Name: RNAの測定方法 N 6 -methyladenosine変更 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶ ノーザンブロッティング法を用いたRNAのN6-メチルアデノシン修飾の検出方法。マウス組織からのRNA分離、電気泳動、化学発光検出により、rRNAやmRNAのm6A修飾を効率的に測定できます。

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C.Y.W. は、国立衛生研究所 (NHRI-EX101-9925SC)、国立科学会議 (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009)、長公記念病院 (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091, CMRPG3C1763) から支援を受けました。

注：6レベルのrRNA、mRNAの、および他の小RNAを含むトータルRNAメートル。リボソームRNAが豊富メートル6 Aの変更を持っているので、メートルの測定6 Aレベルは、この事実を考慮する必要があります。 1. RNAの単離<ol><li> （ペーパータオル上に噴霧）リボヌクレアーゼ除染液を使用して、ピペットと実験台の表面を拭いてください。ヌクレアーゼフリー水で濡れた紙タオル、再びピペットおよび実験台の表面を拭いてください。 </li><li> RNA抽出<ol><li>全RNA単離<ol><li>オーバーヘッド撹拌機を用いて、4℃に維持し、RNA単離溶液1mLに組織の50~100ミリグラムまたは5~10×10 6個の細胞をホモジナイズします。 注：その他の組織（100-150 mg）をため、その中に低いRNA濃度のマウスからの脂肪組織サンプルのために必要となる場合があります。サンプルは、マウスの心臓、肝臓、骨格筋、肺、脳から供給、およびマクロファージは、以前4採用されています。 </li><li>に室温で5分間、試料ホモジネートをcubate。 </li><li>サンプルホモジネートの1ミリリットル当たり1-ブロモ-3-クロロプロパン（BCP）の100μLを加えます。 15秒間激しくチューブを振ると、製造元の指示24に従って全RNAを単離するために進んでください。 </li></ol></li><li>単離された全RNAからポリアデニル化mRNA精製<ol><li>入手可能なキットまたはプロトコルを使用してポリアデニル化mRNAを精製します。 <ol><li>次の各溶液を再懸濁するために徹底的に振る：結合液、オリゴ（dT）ポリスチレンビーズ、および洗浄溶液を2倍。オリゴ（dT）は使用前に室温に戻しビーズことを確認してください。 </li><li>加熱ブロック中で70℃にチューブや熱に準備あたりの溶出溶液の120μLを転送します。 </li><li>マイクロ遠心チューブに全RNAの500μgのまでピペット。ヌクレアーゼフリー水で、250μLに音量を調整します。 </li><li>全RNAを2倍結合溶液の250μLを追加しますので、内容物を混合するための簡単リューションと渦。 </li><li>オリゴの15μLを加える（DT）ビーズと渦が完全に混合します。 </li><li> 3分間70℃で混合物をインキュベートします。 </li><li>加熱ブロックからサンプルを取り出して、それを10分間室温で放置しました。 </li><li> 2分間15,000×gで遠心分離します。 </li><li>慎重に約50μLを残す、上清を除去します。 </li><li>ピペッティングによりペレットを再懸濁するために洗浄溶液の500μLを追加します。 </li><li>スピンフィルター/コレクションチューブセットにサスペンションをピペット。 </li><li> 2分間15,000×gで遠心分離します。コレクションチューブから列を削除し、フロースルーを捨てます。コレクションチューブにカラムを返します。 </li><li>スピンフィルター上に洗浄溶液500μLをピペット。 </li><li> 15,000 xでの遠心分離 2分間グラム。 </li><li>新鮮なコレクションチューブにスピンフィルターを転送します。 </li><li>加熱された溶出液のピペット50μL70°Cにスピンフィルタの中心へ。 </li><li> 70℃で2〜5分間インキュベートします。 1分間15,000×gで遠心分離します。 </li><li>スピンフィルターの中央に70℃に加熱し、溶出液の追加の50μLをピペット。 </li><li>繰り返しステップ1.2.2.1.18。 </li></ol></li><li> 100μg/ mLのグリコーゲン、3 M酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.2）、および無水エタノールの2.5倍量の0.1ボリュームを追加します。 -80℃で一晩沈殿させます。 </li><li> 4℃で25分間、15,000×gで遠心分離します。上清を捨てます。 </li><li> 75％エタノール1mLでペレットを洗浄。 4℃で15分間、15,000×gで遠心分離します。慎重にエタノールを除去。 </li><li> 3-5分間空気中で乾燥しました。 </li><li>ペレットを溶解するためにヌクレアーゼフリー水10μLを追加します。 </li><li> -70℃で保管してください。 </li></ol></li></ol></li><li> RNA資格および定量<ol><li>分光光度計を使用して、NotIでによってRNA濃度を測定260 nmおよび280 nmの吸光度をngの。 A 260 / A 280比は1.8〜2.2でなければなりません。 </li><li> 0.8％アガロースゲル電気泳動25を用いて、RNAサンプルの品質を確認してください。 注：無傷の真核生物の全RNAは、強烈な28Sおよび18S rRNAバンドを示すべきです。良いRNA調製のための18S rRNAのバンド強度対28Sの割合は約2です。 </li></ol></li></ol> 2.ゲル電気泳動および転送注意：バッファ調製プロトコルを表1に示します。 <ol><li>ホルムアルデヒドゲル調製（1％） <ol><li>ジエチル（DEPC）水と、すべての電気機器をすすぎます。 </li><li> DEPC水215 mL中に完全に電子レンジでアガロース2.5gのメルト。 </li><li> 10倍3-（N-モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）の12.5 mLの緩衝液および37％ホルムアルデヒドの22.5 mLを加え。 </li><li> 1.5ミリメートルの厚さのくしと電気泳動装置にそれを注ぎます。 </li><li>トン気泡を排除またはプッシュきれいな櫛でのゲルのエッジに裾。 </li><li>ゲルは室温で固化することを可能にします。 </li></ol></li><li>試料調製<ol><li>サンプルバッファの全RNAの1-10μgの11.3μLを混ぜます。 </li><li>サンプルバッファの11.3μLとRNAマーカー（を1μg/μL）の2μgのを混ぜます。 </li><li> 2.2.1および2.2.2からの16μLの総容量にサンプルにヌクレアーゼフリー水を追加します。 </li><li> 5分間60℃で加熱し、次いで氷上で冷やします。 </li><li>氷の上では0.1μg/μLのエチジウムブロマイドが含まれている追跡用色素の4μL、と2.2.3からの試料16μLを混ぜます。 注意：吸入するとエチジウムブロマイドはおそらく催奇形性や毒性があります。エチジウムブロマイド安全データシートをお読みください。 </li></ol></li><li>電気泳動<ol><li> 10×MOPSの200 mLの1×MOPSランニングバッファーを作るためのddH 2 Oの1800 mLにバッファを追加します。 </li><li>ゲルのウェルを洗浄するために、1×MOPSランニングバッファーを使用してください。 </li><li>プレラントン彼は5分間、20Vでゲル。 </li><li>ゲルのウェルにRNAサンプルをロードします。 </li><li>光暴露を避けるためにホイルで覆います。約17時間（一晩）35 Vで実行します</li><li>調べ、UV光下でゲルを撮影。 </li></ol></li><li>移転<ol><li>未使用部分を除去するためにゲルをカットします。 </li><li> 10×SSC緩衝液（20×SSC緩衝液の250ミリリットルとDEPC水の250 mL）を500 mLのを準備します。 </li><li> 50 rpmで振とうしながら20分間、10×SSC緩衝液で2回ゲルを洗浄してください。 </li><li>搬送用トレイ（ 図1）から転送バッファを吸収芯紙、として機能するのに十分な大き1フィルタ紙をカットします。 </li><li>ゲルと同じ大きさにろ紙の4枚をカット。 </li><li>ゲルと同じ大きさに正に帯電したナイロン膜の1シートをカット。 </li><li>ゲル上のノッチと適切な向きを確保するためのマーカーとしての膜をマークします。 </li><li> 15分間、2×SSC緩衝液中で膜を浸します。 </li><li> 500 mLのOを注ぎますF 10倍SSC転送トレイにバッファー。 </li><li>ガラス板を横切って大きなフィルタ紙を置き、転写緩衝液で濾紙を濡らします。 </li><li>ピペットで気泡をロールアウト。 </li><li>転送バッファにプレカットろ紙の2枚を浸し、ステップ2.4.5からろ紙の中央に配置します。任意の気泡を除去。 </li><li>ろ紙上にゲルのトップ側を下にして置きます。 </li><li>ゲルの上に膜を置きます。ゲルとメンブレンのノッチを合わせます。 </li><li>膜の上にプレカット濾紙の2枚を配置し、転写緩衝液で濾紙を濡らします。 </li><li>層の間の任意の気泡を除去。 </li><li>タオルだけゲルと膜を通過バ​​ッファを吸い取ることを保証するために、ゲルの周りにラップを適用します。 </li><li>ろ紙の上にペーパータオルをスタック。 </li><li>タオルの上に特大のガラス板を置きます。 </li><li>スタックの一番上に重量を配置します。 </li><li>RNAは、膜にゲルから転送できるようにするために一晩保管してください。 </li></ol></li></ol> N 6 -methyladenosineの3検出<ol><li>膜架橋<ol><li> 2×SSC緩衝液で湿った膜を保管してください。 </li><li> UVクロスリンカーに10×SSC緩衝液で浸した濾紙の2枚を置きます。 </li><li> RNA吸着側を上に向けて、ろ紙の上に膜を配置します。 </li><li> 「autocrosslinkモード」（12万μJ）を選択し、照射を開始するために、「スタート」ボタンを押してください。 </li><li>ゲルからメンブレンへのRNA転写を確認するために、UVゲルイメージキャッチャーを有する膜およびゲルを調べます。 </li></ol></li><li>免疫ブロット法<ol><li> 1時間室温でトゥイーン20（TBST）緩衝液を用いてトリス緩衝生理食塩水、5％脱脂乳で膜をブロックします。 </li><li> 15分間、TBST緩衝液で3回洗浄します。 </li><li>一晩メートル6 A（中膜をインキュベート&lt;EM&gt; N 6 -methyladenosine）抗体溶液（1：5％脱脂乳TBSTバッファー1,000）4℃。 </li><li> 15分間、TBST緩衝液で3回膜を洗浄します。 </li><li>室温で1時間（5％の脱脂乳TBST緩衝液中2,000 1）HRP結合ロバ抗ウサギ抗体溶液中で膜をインキュベートします。 </li><li> 15分間、TBST緩衝液で3回膜を洗浄します。 </li><li>強化された化学発光基質（膜の1cm 2当たり0.125ミリリットル）を適用します。 </li><li>製造元の指示26に従って、デジタルイメージャの最適な設定で化学発光をキャプチャします。 </li></ol></li><li>メートル6定量<ol><li> ImageJソフトウェアを使用して相対メートル6 A化学発光強度を測定します。 <ol><li> ImageJソフトウェアのメニューで、該当するファイルを開くには、「ファイル」オプションを選択します。 </li><li> ImageJのから「矩形」ツールを選択し、周囲に枠を描きます信号。 </li><li>リボソームRNAは、実験の焦点でない場合は、計算のための18Sおよび28SリボソームRNAメートル6 Aバンドを避けます。 </li><li>選択された車線を確認するために「コマンド」と「1」をクリックしてください。 </li><li>押して「コマンド」と「3」が選択されたプロットを表示します。 </li><li> 「ストレート」ツールをクリックし、セグメント化された領域を分離するために線を引きます。 </li><li>測定値を記録するために「ワンド」ツールをクリックします。 </li><li>データをエクスポートします。 </li><li>臭化エチジウム染色から18SリボソームRNAのバンドを持つメートル6 Aのレベルを標準化します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

