Name: 拘束と自由飛行ミツバチの神経薬理学的操作、アピスミツバチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学ぶ ミツバチの神経薬理学的操作方法。拘束および自由飛行状態のApis melliferaに薬剤を経口投与または胸部・単眼・単眼道への局所注射により投与し、社会行動の神経機構や学習記憶の神経生物学を研究する手法を解説します。

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このプロジェクトは、ARC助成金DP0986021とNHMRC助成金585442によって資金提供されました。ABBは、ARCフューチャーフェローシップ(FT140100452)の支援を受けています。JAPは、マッコーリー大学が授与するiMQRES奨学金と、ドイツ学術交流会が授与するDAAD-Doktorandenstipendiumによって支援されています。JMDは、CNRSとポール・サバティエ大学の支援を受けています。

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著者らは開示するものは何もない。

上記概説した方法は、自由飛行または活かしたミツバチのいずれかの、単純な効果的かつ堅牢な治療を可能にします。これらの方法は、多くの実験パラダイムおよび生物学的質問（ 表1）と互換性があります。自由飛行方法のすべてを容易に活用ハチに適用することができます。逆に、一時的な拘束や侵襲的な治療法は、多くの場合、ミツバチ「飛行能力を損なう可能性があるため、しかし、あまり成功しています。 方法は、脳中心の視点から提示されました。これはむしろので筆者の個人的な興味の、技術の固有の制限によるものではありません。これらの方法は、他の臓器を研究するために使用することができない理由はありません。しかし、小さな変更は、他の器官系への方法をより適切にするために必要とされる場合があります。局所治療が脳に到達することを意図している間、例えば、典型的には胸部に適用され、Th1を適用する方がよいかもしれません腹部への意図されたターゲットが卵巣である場合。同様に、注射が容易に胸部や頭部以外の領域にも適用することができる（ 例えば、腹部臓器、腹部sclerites間に注...

カール・フォン・フリッシュが彼らのダンスの言語1を明らかにしているので、ミツバチは、動物の行動と神経生物学の研究者のための普及研究種残っていました。近年では新しい分野の無数のは、これらの二つのフィールド、およびそれらと並んで生じているいくつかの他の分野（ 例えば、分子生物学、ゲノミクス、およびコンピュータサイエンス）の交差点に浮上しています。これは、神経系内のアクティビティからどのように行動の結果を理解するための新しい理論やモデルの急速な発展につながっています。そのためのユニークなライフスタイル、豊かな行動レパートリー、実験および薬理学的操作の容易さ、ミツバチはこの革命の最前線で推移しています。 ミツバチは、学習と記憶2,3、4意思決定、嗅覚5、または視覚処理6の根底にあるものなど、基本的な神経生物学的な質問を研究するために使用されています。近年では、ほん11、睡眠12、13を老化、または麻酔14のメカニズム- EYの蜂はあっても、そのような依存性薬物7の効果として、一般的に医学研究のために予約トピックを研究するためのモデルとして使用されています。 これは現在、15を変更しているが、古典的な遺伝的モデル生物（ 例えば 、 キイロショウジョウバエ 、 線虫 、M.の筋 ）のためとは異なり、ミツバチに神経機能を操作するために利用可能な非常に少数の遺伝子ツールは、あります。その代わりに、ミツバチの研究は、主に、薬理学的操作に頼ってきました。これは非常に成功しています。しかしながら、ミツバチ研究の多様性は、薬理学的投与のための方法の範囲が必要とされるようなものです。ミツバチでの研究は、異なる分野や背景の研究者によって研究され、非常に多様な質問に対処し、かつ実験的アプローチの様々なを使用しています。多くのRESEアーチの質問は自由に植民地に相互作用し、自由飛行すること、またはその両方のいずれかにミツバチが必要です。これは、困難な個々の実験動物を追跡することを可能にする、および拘束またはカニューレ挿入不可能になることができます。 ミツバチ研究の多様性に対応するために、薬物送達の様々な方法は、薬物動態学的および薬力学的プロファイル、方法の侵襲性、及びその信頼性は、問題のパラダイムに合うようにしながら、堅牢で柔軟な管理を可能にする、必要とされています。そのため、これらの多様なニーズ、ほとんどの研究グループは、独自の薬物投与方法を開発しました。これまでのところ、これは蜂の研究コミュニティの強さとなっています。それは、さまざまな状況における同じ薬剤の投与を可能にする方法のアレイの開発につながりました。ここでの私たちの目標は、蜂の薬理学的操作のための単一の標準化された方法を開発することではなく、そのメソッドを強調することではありません特に成功であることが証明され、研究者がこれらの導入を支援しています。私たちは、基本的な彼らがどのように動作するかの原則、ならびにそれらの利点と欠点について説明します。

