非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

この実験の全体的な目的は、非変性ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、細胞溶解液中のホモオリゴマータンパク質複合体のサブユニット数を決定することです。この手法は、基本的な細胞プロセスに関与するタンパク質のオリゴマー状態など、細胞生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、ホモオリゴマータンパク質複合体の精製や、特殊で高価な装置を必要としないことです。

したがって、ほとんどの研究室で実施可能です。本実験では、内因性Myxovirus resistance Aタンパク質（MxA）を発現するA549細胞と、MxAを過剰発現するバイロセルの2種類の細胞を使用します。

A549細胞およびバイロセルを、1ウェルあたり2 mLの成長培地を用いて6ウェルプレートに播種します。細胞培養インキュベーター内で一晩インキュベートし、翌日に細胞を回収します。

各ウェルを1 mLのPBSで洗浄し、0.25% Trypsin-EDTA溶液を0.5 mL加えて、室温で約5分間置いて細胞を剥離させます。細胞がプレートから剥離し次第、0.5 mLの増殖培地を加え、ピペッティングによって慎重に混合します。各ウェルの細胞を2 mLチューブに移し、卓上遠心機を用いてペレット化します。

細胞ペレットを乱さないよう、ピペットを用いて上清を慎重に取り除きます。1 mLの氷冷PBSを加え、細胞懸濁液を慎重にピペッティングして細胞を洗浄します。卓上遠心分離機で細胞をペレット化します。

細胞ペレットを剥がさないように、ピペットを用いて上澄み液を慎重に取り除きます。氷冷したライシスバッファーを 200 microliters 加え、ピペッティングで細胞を再懸濁し、氷上に置きます。ライシスバッファーに含まれるヨードアセトアミドは光に敏感であるため、すぐにチューブをアルミホイルで包み、溶解物を遮光してください。

氷上で30分間インキュベートします。ヨードアセトアミドは、チオエーテル結合を形成することでフリーシステインのチオール基を不可逆的に保護し、タンパク質の人工的な凝集を防ぐため、その使用は不可欠です。次に、あらかじめ冷却した卓上遠心機で遠心分離し、細胞残渣を除去します。

遠心分離の間、分画分子量10,000の透析カラムを準備します。透析カラムをフロートブイに取り付け、あらかじめ冷却した透析バッファーを満たしたビーカーに入れて、カラムを平衡化させます。この際、メンブレンに触れないようにしてください。

ビーカーにマグネチックスターラーを入れ、ビーカーを低温室へ移動させます。マグネチックスターラーを用いて穏やかに撹拌しながら、4°Cで20分間平衡化させます。20分後、透析緩衝液とフロートブイからカラムを取り出します。

メンブレンに触れないようにピペッティングを行い、精製したライセートを準備した透析カラムに転移させます。カラムをフロートブイに取り付けます。透析バッファーを満たしたビーカーにカラムを戻し、ビーカーを低温室へ移動させます。

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を妨害する可能性のある低分子代謝物や塩を除去するため、マグネチックスターラーで慎重に撹拌しながら、4 °Cで少なくとも4時間、溶出液を透析させます。透析が完了したら、透析した各サンプルを1.5 mLチューブに移します。卓上遠心分離機を用いて遠心分離し、沈殿物を除去します。

オリゴマータンパク質複合体の解離を防ぐため、ライセートの透析後、直ちに電気泳動を行う必要があります。内側および外側のゲルチャンバーに、あらかじめ冷却した泳動バッファーを満たします。非変性ポリアクリルアミドゲルを、あらかじめ冷却した泳動バッファーを用い、1ゲルあたり25 mAの電流で4°Cにて15分間プリランします。

調製したライセート 15 µLに、4Xサンプルバッファー 5 µLを混合します。任意のネイティブタンパク質標準と、サンプル 15 µLをゲルにロードします。4 °Cで、25 mAで4時間、ゲル電気泳動を行います。

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の完了後、ゲルを取り出し、注意深くSDSバッファーに転移させます。室温で10分間、緩やかに振盪しながらインキュベートします。ゲル1枚につき、スポンジ2枚、セルロースフィルターペーパー4枚、およびブロッティング膜を用意し、それらをブロッティングバッファーに浸します。

下から上の順に、スポンジ1枚、セルロースフィルターペーパー2枚、ブロッティング膜、ゲル、セルロースフィルターペーパー2枚、スポンジ1枚の順でサンドイッチを組み立てます。ゲルがマイナス極に、膜がプラス極に向くようにして、サンドイッチをブロッティングタンクに入れます。

ブロッティングタンクに、あらかじめ冷却しておいたブロッティングバッファーを満たします。タンパク質の転写効率を最適にするため、4°Cで90 mA、一晩ブロッティングを行います。翌日、サンドイッチを解体します。

メンブレンをPonceau S溶液中で室温で5分間インキュベートし、プロテインスタンダードを可視化します。メンブレンを脱イオン水に入れ、洗浄して脱色します。メンブレンをトレイに移した後、ペンを用いてプロテインスタンダードのバンドに印を付けます。

ブロッキングバッファーを用いて、室温で1時間以上、または4°Cで一晩、メンブレンをブロッキングします。続いて、テキストプロトコルに記載されている通り、MxAに対するウサギポリクローナル抗体を用いた免疫染色により、目的タンパク質を可視化します。内因性MxAを欠損したVirocellsに、野生型リコンビナントMxA、および単量体および二量体のMxA変異体をトランスフェクションしました。

リコンビナントMxA変異体が予想される分子量で泳動されたことにより、そのオリゴマー状態が確認されました。異所性に発現させた野生型MxAは、テトラマーとして泳動されました。これらのリコンビナントタンパク質を用いて、インターフェロンα刺激を受けたA549細胞由来の内因性ヒトMxAタンパク質のオリゴマー状態を評価しました。

その結果、インターフェロンαで刺激したA549細胞のライセートにおけるMxAのサイズが四量体に相当することが明らかになりました。この手法に習熟すれば、適切に実施することで1日半で完了させることができます。本手順を行う際は、タンパク質相互作用の破壊やタンパク質凝集を引き起こす可能性があるため、全工程を通じてサンプルの凍結融解を避けることが重要です。

さらに、ヨードアセトアミドのような光感受性試薬を扱う際は、溶解ステップにおいてサンプルを光から保護することが重要です。非変性SDS-PAGEの後、酵素活性の解析や、潜在的なヘテロオリゴマー複合体の特性評価といったさらなる疑問を解決するために、タンパク質ゲルの切り出しや酵素活性測定、あるいは二次元PAGEなどの手法を行うことができます。この技術の開発により、細胞生物学分野の研究者が培養細胞におけるオリゴマータンパク質複合体の組成を探索する道が開かれました。

このビデオを視聴することで、非変性PAGE分析を用いてオリゴマータンパク質を研究するための、細胞培養物からの細胞溶解液の調製方法について十分に理解できるはずです。ヨードアセトアミドの取り扱いは極めて危険であるため、手袋の着用や眼の保護などの予防策を常に講じることを忘れないでください。