：4時間間隔）を可能にします。
- リスク軽減：RNA修飾測定における曖昧さを軽減し、標的バリデーションワークフローにおける再現性を向上させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、転写およびプロテオミクスプロファイリングを補完するエピジェネティック層の検証を提供することにより、ディスカバリーバイオロジーからリード同定に至るまでの連続的なプロセスに適合します。
- 発見生物学： RNAにおける修飾状態を直接測定することにより、m6Aライター、イレーサー、およびリーダーの仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： 細胞ベースまたは組織由来のシステムにおいて、エピトランスクリプトミック標識に対する化合物の影響を評価するための、標準化された定量的なアウトプットを提供します。
- 分析： 画像ベースのm6Aシグナル強度の定量化を可能にし、処理群間または遺伝的背景間での統計的比較を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ： RNAにおけるエピジェネティックな変化を生理学的結果に結びつけ、バイオマーカーに基づいた前臨床段階の進展をサポートします。
- 企業内での再利用： さまざまなRNAタイプや修飾特異的抗体に適応可能であり、複数のエピジェネティックターゲットや疾患領域にわたる再利用が可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 修飾特異的な直接検出により、RNAエピジェネティック標的のメカニズム的なリスク低減を実現する。
- 運用の価値： 転写、ブロッキング、検出の各ステップを定義した標準化ワークフローにより、ラボ間の再現性を確保する。
- 戦略的価値： 疾患関連パスウェイにおけるm6Aの機能的な関連性を明確にすることで、go/no-go判断の根拠を提供する。
- ポートフォリオへの影響： 定量可能な修飾ダイナミクスに基づき、エピジェネティック標的のリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- RNAの取り扱い、電気泳動、および免疫ブロット技術に関する専門知識が必要です。
- 使用機器には、UVクロスリンカー、デジタルイメージャー、およびRNA定量用の分光光度計が含まれます。
- チーム間での標準化には、DEPC処理溶液の一貫した使用と、制御された転写条件が必要です。
- 他のRNA修飾への適応は、特定の修飾を認識する抗体の入手可能性に依存します。
- 実用上の制限として、RNA分解のリスクや、抗体インキュベーションおよび洗浄条件の最適化の必要性が挙げられます。