<table><tbody><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>どのサプライヤーも行います</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49159</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>保護ワックス</td><td>Dentaurum</td><td>124-305-00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>95% エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>23 G NanoFil 針</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>非常に細かい forsceps</td><td>Dumont</td><td>0208-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>電極プーラー</td><td>SRI</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet マイクロインジェクター</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.01</td><td></td></tr><tr><td>Eicosane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>219274</td><td></td></tr><tr><td>手動マイクロマニピュレーター</td><td>Brinkmann Instrumentenbau</td><td>MM-33</td><td></td></tr><tr><td>電子マイクロマニピュレーター</td><td>Luigs &Neumann Feinmechanik + Elektortechnik</td><td>ジュニアユニット XYZ</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>はんだごて</td><td>Weller</td><td>WESD51</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22911</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22912</td><td></td></tr><tr><td>小型シャーレ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 遠心分離管</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>オーストラリア昆虫学用品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブレードホルダーとブレーカー</td><td>オーストラリア昆虫学用品</td><td>E130</td><td></td></tr><tr><td>フェザー 両刃カミソリ刃</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-949-135</td><td></td></tr>ニ<tr><td>クロム線</td><td></td><td></td><td>任意のサプライヤーが行う</td></tr><tr><td>電線</td><td></td><td></td><td>任意のサプライヤーは行う</td></tr><tr><td>モデルペイント</td><td>タミヤUSA</td><td>色</td><td></td>によります</tr><tr><td>リピーティングディスペンサー</td><td>ハミルトン社</td><td>PB-600-1</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシリンジ</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>蛍光表示システム</td><td>Nightsea</td><td>SFR-GR</td><td></td></tr><tr><td>目盛</td><td>ProSciTech</td><td>S8014-24</td><td></td></tr><tr><td>マイクロキャピラリーホルダー付き</td><td>Drummond</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>液体シリコーン</td><td></td><td></td><td>どのサプライヤーも熱</td></tr><tr><td>電対</td><td>を行います Digitech</td><td>QM-1324</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

拘束と自由飛行ミツバチの神経薬理学的操作、<em&gt;アピスミツバチ</em

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

ミツバチは、驚異的な学習能力と高度な社会的行動との通信を示しています。また、彼らの脳は、小さな視覚化すると勉強するのは簡単です。したがって、蜂は長い社会的、自然な行動の神経基盤を研究するための神経生物学者とneuroethologistsの間で好まれるモデルとなっています。これは、ハチを研究するために使用される実験技術は挙動が検討されて干渉しないことが重要です。このため、ミツバチの薬理学的操作のための技術の範囲を開発する必要がありました。本稿では、薬理学的物質の広い範囲で拘束またはフリー飛行ミツバチを治療するための方法を実証します。これらは、経口および局所治療だけでなく、全身的または局所的ないずれかの方法で正確な薬物送達を可能にする、より侵襲的な方法として非侵襲的方法の両方を含みます。最後に、私たちは、それぞれの方法の長所と短所を議論し、説明します最善の方法、それらを克服するために、共通のハードルと。私たちは、生物学的な質問ではなく、他の方法で回避に実験方法を適応させることの重要性についての議論と結論付けています。

上述した方法のための代表的な結果の選択は、主に方法は、薬剤が脳に到達することを可能にし、ミツバチの挙動に影響を与えることを実証するために示されています。 脳のプロセス上の具体的な効果は簡単に胸部注射後に取得することができます。 薬理学的薬剤が体内に複数のターゲットに作用することができ、脳に到達する前に体内に希釈します胸部を介して注入するので、この技術は、可能な特異性の懸念を提起することができます。それにもかかわらず、主要な二次的な効果をもたらす可能性があり、非常に高用量を使用する必要なしに、認知過程に干渉し、文献に広く用いられています。例えば、転写の遮断薬は、遺伝子を必要とするメモリの位相を識別するために、この技術を用いて投与されています表現。このような分子の胸部注入は、他のターゲットにその潜在的な毒性作用は、限らよく選択された濃度を提供...

