Name: 非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶ 非変性PAGEとウェスタンブロットを用いたヒトMxAタンパク質のオリゴマー状態評価法。精製不要で細胞溶解液から直接解析でき、細胞生物学研究におけるタンパク質複合体のサブユニット数決定に有用です。

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この研究は、スイス国立科学財団（Grant nr. 31003A_143834）からJPへの助成金によって資金提供されました。

注：このプロトコルは、以前に公開された非変性PAGEプロトコル12に基づいています。その研究では、のMxAタンパク質のオリゴマー状態は、内因性のMxAを発現するのMxAを過剰発現するベロ細胞またはIFN-αで刺激されたA549細胞のいずれかを用いて評価しました。以下に記載されるプロトコルは、のMxAに加えて、任意のタンパク質のオリゴマー状態を分析するために使用することができます。しかし、さらなる最適化が必要とされ得ます。 非変性PAGEのための細胞溶解物の調製注：いずれかのベロまたはA549細胞におけるヒトのMxAタンパク質のオリゴマー状態を分析するために、1.0×10 6個の細胞を採取しました。細胞型または分析するタンパク質の存在量に依存して、細胞数を調整すべきです。すぐに感光性ヨードアセトアミドを添加するように、露光から溶解バッファを保護することも重要です。 <ol><li>にウェル当たり0.3×10 6 A549またはVero細胞をシード6ウェルディッシュに。ウェル毎に2 mlの増殖培地中で細胞を維持した （ 表1参照 ）。細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で一晩細胞をインキュベートします。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1mlで洗浄することにより細胞を回収し、0.25％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸0.5mlを室温で約5分間（EDTA）1X溶液を添加することによって切り離します。 </li><li>すぐに細胞がディッシュから剥離として、0.5ミリリットルの増殖培地を追加し、注意深くピペッティングにより混合します。 </li><li>各ウェルに1 2ミリリットルチューブの細胞を転送し、テーブルトップ遠心機（5,000×gで、4℃、5分）を使用して、それらをペレット化。 </li><li>慎重に細胞ペレットを乱すことなくピペットで上清を除去します。 </li><li>慎重に上下細胞懸濁液をピペットで1ミリリットルの氷冷PBSで細胞を洗浄。 </li><li>テーブルトップ遠心機（5,000×gで、4℃、5分）で細胞をペレット化。 </li><li>慎重のwiをピペットで上清を除去し細胞ペレットを取り外すthout。 </li><li>上下にピペッティングし、氷上に置くことにより、200μlの氷冷溶解緩衝液中に再懸濁細胞（ 表1参照）。 </li><li>直ちに、スズ箔を使用して管を覆うことにより光から溶解物を保護し、氷上で30分間インキュベートします。 注：遊離チオール基の保護が不可逆的であるため、氷上で30分間インキュベートした後、それは、もはや露光からの溶解物を保護するために不可欠です。 </li><li>あらかじめ冷却テーブルトップ遠心機（13,000×gで、4℃、20分）での遠心分離により細胞破片を除去します。 </li><li>遠心分離工程の間に20分間の4℃の冷室で透析緩衝液（ 表1）に透析カラムを平衡化します。万の分子量カットオフでカラムを使用してください。 <ol><li>フロートブイに列を取り付け、透析緩衝液で満たされたビーカーに入れます。穏やかな攪拌を確保するために、磁気撹拌機を使用しています。膜には触れないでください。 注：Dialysカラムは、購入またはフィアラおよび共同研究者ら19によって記載されたプロトコルに従って、1.5ミリリットルのチューブから調製することができるされています。 </li></ol></li><li>透析緩衝液とフロートブイから列を削除します。膜に触れることなく、ピペッティングにより準備された透析カラムにクリアされた溶解物を転送します。フロートブイに列を取り付け、透析緩衝液で満たされたビーカーに戻ってそれらを置きます。 </li><li>慎重にマグネチックスターラーを用いて攪拌しながら4℃で少なくとも4時間（好ましくは一晩）氷冷透析緩衝液（ 表1）を含有するビーカー中で溶解物を透析します。 200μlの溶解液のために少なくとも100ミリリットルの透析緩衝液を使用してください。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブに透析サンプルを転送します。