非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション
October 28th, 2016
この記事では、非変性PAGEとウェスタンブロット分析の組み合わせを使用して、ヒト細胞のライセートからのダイナミン様GTPase MxAタンパク質のオリゴマー状態を評価するための簡単で迅速なプロトコルについて説明します。
この実験の全体的な目標は、非変性ナトリウムドデコスルフェート-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、細胞溶解物中のホモオリゴマータンパク質複合体のサブユニットの数を決定することです。この方法は、基本的な細胞プロセスに関与するタンパク質のオリゴマー状態など、細胞生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ホモオリゴマータンパク質複合体の精製や特殊な高価な装置を必要としないことです。
したがって、ほとんどの研究室で実施できます。この実験では、2種類の細胞を利用しています。内因性ミクソウイルス耐性Aタンパク質、またはMxAを発現するA549細胞;MxAを過剰発現するウイルス細胞。
A549細胞とバイロセルを、ウェルあたり2ミリリットルの成長培地を含む6つのウェル皿に播種します。細胞培養インキュベーターで細胞を一晩インキュベートします。翌日、細胞を採取します。
各ウェルを1ミリリットルのPBSで洗浄し、0.5ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTA溶液を室温で約5分間加えて細胞を接着します。細胞が皿から離れたらすぐに、0.5ミリリットルの増殖培地を加え、ピペッティングで上下に慎重に混合します。各ウェルの細胞を2ミリリットルのチューブに移し、卓上遠心分離機を使用してペレット
化します。細胞ペレットを乱さないようにピペッティングして上清を慎重に取り除きます。1ミリリットルの氷冷PBSを加え、細胞懸濁液を慎重にピペッティングして細胞を洗浄します。テーブルトップ遠心分離機で細胞をペレット
化します。細胞ペレットを剥がさずにピペッティングして上清を慎重に取り除きます。200マイクロリットルの氷冷溶解バッファーを加え、ピペッティングで上下させて細胞を再懸濁し、氷の上に置きます。溶解バッファー中のヨードアセトアミドは光感受性であるため、チューブをスズホイルで覆うことにより、ライセートを光から直ちに保護してください。
氷上で30分間インキュベートします。ヨードアセトアミドは、チオエーテル結合を形成することにより遊離システインのチオール基を不可逆的に保護し、人工的なタンパク質凝集を防ぐため、ヨードアセトアミドの使用は非常に重要です。次に、事前に冷却した卓上型遠心分離機で遠心分離することにより、細胞破片を除去します。
遠心分離中に、分子量カットオフが10, 000の透析カラムを準備します。透析カラムをフロートブイに取り付け、事前に冷却した透析バッファーを充填したビーカーに入れてカラムを平衡化します。メンブレンには触れないでください。
マグネチックスターラーをビーカーに入れ、ビーカーを冷蔵室に移します。マグネチックスターラーを使用して穏やかに攪拌し、摂氏4度で20分間平衡化します。20分後、透析バッファーとフロートブイからカラムを取り外します。
透明化したライセートを、メンブレンに触れずにピペッティングして調製した透析カラムに移します。列をフロートブイに取り付けます。それらを透析緩衝液で満たされたビーカーに戻し、ビーカーを冷蔵室に移します。
ライセートを摂氏4度で少なくとも4時間透析し、マグネチックスターラーで慎重に攪拌しながら、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を妨げる可能性のある小さな代謝物や塩を除去します。透析が完了したら、透析した各サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。テーブルトップ遠心分離機で遠心分離することにより、沈殿物を除去します。
電気泳動は、オリゴマータンパク質複合体の解離を防ぐために、ライセートの透析直後に行う必要があります。内側と外側のゲルチャンバーに、あらかじめ冷却したランニングバッファーを充填します。非変性ポリアクリルアミドゲルを、予め冷却したランニングバッファーと共に、ゲルあたり25ミリアンペアで摂氏4度で15分間、事前に分析します。
調製したライセート15マイクロリットルを4Xサンプルバッファー5マイクロリットルと混合します。選択したネイティブタンパク質標準試料と15マイクロリットルのサンプルをゲルにロードします。ゲルを25ミリアンペアで摂氏4度で4時間泳ぎます。
非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動が完了したら、ゲルを分解し、慎重にSDSバッファーに移します。室温で10分間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。スポンジ2枚、セルロースフィルターペーパーシート4枚、ブロッティングメンブレン1枚をゲルごとに調製し、ブロッティングバッファーに浸します。
サンドイッチを下から上に次のように組み立てます。スポンジ1枚、セルロース濾紙シート2枚、吸い取り膜、ゲル、セルロース濾紙シート2枚、スポンジ1枚。サンドイッチをブロッティングタンクに入れ、メンブレンがプラス極を向いており、ゲルがマイナス極を向いていることを確認します。
ブロッティングタンクに、あらかじめ冷却したブロッティングバッファーを充填します。最良のタンパク質導入結果を得るには、90ミリアンペアで摂氏4度で一晩ブロットします。翌日、サンドイッチを分解します。
メンブレンをPonceau S溶液中で室温で5分間インキュベートし、タンパク質標準試料を可視化します。メンブレンを脱イオン水に入れて洗浄することにより、メンブレンを脱汚します。メンブレンをトレイに移した後、ペンを使用してタンパク質標準のバンドに印を付けます。
メンブレンをブロッキングバッファーで少なくとも1時間、室温で少なくとも1時間、または摂氏4度で一晩ブロックします。続いて、目的のタンパク質を、テキストプロトコルに記載されているように、MxAに対するウサギポリクローナル抗体を用いた免疫染色により可視化します。内因性MxAを欠くウイルス細胞に、組換え野生型MxAおよび単量体および二量体MxA分散をトランスフェクションしました。
組換えMxA分散を予想分子量で移動させることで、そのオリゴマー状態が確認されました。異所性発現野生型MxAは、四量体として移動した。次に、これらの組換えタンパク質を使用して、インターフェロンアルファ刺激A549細胞に由来する内因性ヒトMxAタンパク質のオリゴマー状態を評価しました。
その結果、インターフェロンα刺激A549細胞のライセート中のMxAのサイズが四量体に対応することが明らかになりました。一度習得すれば、このテクニックは適切に実行されれば1日半で行うことができます。この手順を試みる際は、タンパク質の相互作用を破壊したり、タンパク質の凝集を引き起こしたりする可能性があるため、手順全体でサンプルを凍結および解凍しないことを覚えておくことが重要です。
さらに、ヨードアセトアミドのような光感受性試薬を使用する場合は、溶解ステップ中にサンプルを光から保護することが重要です。非変性SDS-PAGEに続いて、タンパク質ゲル抽出や酵素活性AsiS、または二次次元PAGEなどの他の方法を実行して、酵素活性や潜在的なヘテロオリゴマー複合体の特性評価などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、細胞生物学の分野の研究者が培養細胞内のオリゴマータンパク質複合体の組成を探索する道を開きました。
このビデオを見れば、非変性PAGE解析でオリゴマータンパク質を研究するために、細胞培養物から細胞ライセートを調製する方法を十分に理解できるはずです。ヨードアセトアミドの使用は非常に危険である可能性があるため、手袋の着用や目の保護具などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この記事では、非変性PAGEとウェスタンブロット分析を使用してMxAタンパク質のオリゴマー状態を評価するための迅速なプロトコルについて説明します。この方法は、ヒト細胞由来の細胞溶解物に適用可能です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- タンパク質分析
- 生化学
背景
- タンパク質のオリゴマー状態を理解することは細胞生物学において重要です。
- ホモオリゴマータンパク質複合体は細胞プロセスにおいて重要な役割を果たします。
- 従来の方法では多くの場合タンパク質の精製が必要であり、これが面倒です。
- このプロトコルでは細胞溶解物から直接分析することができます。
研究目的
- ホモオリゴマータンパク質複合体のサブユニット数を決定する。