RNAの修飾は、細胞機能と生理学において重要な役割を果たします。これらの修飾の調節、機能、および恒常性に関する現在の理解はまだ調査され、拡大されています8。したがって、RNAの修飾を評価するための正確でゴールドスタンダードな方法が必要です。修正ノーザンブロッティング法は、RNA修飾の正確な定量と、多様なRNAにおける修飾の明確な描写を提供します。この方法は少なくとも3日かかりますが、標準化でき、さまざまな実験計画に使用できます。さらに、異なる抗体を使用して、異なるRNA修飾を検出できます27。
RNA修飾を分析する際には、異なるRNAを分離することが重要です。リボソームRNAは、RNAの総量の大部分を占める28,29。トータルRNAのみでRNA修飾を解析した結果は、主にrRNAの変化を表します。rRNAのメチル化やその他の修飾は、他のRNAの変化を隠す可能性があります。ゲル分離の手順により、mRNAやその他の低分子RNAの修飾をより正確に分析できます。
m6Aの免疫沈降とシーケンシングによるトランスクリプトームワイドマッピングは、各タイプのRNAの修飾に関する詳細な洞察を提供します22。特定のRNAに関する情報と約80〜120 bpの分解能を提供します。m6A-Seqは異なる実験条件間の修飾を比較できますが、そのような実験のための適切な標準とコントロールの選択は困難です18。免疫沈降は再現が難しく、多くの場合、繰り返し間で大きな変動が生じます。さらに、m6A-Seqは、免疫沈降およびシーケンシングの前にRNAサンプルの断片化を必要とします30。断片化プロセスは、元のRNA修飾に過度の影響を誘発する可能性があります。実験で特定の遺伝子の情報は必要ないが、比較のために異なる条件が必要な場合、現在の方法では、さまざまな実験セットアップに対してより優れた視覚化と制御が提供されます。 
RNAの修飾は、転写制御を調節する上で重要なステップです31。しかし、多様な生理学的領域におけるさまざまなRNA修飾の恒常性と調節メカニズムはまだ不明です。現在の修正ノーザンブロッティング法を使用すると、さまざまなRNA修飾を定量化および比較できます。さらに、RNA修飾の変化と規制をより詳細に調査することができます。将来的には、古典的なノーザンブロッティングと修正されたノーザンブロッティングプロトコルの両方からの実験データを組み合わせることも可能になり、RNA生物学に関するより深い洞察が得られる可能性があります。
修正ノーザンブロッティングプロトコルの成功を決定する最も重要な要因は、RNAサンプルの完全性です。ある程度の分解を伴うRNAは、良好な古典的なノーザンブロッティング結果をもたらす可能性がありますが、これは修正されたノーザンブロッティングの結果に大きな影響を与える可能性があります。異なる組織や細胞株におけるRNAの修飾も大きく異なる可能性があります。最終実験を行う前に、さまざまな組織に適したRNAサンプルロードをテストすることが重要です。
ブロッティング手順は伝統的にサザン博士とさまざまな地理的方向にちなんで名付けられてきたため、現在の技術には「北東部」ブロッティングという名前を提案します。