テーブルトップ遠心機（13,000×gで、4℃、20分）で遠心分離によって沈殿物を除去します。オリゴマータンパク質複合体の解離を防ぐためにすぐに透析した後、プロトコル（セクション2）に進みます。凍結しないでください調製した溶解物。 </li></ol> 2.電気泳動注：いくつかの変更22で前述したように電気泳動を行いました。以下に記載されたプロトコルでは、プレキャスト勾配ゲルを使用した（4〜15％勾配）。あるいは、ゲルは、実験室で調製することができます。 SDSのオリゴマータンパク質複合体の解離を防止するような任意の変性剤を排除することが非常に重要です。電気泳動の時間は人間のMxAタンパク質の異なるオリゴマー状態のために最適化されました。しかし、それは、オリゴマー複合体の大きさ、ならびに複合体を分析するために達成されることになっている分離の範囲に応じて、他のタンパク質のために変化することができます。したがって、電気泳動の最適な時間は、経験的に決定されるべきです。オリゴマーの最適な解像度を分析するために電流が25ミリアンペアを超えてはなりません。 <ol><li>ゲルチャンバ内の非変性PAGEゲルを組み立てます。トンを埋めます予冷ランニング緩衝液（ 表1）と彼の内側および外側チャンバ。 </li><li> 4℃の低温室で15分間ゲル当たり25ミリアンペアで予備冷却したランニング緩衝液でゲルを事前に実行します。 </li><li> 4×サンプル緩衝液（ 表1）の5μlの上記で調製した溶解物の15μlのを混ぜます。サンプルを沸騰しないでください。 </li><li>サンプルの負荷15μlを、ゲル上の任意の天然タンパク質の標準。 4℃の低温室で4時間25ミリアンペアでゲルを実行します。 注：半定量的分析のため、タンパク質定量化プロトコル（ 例えば、Bradfordタンパク質アッセイ23）はレーンあたり総タンパク質の等量の充填を確実にするために行うことができます。 </li></ol> 3.ウエスタンブロット注：以下で説明するには、湿ったウェスタンブロットシステムのプロトコルです。任意のブロッティング膜を使用することができます。 BUFブロッティングで平衡化する前に、100％メタノールにポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜を活性化させますFER。セミドライウエスタンブロット法を代わりに使用することができるが、大きなオリゴマー複合体のために最適化されなければなりません。 <ol><li>ゲルを分解し、慎重にSDS緩衝液（ 表1）にそれを転送します。 </li><li>穏やかに振盪しながら室温で10分間インキュベートします。 </li><li> 2スポンジ、4セルロース濾紙シートとゲルあたりブロッティング膜を準備します。バッファ（ 表1）をブロッティングでそれらを浸します。 </li><li> 1スポンジ、2セルロース濾紙シート、膜、ゲル、2セルロース濾紙シート、1スポンジ：（下から上）を次のようにサンドイッチを組み立てます。 </li><li>ブロッティングタンクにサンドイッチを入れてください。ゲルはマイナス極に直面しながら、膜がプラス極に直面していることを確認します。 </li><li>あらかじめ冷却ブロッティングバッファーでブロッティングタンクを埋めます。 </li><li>最高のタンパク質導入の結果を得るために4℃で一晩90ミリアンペアで吸い取ります。 </li><li>サンドイッチを分解し、PONC中で膜をインキュベートすることにより、タンパク質標準を可視化室温で5分間オーSソリューション。 </li><li>あなたは明らかにタンパク質標準のバンドが表示されるまで、慎重に脱イオン水でポンソーSを洗浄することにより、膜脱色。 </li><li>ペンを使用して、タンパク質標準のバンドをマークします。 注：残留ポンソーSは、免疫染色を妨げる可能性があります。これを回避するために、膜を脱イオン水で1分間、およびその後の洗浄のために、0.1M NaOH中でのインキュベーションによってさらに脱色することができます。 </li><li>ブロッキング緩衝液で膜をブロックし、室温で少なくとも1時間または一晩4°Cのため（ 表1参照）。 </li><li>分析されるタンパク質に対する抗体を用いた免疫染色により、目的のタンパク質（単数または複数）を視覚化します。 注：緩衝液（ 表1）をブロック1,000：ヒトのMxAタンパク質は、ヒトMx1の1に希釈するための具体的なウサギポリクローナル抗体を用いて可視化しました。抗体溶液を4℃で一晩インキュベートしました。あるいは、モノクローナルANTI-のMxA抗体（クローン143）を使用することができる（データは示していない）24。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