- 異なる細胞タイプにおけるMxAタンパク質のオリゴマー状態を評価する。
- ほとんどの研究室でアクセス可能な簡単な方法を提供する。
使用された方法
- 非変性ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）。
- タンパク質検出のためのウェスタンブロット分析。
- MxA発現分析のためのA549細胞とvirocellの使用。
- 精製の必要なしに細胞溶解物を分析。
主要な結果
- 細胞溶解物からのMxAオリゴマー状態の評価に成功。
- 標準的な研究室環境でこの方法の実現可能性を示しました。
- 細胞プロセスにおけるタンパク質の役割に関する洞察を提供。
- 非精製技術の利点を強調。
結論
- このプロトコルはタンパク質オリゴマー化の分析に効果的です。
- 細胞生物学の様々な研究文脈で利用可能です。
- この方法はタンパク質複合体を研究する研究者にとってのアクセス性を向上させます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Assessing the oligomeric state of antiviral proteins like MxA directly from cell lysates enables mechanistic de-risking of target hypotheses in early discovery. This non-denaturing PAGE approach supports target validation by linking functional oligomeric forms to antiviral activity without requiring protein purification. The method provides a scalable, reproducible readout for evaluating mutant phenotypes in a disease-relevant system, informing lead identification and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating MxA oligomeric states with antiviral function.
- Operational Value: Enables functional target validation using endogenous or ectopic expression in human cell lines.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing active oligomeric complexes from inactive monomers or aggregates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized lysates for downstream screening of MxA modulators or interface mutants.
- Quantitative Output: Generates resolvable oligomeric bands (monomer, dimer, tetramer) for comparative analysis across conditions.
- Reproducibility: Uses dialysis and light-protected lysis to minimize artifactual aggregation, ensuring consistent complex detection.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Evaluates MxA oligomerization in interferon-stimulated A549 cells, a physiologically relevant model of antiviral response.
- Translational Continuity: Links oligomeric state to antiviral phenotype, supporting biomarker-aligned target assessment.
- Preclinical De-risking: Enables structure-function analysis of MxA mutants to guide therapeutic candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling oligomerization assessment after target engagement but before lead optimization, particularly for GTPase-mediated antiviral targets.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about oligomerization-dependent activity without perturbing native complexes.
- Screening: Delivers quantitative electrophoretic readouts to compare wild-type and mutant protein assemblies.
- Analytics: Provides subunit resolution via native PAGE, enabling densitometric comparison of oligomeric populations.
- Translational Research: Connects biochemical state to antiviral function in human cells, supporting target confidence.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other dynamin-like GTPases or oligomeric signaling proteins in antiviral or innate immunity pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the active oligomeric state of MxA.
- Operational Value: Employs standard lab equipment (centrifuge, gel apparatus, blotter) avoiding specialized infrastructure.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by validating whether observed antiviral effects correlate with defined oligomeric species.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of MxA-targeted strategies based on oligomerization competence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE, dialysis, and western blotting to preserve labile complexes.
- Needs pre-chilled buffers, magnetic stirrer, dialysis columns (10 kDa cutoff), and light-protected handling of iodoacetamide.
- Demands standardized lysis and dialysis protocols across teams to prevent variability in oligomer detection.
- Must avoid freeze-thaw cycles and protease activity to maintain complex integrity during sample prep.
- Limited to detecting stable oligomers; transient or weak interactions may require crosslinking or orthogonal validation.