動的および可逆的なRNA修飾は、RNAの恒常性において重要な役割を果たしています。40年前、N6-メチルアデノシン(m6A)修飾は真核生物のトランスクリプトームに豊富に存在することがわかりました1。メッセンジャーRNA(mRNA)、リボソームRNA(rRNA)、低分子核小体RNA、トランスファーRNA、マイクロRNA2において多様な機能を持っています。mRNAのm6A修飾は、それらのスプライシング3、翻訳4、分解5、および局在2に影響を与える。さらに、それらはリボソームの生合成とマイクロRNA機能に影響を及ぼします6。RNAのm6A修飾の進化的保存は、単細胞細菌から多細胞ヒト7に見られます。m6Aの改造の役割の描写は、現在、広範な調査が行われています。この取り組みにより、転写制御に関する新たな知見が得られることが期待されます。最近の研究では、mRNA8の他の化学修飾もRNA代謝に重要な役割を果たしていることが明らかになっています。
概日リズム9、幹細胞多能性10、トリグリセリド代謝4、線維症11、肥満12、大うつ病13は、m6A修飾が結果を制御することが知られているプロセスのいくつかの例です。多くの概日時計遺伝子転写産物は、m6A部位を有する 14.m6Aメチラーゼまたはデメチラーゼの調節は概日周期の変化を誘発します15。Mettl3は、m6Aトランスフェラーゼであり、幹細胞の多能性を調節する因子です。Mettl3の欠損は、着床後のステージ10で早期の胚致死と異常な系統プライミングにつながります。脂肪細胞における脂肪量および肥満関連(FTO)であるm6Aデメチラーゼの欠乏は、Angptl44の転写後調節を通じて脂肪酸の動員と体重に影響を与えます。これらの研究から、m6AはmRNAプロセシングを制御するだけでなく、発生学的な発生や病態生理学においても重要な役割を果たしていることが明らかになりました。m6A修飾の機能は、将来の治療上の考慮事項に影響を及ぼします。
RNA16-18のm6A修飾を測定するために、いくつかの方法が利用可能です。伝統的に、薄層クロマトグラフィー(TLC)および高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、いくつかのRNA19,20におけるm6Aの分布を研究するために使用される。質量分析は、RNA中のm6A修飾を検出するための高感度なツールです。しかし、質量分析による分析21では、RNAをRNaseによって短い断片に切り出す必要がある。Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m6A-Seq)22 は、断片化された RNA を m6A 特異的抗体で免疫沈降させ、並行して RNA シーケンシングを行います。この方法では、トランスクリプトーム幅の m6A ランドスケープが生成されます。m6A個別ヌクレオチド分解能架橋および免疫沈降(miCLIP)の高分解能マッピングは、さらに、単一ヌクレオチド分解能23でのm6A修飾をマッピングする。どちらの方法も、特定の遺伝子の情報とともに、トランスクリプトーム全体にわたるm6A修飾の詳細を提供します。しかし、実験で複数の条件の比較が必要な場合、どちらの方法でも定量化や標準化は困難です。さらに、m6A-SeqのRNAの断片化は元のRNA構造を変化させ、これが天然のm6Aレベルに影響を与える可能性があります。RNAの全体的なm6A修飾と異なる実験条件下でのそれらの変化を検出するために、修正されたノーザンブロッティングプロトコルを採用した方法を報告します。この方法では、ゲル電気泳動18を用いてRNAを分子量で分離します。この手順により、複数の条件またはサンプルが関与する実験の標準化と定量化が向上します。また、rRNA、mRNA、microRNAなど、さまざまなRNAに対する特定のm6A修飾情報も提供します。