ここでは、ウェスタンブロット分析を行った非変性PAGEによって哺乳動物細胞で発現するタンパク質のオリゴマー状態の急速な決意を可能にする簡単な方法を説明します。このアプローチの主な利点は、所定のタンパク質のオリゴマー状態は、従来のタンパク質精製せずに全細胞溶解物から決定することができるということです。これは、オリゴマー化または補助因子に関連してその機能を発揮するタンパク質のために重要であり得ます。また、タンパク質は、その天然の状態のままであり、さらに、ゲルから抽出された場合、酵素活性または他のタンパク質の機能を決定し、オリゴマー状態と相関させることができます。 このプロトコルの重要な側面は、サンプル調製時の洗剤の選択です。これは、細胞膜に関連するタンパク質のために特に重要です。 MxAのは、主に、滑らかな小胞体25の膜に関連すると思われます</suP&gt;。細胞溶解のための非イオン性界面活性剤NP40をのMxAの沈殿を防止する、最適でした。以前19に記載のように緩衝液交換し、透析による溶解物の低分子量不純物を除去した後、0.1％3の存在-...

タンパク質の四次構造は、多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています。シグナル伝達経路、遺伝子発現、および酵素活性化/非活性化は、すべてのタンパク質複合体1-4の適切なアセンブリに頼ります。また、ホモまたはヘテロオリゴマーとして知られるこのプロセスは不可逆的共有結合または可逆的な静電および疎水性のタンパク質 - タンパク質相互作用に起因します。オリゴマー化は、ゲノムサイズを大きくすることなく、異なる細胞過程を多様化するだけでなく、変性および劣化5に対してより耐性である安定な複合体を構築するためのタンパク質のための戦略を提供するだけでなく。オリゴマー化の欠陥は、タンパク質の機能に影響を与え、疾患の発症をもたらすことができます。例えば、酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼは、四量体複合体を形成します。タンパク質複合体の中のいくつかの変異は、四量体形成を弱め、病気のフェニルケトン6につながることができます。 7を誘発インターフェロン（IFN）です。これは、ダイナミンのような大GTPアーゼのスーパーファミリーに属し、 インビトロ 8 に大きなオリゴマー構造を形成する能力を有します。オリゴマー化は、迅速な分解9,10からのMxAを保護するために提案されています。多くの研究グループによる激しい努力にもかかわらず、作用の分子機構は、主にとらえどころのないままで、その抗ウイルス機能のためのMxAのオリゴマー化状態の役割が議論9,11,12の下にあります。この点で、ガオと共同研究者は、MxAのが大きなリング状オリゴマー構造11の形でウイルス核タンパク質と相互作用することにより、その抗ウイルス活性を発揮するモデルを提案しました。しかし、最近では、我々は、のMxA二量体が抗ウイルス活性を示し、インフルエンザウイルス12の核タンパク質と相互作用することを実証しました。 BMxAの結晶構造にASED、ガオと共同研究者は、in vitroで 、そのオリゴマー化およびその抗ウイルス機能11,13のために重要である界面領域におけるいくつかのアミノ酸残基を同定しました。したがって、抗ウイルス活性を発揮するのMxAのオリゴマーいる状態解明するために、我々は、急速に、内因性のMxAはIFNα刺激後に発現並びにヒト細胞において発現のMxAインタフェース変異体のoligmeric状態を決定するための簡単なプロトコルを確立しようとしました。 一般に、スプリット緑色蛍光タンパク質などのタンパク質の間の相互作用を研究するために使用される多くの技術があるが（スプリット-GFP）相補性アッセイ14、表面プラズモン共鳴15と蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）16、それらが提供していませんオリゴマータンパク質複合体の正確な化学量論の情報。この特定の側面の調査のため、技術など多角度光散乱（MALS）17および分析超遠心分離18は非常に便利です。通常、これらの方法を用いて分析したタンパク質は、精製されたタンパク質です。オリゴマー化プロセスは、他の細胞因子に依存し得ます。これらの要因が不明である場合は、解析がより困難です。さらに、いくつかのタンパク質は、 大腸菌で発現することが困難であり、 coliおよび精製します。したがって、これらの方法は、細胞環境におけるタンパク質のオリゴマー化を分析するための最適な選択肢ではありません。また、これらの技術は容易に入手できない高価な機器を必要とします。 非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、サイズ排除クロマトグラフィー又は従来のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-PAGEに続く化学的架橋は、細胞溶解物2,19,20からのオリゴマーの形成の特徴付けのために有用なツールです。これらの方法は、特別な装置を必要とせず、簡単にPEすることができます標準的な実験室でrformed。我々は、最初に不変非特異的凝集のMxAの沈殿を導いた種々の化学架橋プロトコルを評価しました。したがって、我々は次の非変性PAGEプロトコルをテストしました。非変性PAGEは、SDSの使用を排除するように、タンパク質の移動は、母国の電荷に依存します。ブルーネイティブPAGEは、SDSに似て全体的に負電荷を有するタンパク質をロードするためにクーマシーブリリアントブルーG250を使用しますが、タンパク質21を変性させません。残念ながら、多くの場合、溶解緩衝液に含まれている（ 例えば、マグネシウム2+）高塩および二価カチオンの存在下で鮮やかな青色の沈殿物をクーマシー。使用される緩衝剤によっては、オリゴマータンパク質複合体に影響を与える可能性の手順をさらに最適化することなくサンプルを分析することは困難です。 ここでは、のオリゴマー化を決定するために、以前に発表された方法22に基づいて簡単なプロトコルを提示非変性PAGEを使用して細胞溶解物由来のヒトのMxAタンパク質。