この原稿は、自由飛行ミツバチのための単純な非侵襲的方法、ならびに拘束ミツバチの正確な局所治療を可能にする、より侵襲性の変異体を含む、ミツバチへの薬理学的薬剤を投与するためのいくつかのプロトコルについて説明します。

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

これらの手順の全体的な目的は、ミツバチやそれに類する昆虫の中枢神経系へ、薬理学的薬剤を確実かつ堅牢に投与することです。これらの手法は、社会性行動の神経メカニズムの解明など、社会生物学、神経行動学、および養蜂学の分野における重要な疑問への回答に役立ちます。これらの技術の主な利点は、遺伝学的ツールが現在限られているミツバチのような非モデル生物において、神経生物学的な研究を可能にする点にあります。手順の実演を行うのは、マッコリー大学神経行動学研究室の大学院生であるJenny Plathです。薬剤は経口投与または注射によって投与できます。注射は、胸部、単眼、または単眼路に行うことができます。単眼への注入は薬剤を頭部全体に届け、単眼路への注入は脳の特定領域を標的とします。すべての注入において、両刃カミソリの角を折り、ブレードホルダーを用いてマイクロスカルペルを作成します。ブレードの破片をブレードホルダーに取り付け、先端が鋭利な良好な刃にします。胸部注射を行うには、ミツバチの胸部にある後翅基部（posterior wing process）の隣、小楯板（scutellum）の直上に2 mmの穴を開けます。飛翔筋を損傷する可能性があるため、深く切りすぎないようにし、また翅の関節を避けるように注意してください。理想的には、後で角質層のフラップを折り返して傷口を閉じることができるよう、3辺のみを切開してください。次に、薬物を胸部に注入します。その後、クチクルのフラップを穴の上に押し戻すと、10時間後に再付着して密閉されます。脳にアクセスするには、拘束したミツバチの頭部を固定します。この際、触覚の嗅覚受容体や、ミツバチの行動に重要となる可能性のあるその他の細胞を損傷しないよう、頸部の隙間を手で温めたデンタルワックスで充填してください。触角は歯科用ワックスで固定することも可能です。次に、マイクロスカルペルの先端をレンズの下に差し込み、頭殻からレンズをそっと切り離すようにして、正中単眼のレンズを慎重に除去します。薬剤を頭殻全体に浸透させるため、単眼の穴に薬剤を注意深くピペットで滴下し、吸収されるまで待ちます。あるいは、単眼路を通じて脳の亜領域を標的とすることも可能です。例えば、単眼に隣接する脳構造を標的とするには、50 µmの深さに250 nLの薬剤を注入します。その後、デンタルワックスを取り除き、実験手順を続行する前に蜂をしばらく休ませます。注入用針を準備するには、1 mmのガラスチューブを延伸させ、長さ約0.5 cmの先端を作成します。次に、実体顕微鏡下でチップの先端を砕き、外径約10から15 µmの開口部を作成します。これはレチクルのスケールを用いて測定できます。次に、注入用針に薬物溶液を充填します。次に、注入システムにおいて、充填済みの注入針をマイクロマニピュレーターに取り付けます。注入システムをミネラルオイル中でテストし、標的とする脳構造の大きさに応じて、0.5から2ナノリットルのボルス量を注入するように校正します。目盛計（グラティキュール）を用いて液滴の直径を測定し、その体積を算出します。拘束したミツバチの頭部を固定するには、前述と同様に軟らかい歯科用ワックスを使用します。次に、マイクロスカルペルを用いて、頭部カプセルの前方部分に3回の切開を行い、開口部を作ります。切開部位は、正中単眼の直下、右または左目の縁、そして触角柄節の上方です。歯科用ワックスを用いて、切り開いたフラップを固定します。次に、微細ピンセットを用いて腺と気管を慎重に脇に寄せ、目的の脳構造の上方にある神経外膜に小さな切開を加えます。次に、ガラスピペットの先端を目的の脳領域に挿入します。