<table><tbody><tr><td>RNaseZapの解決</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td>のプロトコル1.1</td></tr><tr><td>TRIの試薬の解決</td><td>Ambion</td><td>AM9738</td>プロトコル<td>1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-Bromo-3-chloropropane (BCP)</td><td>Σ</td><td>B9673</td>の<td>プロトコル1.2.1.3</td></tr>の<tr><td>エタノール</td><td>JTbaker</td><td>8006</td>の<td>プロトコル1.2.1.3</td></tr>の<tr><td>Isopropanol</td><td>ΣI9516</td><td>のプロトコル1.2.1.3</td><td></td></tr><tr><td>GenElute mRNA Miniprep Kit</td><td>Σ</td><td>MRN70</td><td>プロトコル 1.2.2.1</td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td>プロトコル 1.2.2.2</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Fluka</td><td>71183</td><td>プロトコル 1.2.2.2</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Ambion</td><td>AM9930</td><td>プロトコル 1.2.2.6</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Σ</td><td>D5758</td><td>プロトコル 2.1.1</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス <td>JT Baker</td><td>A426</td><td>プロトコル 2.1.2</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>シグマ</td><td>M1254</td><td>プロトコル 2.1.3</td></tr><tr><td>37% ホルムアルデヒド 溶液</td><td>シグマ</td><td>F8775</td><td>プロトコル 2.1.3</td></tr><tr><td>EDTA、二ナトリウム塩</td><td>JT Baker</td><td>8993</td><td>プロトコル 2.1.3 10x MOPS バッファー</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>Σ</td><td>F7503</td><td>プロトコル 2.2.1</td></tr><tr><td>RNA ミレニアムマーカー</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td>プロトコル 2.2.2</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td>プロトコル 2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td>プロトコル 2.2.5 トラッキング染料</td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td>プロトコル 2.2.5 トラッキング染料</td></tr><tr><td>キシレンシアノール FF</td><td>Σ</td><td>X4126</td><td>プロトコル 2.2.5 トラッキング染料</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム二水和物</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>プロトコル 2.4.2 20x SSC バッファー</td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>プロトコル 2.4.2 20x SSC バッファー</td></tr><tr><td>Hybond ブロッティングペーパー</td><td>GE ヘルスケア</td><td>RPN6101M</td><td>プロトコル 2.4.4</td></tr><tr><td>GE Hybond-N+ 膜</td><td>GE ヘルスケア</td><td>RPN303B</td><td>プロトコル 2.4.6</td></tr><tr><td>Stratalinker UV クロスリンカー 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>プロトコル 3.1.2</td></tr><tr><td>ゲルキャッチャー1500</td><td>ANT技術</td><td>ゲルキャッチャー1500</td>プロトコル<td>3.1.5</td></tr><tr><td>抗m6A(N6-メチルアデノシン)</td><td>シナプスシステム</td><td>202003プロトコル</td><td>3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL抗ウサギIgG、HRPリンク全Ab</td><td>GEヘルスケア</td><td>NA934</td>プロトコル<td>3.2.5</td></tr><tr><td>ChemiDoc MPシステム</td><td>BIO-RAD</td><td>1708280</td><td>プロトコル3.2.8</td></tr></tbody></table>

rnaの測定方法<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup細胞や組織における&gt; -methyladenosine変更