<table><tbody><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>透析緩衝液中での事前平衡化(グリセロール除去が必要な場合) Fiala et al. 2011</td></tr><tr><td>4&ndashに従って自作可能;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,</td> <td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td>Pre-run in running buffer system</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11836170001</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4&nbsp; ボトル 500 ml あたり 1 錠を使用 Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>TOXIC 手袋を着用し、目を保護します</td></tr><tr><td>NativeMark Unstained Protein Standard&nbsp; 50 & micro;l</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 57030</td><td>負荷 5 &micro;l/well</td></tr><tr><td>A549 細胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL185</td><td>増殖培地で増殖 (表 1参照)</td></tr><tr><td>ベロ細胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL81</td><td>増殖培地で増殖 (表 1参照)</td></tr><tr><td>抗 Mx1 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td></td><td>H00004599_D01P 1:1,000 希釈液で使用</td></tr><tr><td>ECL 抗ウサギ IgG、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合全抗体 (ロバ)</td><td>GE-Healthcare</td><td>NA934V</td><td>1:10,000希釈で使用</td></tr><tr><td>0.5% トリプシン-EDTA (1x)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;Life Technologies</td><td>Thermo Fisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド&nbsp;&nbsp;5 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>ストック&nbsp; 100 mM</td></tr><tr><td>ブロムフェノールブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>ペン&nbsp;溶連菌感染症 100 x&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;100ml&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ライフテクノロジー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140 - 130</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス 100x ストック、100 ml&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ライフサイエンス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>350500-038</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、透析、米国原産 500 ml Gibco ロット:42G9552K</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>セルロースフィルターペーパー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>PVDF ブロッティング&nbsp; メンブレン</td><td>GE-ヘルスケア</td><td>10600022</td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン</td><td>バイオソルブ</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>フッ化ナトリウム (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-7920</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Calbiochem</td><td>6555204</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 10% solution</td><td>Amresco</td><td>N907</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Biosolve</td><td>0007132391BS</td><td></td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-グリセロホスペート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>粉乳</td><td>ミグロス/スイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>ミリポア</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>クロライドナトリウム (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl<サブ>2</サブ>)</td><td>アムレスコ</td><td>288</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-8045</td><td></td></tr></tbody></table>

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのmxaのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

オリゴマー複合体の形成は、多くのタンパク質の適切な構造と機能のための重要な前提条件です。インターフェロン誘導性抗ウイルスエフェクタータンパク質MxAは、多くのウイルスに対して広範な抗ウイルス活性を発揮します。MxAはダイナミン様GTPアーゼであり、高次のオリゴマー構造を形成する能力を持っています。しかし、MxAのオリゴマー化がその抗ウイルス活性に必要かどうかは議論の余地があります。ここでは、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)とウェスタンブロット分析を組み合わせて、ヒト細胞株の細胞質画分における内因性または異所的に発現したMxAのオリゴマー状態を評価するための簡単なプロトコルについて説明します。プロトコールの重要なステップは、酵素活性を妨げることなく、特にMxAなどの細胞膜に関連するタンパク質の凝集および/または沈殿を防ぐための界面活性剤の選択です。プロトコルのもう一つの重要な側面は、タンパク質の人工的な相互作用を防ぐために、ヨードアセトアミドによるシステイン残基の遊離チオール基の不可逆的な保護です。このプロトコルは、MxAのオリゴマー状態の簡単な評価に適しており、さらに、MxAインターフェース変異体の抗ウイルス活性とそれぞれのオリゴマー状態との直接的な相関関係を可能にします。

