過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

このマルチプレックス核酸定量プロトコルの全体的な目的は、全血中のmicroRNA発現をデジタル定量することです。この手法は、消化器疾患の研究における重要な疑問への回答に寄与します。また、microRNAなどの調節不全に陥った分子メカニズムやバイオマーカーシグネチャーの同定に役立ちます。

この手法の主な利点は、microRNAの定量に増幅を必要としないことです。この技術は分子標的にデジタル的にカウントを行い、大部分が自動化されています。全RNAを精製するために、あらかじめ採取して凍結しておいた全血検体を解凍し、2時間インキュベートします。

スイングバケットローターを用い、室温で10分間、5,000 ×gでチューブを遠心分離します。次に、ペレットを乱さないように注意しながら、上清を慎重に傾けて捨てるか、ピペットで吸い出して廃棄チューブに移します。ペレットに4 mLのRNase-free waterを加えます。

キャップをしっかりと閉め、ペレットが完全に溶解するまでボルテックスします。その後、チューブを再度遠心分離し、上清を除去します。次に、ペレットに350 µLのBM1バッファーを加え、ペレットが完全に溶解するまでボルテックスします。

次に、サンプルを2 mLの処理チューブに移し、全RNAの自動抽出を行います。市販のRNA抽出キットを用い、RNA精製キットに付属のプリロード済みピペットチップ、遠心チューブ、バッファー、および試薬をロボットRNA抽出システムにセットし、全血サンプルからのmicroRNAを含む細胞内RNAの自動精製を実施します。プロトコル選択メニューから「Blood miRNA PartA」プロトコルを選択し、ランを開始します。

RNA抽出を完了し、テキストプロトコルに従ってサンプルを保存します。まず、RNase-free waterを用いて12個のRNAサンプルの濃度を33 nanograms per microliterに標準化し、microRNAサンプルを調製します。アッセイキットに付属のmicroRNAコントロールをnuclease-free waterで500倍希釈し、氷上で保持します。

次に、13 µLのアニーリングバッファー、26 µLのmicro R-tag試薬、および6.5 µLのmicroRNAコントロールを混合して、アニーリングマスターミックスを調製します。12本の0.2 mLストリップチューブに、アニーリングマスターミックスを3.5 µLずつ加え、続いてRNAサンプルを3 µL加えます。チューブを軽く弾いて混合し、ベンチトップミニ遠心機を用いて2000 ×gでスピンダウンさせ、以下のプログラムを用いてサーモサイクラーで処理します。

次に、3 µLのライゲーションバッファーと19.5 µLのPEGを混合して、ライゲーションマスターミックスを調製します。その後、各反応チューブにライゲーションマスターミックスを2.5 µLずつ加えます。混合してチューブをスピンダウンさせた後、サーモサイクラーに戻し、48 °Cで5分間反応させます。

次に、サーモサイクラーのブロックに入れたまま、各サンプルにリガーゼを1 µL直接加え、以下のプログラムを用いてチューブをインキュベートします。チューブを緩やかに混ぜてスピンダウンさせ、各サンプルにライゲーションクリーンアップ酵素を1 µL加えます。その後、ここに示すようにサーモサイクラーでチューブをインキュベートします。

インキュベーション後、サンプルに40 µLのRNaseフリー水を加え、混合して遠心分離します。microRNAハイブリダイゼーションを行うには、氷上で提供されたレポーターおよびキャプチャープローブセットを融解し、遠心分離します。Reporter Code Set 2に130 µLのハイブリダイゼーションバッファーを加え、混合してハイブリダイゼーションマスターミックスを作成します。

12本の新しい0.2 mLストリップチューブに、ハイブリダイゼーションマスターミックスを20 µLずつ加えます。調製したばかりのmicroRNAサンプルを85 °Cで5分間変性させ、氷上で冷却します。その後、ハイブリダイゼーションマスターミックスを含む各ストリップチューブに、microRNAサンプルを5 µLずつ加えます。

サーモサイクラーを65°Cに設定し、液量30 µLで温度計算を行い、加熱リッドをForever設定にして、ラン終了時に4°Cまで温度が下がらないようにします。各チューブにキャプチャープローブセットを5 µL加え、混合します。その後、スピンダウンして、すぐにチューブを65°Cに設定したサーモサイクラーに入れます。

サンプルを12時間以上30時間以内でインキュベートします。まずカートリッジとプレートを室温まで温め、準備ステーションをセットアップします。その後、プレートをスピンダウンします。

プリップステーションにセットするには、ステーションのドアを開き、試薬プレート、カートリッジ、ピペットチップ、0.2 mLストリップチューブに入った調製済みサンプル、および空の0.2 mL 12連ストリップチューブ2本を、ロボット内の適切な位置にロードします。ストリップチューブのキャップと試薬プレートのカバーを取り除きます。その後、プリップステーションのドアを閉じ、コントロールパネルから適切なアッセイを実行します。

固定化および配向した三部構成複合体のバーコードを可視化してカウントするため、カートリッジを調製ステーションから取り出し、付属のカバーで密封して、デジタルアナライザーの空いているスロットに配置します。タッチスクリーンを使用して、カートリッジ定義ファイル（CDF）を作成します。CDF内で、各サンプルに適切なリポーターライブラリファイルが割り当てられていることを確認してください。

スキャニングが完了したら、関連するQCおよび解析プロトコルに従い、データの処理と解析を行う前に、USBドライブまたは電子メールを使用してデジタルアナライザーからデータファイルをダウンロードします。遺伝子発現プラットフォームアッセイシステムは、高度に自動化されているためテクニカルノイズが低減されており、独自の化学反応を用いることで高精度の遺伝子発現データを生成します。ここで示すテクニカルレプリケートは、内因性およびウイルス性microRNAの発現定量において、高い再現性が得られることを証明しています。

この手法を用いることで、健康な被験者によって定義される期待される発現量から逸脱を示す、ウイルス由来およびヒト内因性マイクロRNAを、IBSにおける標的として同定することができます。本手法の精度と感度により、低発現の標的における変動の検出が可能であり、微細な変動も確実に観察することができます。これらの図は、健康な対照群と比較した、IBSおよびIBSのサブタイプにおける血中マイクロRNAの変動の一部を示しています。

IBS患者において最も有意に上昇していた2種類のmicroRNAをここに示します。このバイオリンプロットの曲線は、miR-150のカウント頻度を表しています。垂直のバーは第1四分位数および第3四分位数を示し、赤色の正方形はカウントの中央値を示しています。

この手順に従い、同じ技術に基づいたより標的を絞ったカスタムアッセイを実施することで、より大規模なコホートにおけるバイオマーカーシグネチャーの検証や、不可欠なRNAおよびタンパク質の関連性の探索を行うことができます。開発後、この技術は生物医学研究分野の研究者が、疾患の診断バイオマーカーパネルを迅速かつ精密かつ正確に開発することを可能にしました。