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

NRNAの6-メチルアデノシン(m6A)修飾は多様で、真核生物の間で遍在しています。mRNA、rRNA、tRNA、およびmicroRNAに存在します。最近の研究では、これらの可逆的なRNA修飾がRNAのスプライシング、翻訳、分解、および局在に影響を与えることが明らかになりました。概日リズム、幹細胞の多能性、線維症、トリグリセリド代謝、肥満などの複数の生理学的プロセスも、m6A修飾によって制御されます。免疫沈降/シーケンシング、質量分析、および改変ノーザンブロッティングは、m6A修飾を測定するために一般的に使用される方法の一部です。ここでは、m6A修飾を測定するためのノースイースタンブロッティング技術を紹介します。現在のプロトコルは、RNAの良好なサイズ分離、さまざまな実験デザインのためのより良い適応と標準化、およびRNAのさまざまなソースにおけるm6A修飾の明確な描写を提供します。m6A修飾は、概日リズムと肥満に関連するヒトの生理機能に決定的な影響を与えることが知られていますが、他の(病的)生理学的状態におけるそれらの役割は不明です。したがって、m6A修飾の研究は、分子生理学に関する重要な洞察を提供する大きな可能性を秘めています。

通常の明暗概日相で14日後に、野生型マウスは、一定の暗闇の中に入れました。肝臓からのRNAは、4時間間隔でサンプリングし、変更されたノーザンブロット法で検討しました。 rRNA、mRNAを、と小さなRNAのメチル化は、明らかに（ 図2）を検出しました。別の概日時間（CT）との間の比較は、正確に、18S rRNAの標準を用いて計算することができます。 rRNAを、mRNAを、および低分子RNAでメートル6 Aレベルの堅牢な概日振動がありました。 リボソームRNAによって差し出さ干渉を回避するために、ポリアデニル化RNAは、ステップ1.2.2のように、精製することができます。精製後、rRNAが大きく、他のRNA（ 図3）のより良好な視覚化を可能にするために除去することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html>グラム&gt;図1：ブロットトランスファーユニットの組み立て。メンブレンへのRNAをブロッティング用のキャピラリートランスファーユニットが示されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> 図2：C57BL / 6Jマウスにおけるメートル6 Aレベルの概日リズム。この図はメートル6野生型マウスの肝臓からの全RNAのブロットは、4時間の間隔で、通常の明暗相の14日後に暗暗期の最初の日に犠牲に示しています。定量化は、M 6 18Sおよび28S rRNAの間の画像の濃度差を用いて行きました。メートル6存在量は一番下にホルムアルデヒドゲルから18S rRNAのバンドに標準化しました。ら= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> 図3：メートル6 Aブロットを持つかのrRNAなし。代表的なmが野生型マウスの肝臓からの全RNAおよびポリアデニル化RNAの6 Aブロットが示されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> 10×MOPS緩衝液（pH 7.0、光から保護します） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> MOPS </td><td> 41.85 </td><td>グラム</td><td> 0.2 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3">酢酸ナトリウム</td><td> 4.1 </td><td>グラム</td><td>0.05 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EDTA、二ナトリウム塩</td><td> 3.7 </td><td>グラム</td><td> 0.01 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3">合計</td><td> 1 </td><td> L </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3">室温で撹拌</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> 20×SSC緩衝液（pH7.0） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3">塩化ナトリウム</td><td> 175.3 </td><td>グラム</td><td> 3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3">クエン酸三ナトリウム</td><td> 88.3 </td><td>グラム</td><td> 0.3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3">合計</td><td> 1 </td><td> L </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3">室温で攪拌し、その後、オートクレーブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3">追跡用色素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10×MOPS緩衝液</td><td> 500 </td><td> μL </td><td> 1倍</td></tr><tr><td></td><td colspan="3">フィコール400 </td><td> 0.75 </td><td>グラム</td><td> 15％ </td></tr><tr><td></td><td colspan="3">ブロモフェノールブルー</td><td> 0.01 </td><td>グラム</td><td> 0.2％ </td></tr><tr><td></td><td colspan="3">キシレンシアノール</td><td> 0.01 </td><td>グラム</td><td> 0.2％ </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3">合計</td><td> 5 </td><td> mLの</td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> -20°Cで保存</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> DEPC水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 1割合を希釈：DEPCの1,000のddH 2 Oに</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3">室温で一晩攪拌し、その後、オートクレーブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3">サンプルバッファー（光から保護） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10×MOPS緩衝液</td><td> 200 </td><td> μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 37％ホルムアルデヒド</td><td> 270 </td><td> μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3">ホルムアミド</td><td> 660 </td><td> μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> -20°Cで保存</td><td></td><td></td><td></td></tr></tboDY&gt; </table> 表1：バッファおよびソリューションを提供しています。

N 6 -methyladenosine（メートル6 A）RNAに修飾を測定するための修正されたノーザンブロット法が記載されています。現在の方法は、様々な実験デザインの下で多様なRNAおよびコントロールで変更を検出することができます。