非変性PAGEを使用して、我々は、ヒト野生型のMxA、二量体界面の突然変異体のMxA（R640A）とのMxA（L617D）ならびに細胞溶解物12から単量体インターフェース変異体のMxA（M527D）のオリゴマー状態を分析しました。細胞は（ 図1参照 ） は 、タンパク質の可溶化および遊離チオール基の保護を確実にするために1％のオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（NP-40）及びヨードアセトアミドを含有する緩衝液中で溶解しました。前述したように、塩、小代謝産物を透析19により除去しました。タンパク質分離は、非変性PAGEによって行いました。効率的なウエスタンブロットを容易にするために、ゲルをブロッティングの前にSDS緩衝液中でインキュベートしました。 MxAタンパク質はのMxAに対するウサギポリクローナル抗体を用いた免疫染色により可視化しました。ワークフローは、図2に記載されています。 <p class="jove_content" fo:keep...

この記事では、非変性PAGEとウェスタンブロット分析の組み合わせを使用して、ヒト細胞のライセートからのダイナミン様GTPase MxAタンパク質のオリゴマー状態を評価するための簡単で迅速なプロトコルについて説明します。

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

この実験の全体的な目的は、非変性ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、細胞溶解液中のホモオリゴマータンパク質複合体のサブユニット数を決定することです。この手法は、基本的な細胞プロセスに関与するタンパク質のオリゴマー状態など、細胞生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、ホモオリゴマータンパク質複合体の精製や、特殊で高価な装置を必要としないことです。したがって、ほとんどの研究室で実施可能です。本実験では、内因性Myxovirus resistance Aタンパク質（MxA）を発現するA549細胞と、MxAを過剰発現するバイロセルの2種類の細胞を使用します。A549細胞およびバイロセルを、1ウェルあたり2 mLの成長培地を用いて6ウェルプレートに播種します。細胞培養インキュベーター内で一晩インキュベートし、翌日に細胞を回収します。各ウェルを1 mLのPBSで洗浄し、0.25% Trypsin-EDTA溶液を0.5 mL加えて、室温で約5分間置いて細胞を剥離させます。細胞がプレートから剥離し次第、0.5 mLの増殖培地を加え、ピペッティングによって慎重に混合します。各ウェルの細胞を2 mLチューブに移し、卓上遠心機を用いてペレット化します。細胞ペレットを乱さないよう、ピペットを用いて上清を慎重に取り除きます。1 mLの氷冷PBSを加え、細胞懸濁液を慎重にピペッティングして細胞を洗浄します。卓上遠心分離機で細胞をペレット化します。細胞ペレットを剥がさないように、ピペットを用いて上澄み液を慎重に取り除きます。氷冷したライシスバッファーを 200 microliters 加え、ピペッティングで細胞を再懸濁し、氷上に置きます。ライシスバッファーに含まれるヨードアセトアミドは光に敏感であるため、すぐにチューブをアルミホイルで包み、溶解物を遮光してください。氷上で30分間インキュベートします。ヨードアセトアミドは、チオエーテル結合を形成することでフリーシステインのチオール基を不可逆的に保護し、タンパク質の人工的な凝集を防ぐため、その使用は不可欠です。次に、あらかじめ冷却した卓上遠心機で遠心分離し、細胞残渣を除去します。遠心分離の間、分画分子量10,000の透析カラムを準備します。透析カラムをフロートブイに取り付け、あらかじめ冷却した透析バッファーを満たしたビーカーに入れて、カラムを平衡化させます。この際、メンブレンに触れないようにしてください。ビーカーにマグネチックスターラーを入れ、ビーカーを低温室へ移動させます。マグネチックスターラーを用いて穏やかに撹拌しながら、4°Cで20分間平衡化させます。20分後、透析緩衝液とフロートブイからカラムを取り出します。メンブレンに触れないようにピペッティングを行い、精製したライセートを準備した透析カラムに転移させます。カラムをフロートブイに取り付けます。透析バッファーを満たしたビーカーにカラムを戻し、ビーカーを低温室へ移動させます。非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を妨害する可能性のある低分子代謝物や塩を除去するため、マグネチックスターラーで慎重に撹拌しながら、4 °Cで少なくとも4時間、溶出液を透析させます。