この際、理想的には脳表面に対して垂直に、目的の構造に到達する必要な深さまで挿入してください。その後、薬物をボルス注入します。対になった脳領域を標的とする場合は、両半球に影響を与えるために、各半球に1回ずつ注入を行います。蛍光染料をボルスと一緒に注入した場合、蛍光光を用いて脳の浅い領域を観察できます。その他の領域については、後で共焦点顕微鏡を用いて確認することが可能です。注入後、クチクルのフラップを元に戻し、マイクロはんだごてに取り付けた細いワイヤーを用いて、直径約1 mmのエイコサン結晶をクチクルの上に溶かして切開部を封印します。これにより、死亡率を大幅に下げることができます。加熱ニクロムフィラメントから揮発させる方法で薬剤を投与する場合は、純エタノールに溶解させて準備してください。50 mmチューブの蓋に慎重に穴を開け、2本の電線をその穴に通します。フィラメントを作成するには、ニクロム線を釘にきつく巻き付け、ニクロム線を2本の電線に接続した後、釘を抜き出します。その後、電線を固定し、穴をシリコンで封止します。次に、電線を電源に接続します。そして、熱電対を用いてフィラメントの温度を測定します。装置を校正するために、2 µLの薬物溶液をフィラメント上に慎重にピペッティングし、室温でエタノールを完全に蒸発させます。電力を印加して10秒以内に薬剤ボラスが揮発するように、現在の電圧を調整します。薬剤が熱分解によって破壊されないようにしてください。注意深く観察すれば、通常、乾燥したフィラメント上に沈殿物が確認できます。ミツバチに薬剤を投与するには、自由飛行の状態または固定した状態のミツバチをチューブに入れ、ワイヤーを出した状態で慎重に蓋を取り付けます。次に、電源を10秒間入れ、揮発した化合物がミツバチに完全に吸収されるまでさらに50秒間待機してから、ミツバチを取り出します。胸部注入後には、脳内プロセスへの特異的な影響を容易に得ることができます。例えば、この手法を用いて転写阻害剤を投与し、遺伝子発現を必要とする記憶の段階を特定しました。その結果、記憶タスクに対して選択的かつ時間依存的な影響が得られました。頭部血腔への分子の拡散により、単眼への注入によって用量依存的な迅速な効果が得られます。特定の投与濃度において、拡散的に濃度を高めたアラトスタチンは、嗅覚学習試験におけるパフォーマンスを低下させました。特定の脳領域の空間的および時間的特性を検証するため、拘束したミツバキを嗅覚PER条件付けパラダイムで訓練し、その後、キノコ体杯または垂直葉にプロカインを注入しました。その後、想起試験を行ったところ、両側性に注入したミツバキにおいてのみパフォーマンスが低下しました。複数の給餌器が設置されたアリーナにおいて、1 Mのショ糖を含む給餌器から舞い降りようとしたミツバチを慎重に捕獲しました。捕獲したミツバチに100 µgの揮発させたコカイン遊離塩基を投与したところ、0.5 Mの給餌器での採食行動は増加しましたが、2 Mの給餌器では増加しませんでした。このビデオを視聴することで、自由飛行中または拘束下のミツバチに対し、注入または揮発によって薬物を投与する方法を十分に理解できるはずです。これらの手法を習得すれば、数時間で多数のミツバチに対して容易に実施することができます。この手順に続いて、吻伸展条件付けなどの他の方法を行うことで、学習と記憶の神経生物学に関するさらなる疑問を明らかにすることが可能です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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学ぶ ミツバチの神経薬理学的操作方法。拘束および自由飛行状態のApis melliferaに薬剤を経口投与または胸部・単眼・単眼道への局所注射により投与し、社会行動の神経機構や学習記憶の神経生物学を研究する手法を解説します。

拘束と自由飛行ミツバチの神経薬理学的操作、

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