RNAの測定方法<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup細胞や組織における&gt; -methyladenosine変更

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

改良型ノーザンブロッティング法の総合的な目的は、RNA中のN6-メチルアデノシン（n6A）修飾を測定し、多様なRNAにおける修飾を検出することです。本手法は、N6-メチルアデノシン修飾などのRNAエピジェネティクスの役割に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、RNAの効果的な分離が可能であること、実験デザインの標準化が向上すること、そしてRNAにおけるn6A修飾を明確に描き出せることです。この手法は、RNAにおけるn6A修飾に関する知見を提供し、また、異なる検出抗体を用いることで他のRNA修飾にも適用可能です。実験を開始するにあたり、リボヌクレアーゼ除染溶液をペーパータオルにスプレーし、ピペットおよび実験台の表面を拭き上げます。次に、ペーパータオルをヌクレアーゼフリーウォーターで湿らせ、再度ピペットおよび実験台の表面を拭き上げてください。4°Cに保存したRNA抽出溶液を用意し、マウス組織約75 mgに同溶液を1 mL添加する。オーバーヘッドスターラーを用いて組織を均質化させる。次に、サンプルホモジネート1 mLあたり100 µLの1-ブロモ-3-クロロプロパン（BCP）を添加する。チューブを15秒間激しく振とうし、全RNA抽出に進みます。分光光度計を用いて、260 nmおよび280 nmにおける吸光度を測定し、RNA濃度を決定します。0.8%アガロースゲル電気泳動を行い、RNAサンプルの品質を確認します。すべての電気泳動装置をジエチルピロカルボネートまたはDEPC処理水で洗浄します。三角フラスコに2.5 gのアガロースを加え、次に215 mLのDEPC処理水を加え、電子レンジで混合物を完全に溶解させます。溶液が溶解した後、12.5 mLの10X MOPSバッファーを加えます。そして、37% formaldehyde 22.5 millilitersをフラスコに加えます。次に、その溶液を1.5 millimeter厚のコームを備えた電気泳動装置に注ぎます。清潔なコームを使用して、ゲルの端にある気泡を押し出してください。ゲルを室温で凝固させます。次に、あらかじめ調製した1X MOPS電気泳動バッファーを用いてゲルのウェルを洗浄し、プレランを行います。RNAサンプルをゲルのウェルにロードし、電気泳動を行います。翌日、UVライトを用いてゲルの観察および写真撮影を行います。転写の準備として、ゲルを切断し、不要な部分を取り除きます。10X saline sodium citrate（SSC）バッファーを500 milliliters調製します。10X SSCバッファーでゲルを2回洗浄します。ゲル全体を覆うのに十分な大きさのフィルターペーパーを1枚切り出します。また、ゲルと同じサイズのフィルターペーパーを4枚切り出します。次に、正電荷ナイロンメンブレンをゲルのサイズに合わせて1枚切り出します。正しい向きを確認するための目印として、ゲルとメンブレンに切り込みを入れます。メンブレンを2X SSCバッファーに浸します。転写トレイに10X SSCバッファーを500 milliliters注ぎます。大きなフィルターペーパーをガラスプレートの上に敷き、転写バッファーでフィルターペーパーを濡らします。その後、ピペットを使用して気泡を押し出して取り除きます。あらかじめカットしたフィルターペーパー2枚を転写バッファーに浸し、フィルターペーパーの中央に配置します。気泡を取り除いてください。次に、ゲルの上面を下にしてフィルターペーパーの上に置き、さらにゲルの上にメンブレンを重ねます。この際、ゲルとメンブレンの切り欠き部分が合うように慎重に調整してください。次に、あらかじめカットしたフィルターペーパー2枚をメンブレンの上に置きます。層の間に気泡がある場合は取り除いてください。ゲルをラップで包み、ゲルとメンブレンを通過したバッファーのみをタオルが吸収するようにします。次に、フィルターペーパーの上にペーパータオルを重ねます。タオルの上に大きめのガラスプレートを載せ、さらにその上に重りを置いて、RNAがゲルからメンブレンに一晩かけて転写されるようにします。転写後、メンブレンは2X SSCバッファーで湿らせた状態に保持してください。フィルターペーパー2枚を10X SSCバッファーに浸し、UVクロスリンカーに配置します。RNAが吸収された面が上を向いていることを確認し、フィルターペーパーの上にメンブレンを置きます。オートクロスリンクモードを選択し、スタートボタンを押して照射を開始します。UVゲルイメージキャッチャーを用いてメンブレンとゲルを確認し、ゲルからメンブレンへのRNA転写を確認します。TBSTバッファーを用いた5%脱脂粉乳溶液中で、室温で1時間メンブレンをブロッキングします。その後、m6A抗体溶液中で、4°Cで一晩メンブレンをインキュベートします。翌日、メンブレンをTBSTバッファーで15分間、3回洗浄します。次に、HRP標識ドンキー抗ウサギ抗体溶液中で、室温で1時間インキュベートします。1時間後、メンブレンをTBSTバッファーで15分間、3回洗浄します。強化化学発光基質を添加します。デジタルイメージャーを用いて化学発光をキャプチャします。最後に、m6A定量に進み、Image Jを用いて相対的なm6A化学発光強度を測定します。マウス肝臓RNAを4時間間隔でサンプリングし、改良ノーザンブロッティング法を用いて解析しました。rRNA、mRNA、および小分子RNAのメチル化が明確に検出されました。野生型マウスの肝臓から抽出した全RNAおよびrRNA除去後のRNAを用いて、代表的なm6Aブロットを行いました。この手法に習熟し、適切に実施すれば、4日間で完了させることができます。本手法の開発後、RNAエピジェネティクス分野の研究者は、概日リズムや肥満に関連するヒト生理機能への影響を探索することが可能になりました。

