過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

このマルチプレックス核酸定量プロトコルの全体的な目標は、全血中のマイクロRNA発現をデジタル定量することです。この方法は、消化器疾患の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。これは、調節不全の分子メカニズムやマイクロRNAなどのバイオマーカーシグネチャーの同定に役立ちます。

この手法の主な利点は、マイクロRNAの定量が増幅に依存しないことです。この技術は、分子標的をデジタルでカウントし、大部分が自動化されています。全RNAを精製するには、以前に収集して凍結した全血サンプルを解凍してインキュベートします。

スイングバケットローターを使用して、チューブを室温で 5, 000 倍 g で 10 分間遠心分離します。次に、ペレットを乱さないように注意しながら、上清を廃液チューブに慎重に注ぐかピペッティングして上清を取り除きます。ペレットに4ミリリットルのRNaseフリー水を加えます。

キャップをしっかりと元に戻し、ペレットが目に見える形で溶解するまで渦巻きにします。その後、チューブを再度遠心分離し、上清を取り除きます。次に、350マイクロリットルのBM1バッファーをペレットに加え、ペレットが目に見える形で溶解するまでボルテックスします。

次に、サンプルを2ミリリットルの処理チューブに移し、自動トータルRNA抽出を行います。市販のRNA抽出キットを用いて、RNA精製キットにあらかじめ搭載されているピペットチップ、遠心チューブ、バッファー、試薬をロボットRNA抽出システムにロードし、全血サンプルからマイクロRNAを含む細胞内RNAを自動精製します。プロトコール選択メニューからBlood miRNA PartAプロトコールを選択し、ランを開始します。

RNA抽出を完了し、テキストプロトコルに従ってサンプルを保存します。まず、RNaseフリー水を使用してmicroRNAサンプルを調製し、12個のRNAサンプルを1マイクロリットルあたり33ナノグラムに正規化します。ヌクレアーゼフリーの水で、アッセイキットに含まれているmicroRNAコントロールを500分の1に希釈して調製し、氷上に保管します。

次に、13マイクロリットルのアニーリングバッファー、26マイクロリットルのマイクロRタグ試薬、および6.5マイクロリットルのマイクロRNAコントロールを組み合わせて、アニーリングマスターミックスを調製します。12本の0.2ミリリットルのストリップチューブのそれぞれに、3.5マイクロリットルのアニーリングマスターミックスを加え、次に3マイクロリットルのRNAサンプルを追加します。チューブをフリックして混合し、ベンチトップのミニ微量遠心分離機で2000 gで回転させ、次のプログラムを使用してサーモサイクラーでチューブを運転します。

次に、3マイクロリットルのライゲーションバッファーと19.5マイクロリットルのPEGを組み合わせて、ライゲーションマスターミックスを調製します。次に、各反応に2.5マイクロリットルのライゲーションマスターミックスを加えます。チューブを混合して回転させた後、摂氏48度のサーモサイクラーに5分間戻します。

次に、サーモサイクラーブロック内に1マイクロリットルのリガーゼを直接各サンプルに加え、次のプログラムを使用してチューブをインキュベートします。チューブを穏やかに混合してスピンダウンし、各サンプルに1マイクロリットルのライゲーションクリーンアップ酵素を加えます。次に、ここに示すようにサーモサイクラーでチューブをインキュベートします。

インキュベーション後、サンプルに40マイクロリットルのRNaseフリー水を加えてから、サンプルを混合してスピンダウンします。マイクロRNAハイブリダイゼーションを行うには、氷上に設けられたレポーターとキャプチャープローブセットを解凍し、スピンダウンします。130マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーをReporterコードセット2に追加し、混合してハイブリダイゼーションマスターミックスを作成します。

12本の新しい0.2ミリリットルストリップチューブに、20マイクロリットルのハイブリダイゼーションマスターミックスを追加します。調製したばかりのmicroRNAサンプルを摂氏85度で5分間変性させ、氷上で冷却します。次に、5マイクロリットルのマイクロRNAサンプルを、ハイブリダイゼーションマスターミックスを含む各ストリップチューブに加えます。

サーモサイクラーを摂氏65度、体積計算温度30マイクロリットルにプログラムし、加熱された蓋をフォーエバー時間設定でプログラムして、実行の終了時に摂氏4度まで下がらないようにします。各チューブにセットしたキャプチャープローブを5マイクロリットル加え、混合します。次に、それらを回転させた後、すぐにチューブを摂氏65度のサーモサイクラーに入れます。

サンプルを12時間以上、30時間以内でインキュベートします。まず、カートリッジとプレートを室温まで温めて、プレップステーションをセットアップします。次に、プレートを回転させます。

プレップステーションをロードするには、ステーションのドアを開け、試薬プレート、カートリッジ、ピペットチップ、準備したサンプルを0.2ミリリットルのストリップチューブに、空の0.2ミリリットルの12チューブストリップチューブ2本をロボットの適切な場所にロードします。ストリップチューブキャップと試薬プレートカバーを取り外します。次に、プレップステーションのドアを閉め、コントロールパネルから適切なアッセイを実行します。

固定化され配向された三者複合体のバーコードを視覚化してカウントするには、カートリッジを準備ステーションから取り外し、付属のカバーを使用して密封し、デジタルアナライザーの使用可能なスロットに配置します。タッチ・スクリーンを使用して、カートリッジ定義ファイル(CDF)を作成します。CDFの各サンプルに適切なレポーターライブラリファイルが作成されていることを確認します。

スキャンが完了したら、関連するQCおよび分析プロトコルに従ってデータを処理および分析する前に、USBドライブまたは電子メールを使用してデジタルアナライザからデータファイルをダウンロードします。遺伝子発現プラットフォームアッセイシステムは、高度に自動化された性質により技術的なノイズを低減し、使用する独自のケミストリーにより高精度の遺伝子発現データを生成します。ここに示すテクニカルレプリケートは、内因性およびウイルスのマイクロRNA発現定量化において高い再現性が可能であることを示しています。

この方法を使用すると、健康な研究参加者が定義する、期待される発現からの逸脱を示すウイルスコードおよび内因性のヒトマイクロRNAを、IBSの関心のあるターゲットとして特定できます。この方法の精度と感度により、低発現ターゲット間の摂動を検出することができ、微妙な摂動も確実に観察できます。これらの図は、健康な対照群と比較した、IBSおよびIBSサブタイプの循環マイクロRNAにおける摂動の一部を示しています。

ここでは、IBS参加者で有意に差次的に上昇した2つのマイクロRNAを紹介します。このバイオリンプロットの曲線は、miR-150のカウントの頻度を示しています。縦棒は第 1 四分位数と第 3 四分位数を表し、赤い四角は中央値を示します。

この手順に続いて、同じ技術に基づくよりターゲットを絞ったカスタムアッセイを実施して、より大きなコホートにおけるバイオマーカーシグネチャーを検証し、重要なRNAおよびタンパク質の関連性を探索できます。この技術は、その開発後、生物医学研究の分野の研究者が、正確かつ正確に、疾患の診断用バイオマーカーパネルを迅速に開発する道を開きました。