透析が完了したら、透析した各サンプルを1.5 mLチューブに移します。卓上遠心分離機を用いて遠心分離し、沈殿物を除去します。オリゴマータンパク質複合体の解離を防ぐため、ライセートの透析後、直ちに電気泳動を行う必要があります。内側および外側のゲルチャンバーに、あらかじめ冷却した泳動バッファーを満たします。非変性ポリアクリルアミドゲルを、あらかじめ冷却した泳動バッファーを用い、1ゲルあたり25 mAの電流で4°Cにて15分間プリランします。調製したライセート 15 µLに、4Xサンプルバッファー 5 µLを混合します。任意のネイティブタンパク質標準と、サンプル 15 µLをゲルにロードします。4 °Cで、25 mAで4時間、ゲル電気泳動を行います。非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の完了後、ゲルを取り出し、注意深くSDSバッファーに転移させます。室温で10分間、緩やかに振盪しながらインキュベートします。ゲル1枚につき、スポンジ2枚、セルロースフィルターペーパー4枚、およびブロッティング膜を用意し、それらをブロッティングバッファーに浸します。下から上の順に、スポンジ1枚、セルロースフィルターペーパー2枚、ブロッティング膜、ゲル、セルロースフィルターペーパー2枚、スポンジ1枚の順でサンドイッチを組み立てます。ゲルがマイナス極に、膜がプラス極に向くようにして、サンドイッチをブロッティングタンクに入れます。ブロッティングタンクに、あらかじめ冷却しておいたブロッティングバッファーを満たします。タンパク質の転写効率を最適にするため、4°Cで90 mA、一晩ブロッティングを行います。翌日、サンドイッチを解体します。メンブレンをPonceau S溶液中で室温で5分間インキュベートし、プロテインスタンダードを可視化します。メンブレンを脱イオン水に入れ、洗浄して脱色します。メンブレンをトレイに移した後、ペンを用いてプロテインスタンダードのバンドに印を付けます。ブロッキングバッファーを用いて、室温で1時間以上、または4°Cで一晩、メンブレンをブロッキングします。続いて、テキストプロトコルに記載されている通り、MxAに対するウサギポリクローナル抗体を用いた免疫染色により、目的タンパク質を可視化します。内因性MxAを欠損したVirocellsに、野生型リコンビナントMxA、および単量体および二量体のMxA変異体をトランスフェクションしました。リコンビナントMxA変異体が予想される分子量で泳動されたことにより、そのオリゴマー状態が確認されました。異所性に発現させた野生型MxAは、テトラマーとして泳動されました。これらのリコンビナントタンパク質を用いて、インターフェロンα刺激を受けたA549細胞由来の内因性ヒトMxAタンパク質のオリゴマー状態を評価しました。その結果、インターフェロンαで刺激したA549細胞のライセートにおけるMxAのサイズが四量体に相当することが明らかになりました。この手法に習熟すれば、適切に実施することで1日半で完了させることができます。本手順を行う際は、タンパク質相互作用の破壊やタンパク質凝集を引き起こす可能性があるため、全工程を通じてサンプルの凍結融解を避けることが重要です。さらに、ヨードアセトアミドのような光感受性試薬を扱う際は、溶解ステップにおいてサンプルを光から保護することが重要です。非変性SDS-PAGEの後、酵素活性の解析や、潜在的なヘテロオリゴマー複合体の特性評価といったさらなる疑問を解決するために、タンパク質ゲルの切り出しや酵素活性測定、あるいは二次元PAGEなどの手法を行うことができます。この技術の開発により、細胞生物学分野の研究者が培養細胞におけるオリゴマータンパク質複合体の組成を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、非変性PAGE分析を用いてオリゴマータンパク質を研究するための、細胞培養物からの細胞溶解液の調製方法について十分に理解できるはずです。ヨードアセトアミドの取り扱いは極めて危険であるため、手袋の着用や眼の保護などの予防策を常に講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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学ぶ 非変性PAGEとウェスタンブロットを用いたヒトMxAタンパク質のオリゴマー状態評価法。精製不要で細胞溶解液から直接解析でき、細胞生物学研究におけるタンパク質複合体のサブユニット数決定に有用です。

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

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