a-method-for-measuring-rna-n6-methyladenosine-modifications-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここで、Mod5、酵母 RNA 修飾酵素の生化学的解析のためのプロトコルを記述し、このプロトコル可能性があります他の RNA...

TRNA イソペンテニル トランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

ここでは、RNAのDNAzyme依存性切断に関するプロトコルを提示する。これにより、RNA...

rRNA 2'-O-メチル化のDNAzyme依存性分析

ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のメチルトランスフェラーゼ活性の直接分析のための抗体フリーインインビトロアッセイが記載されている。...

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

メチル化されたRNA免疫沈降アッセイは、メチル化RNAフラグメントを濃縮するために使用される抗体ベースの方法です。深いシーケンシングと結合して、それはm5C修飾を運ぶ転写物の同定をもたらす。...

シロイヌナズナのm5C修飾を研究するメチル化RNA免疫沈降アッセイ

インビボヌクレオシド/ヌクレオチドの植物定量の正確かつ再現可能な方法をここに記載する。この方法では、HPLC-MS/MS...

HPLC-MS/MSによるヌクレオシド/ヌクレオチド含有量測定のための植物サンプル調製

本プロトコルは、1H-NMR分光法による遊離およびタンパク質結合アルギニンおよびメチルアルギニンの調製および定量的測定を記載している。...

核磁気共鳴分光法によるアルギニンメチロームの探索

RNAの転写後修飾は、最近中枢神経系の可塑性に関連している翻訳調節の未研究の層を表す。ここで、試料調製および液体クロマトグラフィータンデム質量分析アプローチは、単一のニューロンにおける多数のRNA修飾の同時特性評価のために説明される。...

質量分析法を用いた単一ニューロンにおけるRNA修飾の特性評価

このプロトコルは、突然変異プロファイリング実験のために硫酸ジメチルでRNAを修飾するための指示を提供します。これには、2つの代替ライブラリ調製方法を使用したin vitro および in vivo...

硫酸ジメチルによるRNA構造のプロービング in vitro および細胞内でのシーケンシングによる突然変異プロファイリング(英語)

ここでは、ドットブロットを用いて全体のm⁶Aレベルを半定量的に評価するプロトコルを提示します。全RNAは抽出され、変性され、ナイロン膜に斑点を検出し、抗m⁶A抗体でプローブされ、化学発光によって可視化されます。ImageJグレースケール解析で定量化された信号強度は相対的なメチル化存在比を反映し、研究のための再現性のあるワークフローを提供します。...

グローバルN6-メチルアデノシンRNA修飾レベル検出のためのドットブロットアッセイ

このプロトコルは、MeRIP-qPCRを用いて特定のRNAのm6A修飾レベルを評価する詳細なアプローチを提供します。...

骨肉腫細胞における特異的RNAのm6A修飾レベル検出のためのMeRIP-qPCRアッセイ

学ぶ ノーザンブロッティング法を用いたRNAのN6-メチルアデノシン修飾の検出方法。マウス組織からのRNA分離、電気泳動、化学発光検出により、rRNAやmRNAのm6A修飾を効率的に測定できます。

RNAの測定方法

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