Name: 遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 学ぶマウスヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入法。一次細胞の分離と遺伝子導入により、T細胞分化におけるマイクロRNAの機能と免疫応答の制御メカニズムを解明する効率的なアプローチです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、バイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会（BBSRC）の助成金（BB/H018573/1）およびBDバイオサイエンスの助成金によって支援されました。

<ol><li>Baumjohann, D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+regulation+of+T+helper+cell+differentiation+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).</li>
<li>Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+T-helper-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of T-helper-cell differentiation.</a> Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).</li>
<li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+immunity%3A+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342 (6155), 1242454(2013).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., Van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Expression+in+Embryonic+Stem+Cells+and+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+and+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral Expression in Embryonic Stem Cells and Hematopoietic Stem Cells.</a> Mol and Cell Biol. 20 (20), 7419-7426 (2000).</li>
<li>Miller, A. D., Rosman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+retroviral+vectors+for+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Improved retroviral vectors for gene transfer and expression.</a> BioTechniques. 7 (9), 980-990 (1989).</li>
<li>Grez, M., Akgün, E., Hilberg, F., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+virus%2C+a+recombinant+murine+retrovirus+with+expression+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell virus, a recombinant murine retrovirus with expression in embryonic stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 87 (23), 9202-9206 (1990).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
<li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs%3A+are+the+answers+in+sight%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight?</a> Nat Rev Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li>
<li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nat Rev Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li>
<li>Bernstein, E., Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+is+essential+for+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dicer is essential for mouse development.</a> Nat Genetics. 35 (3), 215-217 (2003).</li>
<li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Dicer+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A role for Dicer in immune regulation.</a> J Exp Med. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li>
<li>Chong, M. M. W., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y., Rundensky, A. Y., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNAseIII+enzyme+Drosha+is+critical+in+T+cells+for+preventing+lethal+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal inflammatory disease.</a> J Exp Med. 205 (9), 2005-2017 (2008).</li>
<li>Liston, A., Lu, L. F., O'Carroll, D., Tarakhovsky, A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer-dependent+microRNA+pathway+safeguards+regulatory+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dicer-dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function.</a> J Exp Med. 205 (9), 1993-2004 (2008).</li>
<li>Zhou, X., Jeker, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+miRNA+disruption+in+T+reg+cells+leads+to+uncontrolled+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity.</a> J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-15b%2F16+Enhances+the+Induction+of+Regulatory+T+Cells+by+Regulating+the+Expression+of+Rictor+and+mTOR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-15b/16 Enhances the Induction of Regulatory T Cells by Regulating the Expression of Rictor and mTOR.</a> J Immunol. 195 (12), 5667-5677 (2015).</li>
<li>Sauer, S., Bruno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+signaling+controls+Foxp3+expression+via+PI3K%2C+Akt%2C+and+mTOR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 105 (22), 7797-7802 (2008).</li>
<li>Yagi, J., Arimura, Y., Takatori, H., Nakajima, H., Iwamoto, I., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+influences+Th+cell+differentiation+by+controlling+the+capacity+for+IL-2-induced+IL-4+production+by+naive+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic background influences Th cell differentiation by controlling the capacity for IL-2-induced IL-4 production by naive CD4+ T cells.</a> Int Immunol. 18 (12), 1681-1690 (2006).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+regulate+T-cell+production+of+interleukin-9+and+identify+hypoxia-inducible+factor-2a+as+an+important+regulator+of+T+helper+9+and+regulatory+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation.</a> Immunology. 149, 74-86 (2016).</li>
</ol>

著者らは、この作品の出版に相反する利害関係はありません。

その開発と機能は、多くの場合、重要な調節因子の発現レベルによって決定される遺伝子のレトロウイルス媒介過剰発現は、ヘルパーT細胞における機能を解析するための強力な方法です。大幅に内因性遺伝子のもの上記の発現レベルは、多くのアーチファクトを生じることがあるので、しかし、結果の慎重な解釈が必要です。従って、この技術は、機能の妥当性を確認するために他のものと組み合わされるべきです。例えば、過剰発現が可能な場合のsiRNAまたは遺伝子ノックアウトを使用して発現低下によって補完されるべきです。 miRNAにより、我々は、miRNA 15のための競合的阻害剤として作用した部位を標的人工のmiRNAを過剰発現したウイルスを使用することにより、ブロッキングのものと過剰発現実験を補完します。レトロウイルス形質導入された細胞はまた、RNAおよびタンパク質の分析を伴う生化学アッセイにおいて利用することができます。しかし、これらの実験の主な制限は、形質導入解像度の効率であります形質導入および非形質導入細胞の混合集団でulting。したがって、これらのアッセイは、最も可能性の高いGFP +集団のソートが必要になります。最後に、 インビトロ分化アッセイは、 インビボ実験と結合されるべきであり、これを達成することができる一つの方法は、養子マウスに形質導入したT細胞を転送し、それらの分化し、免疫応答に対する効果以下のことです。 このシステムの主要な制限の一つは、レトロウイルスキャプシドにパッケージングすることができるRNAゲノムの大きさです。我々の経験では、良好なウイルス産生を与えるMIGレトロウイルスシステムの最大挿入サイズは3〜3.5キロバイトです。それらが悪いウイルス力価を与えるしたがって、より大きな遺伝子は、このシステムを用いて分析することができません。このシステムは、遺伝子研究の広範囲に有用であるのでしかし、ほとんどの遺伝子は、このサイズよりも小さいです。 これらprotoco内のレトロウイルス形質導入すると、いくつかの選択肢LSが使用されています。多くの研究者は、安定したレトロウイルス遺伝子（例16を参照）を発現するパッケージング細胞株を利用しています。しかし、我々は、PCL-エコヘルパーウイルスベクターの同時トランスフェクションを用いて標準HEK 293T細胞を使用して最高の力価を得ました。ナイーブヘルパーT細胞の単離は、磁気ビーズと細胞分離カラムのプロトコルではなく、細胞選別によって達成することができ、これは、細胞ソーターへのアクセスを必要とし、ソート時間のコストは、典型的には、ビーズ試薬よりも高いです。最後に、異なるサブセットにヘルパーT細胞を区別するために使用される活性化条件のバリエーションが存在します。例えば、長すぎるために細胞のTCR刺激は、Tregの誘導条件への曝露の前に誘導16を阻害することができます。レトロウイルス発現細胞の刺激により誘導される細胞分裂を必要とするので、これは問題となり得ます。それにもかかわらず、我々はO / N ACTIVで、このプロトコルを使用して効率的なTregの誘導を発見しましたレトロウイルス形質導入に先立ってエーション。 これらのプロトコルの中で、成功したアプリケーションは、いくつかの要因が必要です。高力価のレトロウイルス調製物は、非常に高い品質のDNAと正確に準備された2×HBS HEK 293T細胞の効率的なトランスフェクションを必要とする重要です。トランスフェクトされたDNAの良好な発現は、細胞があまりに疎または密である場合、細胞が活発に増殖している、これが阻害されることを必要とするので、また、HEK 293T細胞の細胞密度はトランスフェクションの時点で約50％であることが必要です。トランスフェクション時の最適な密度の細胞を、ウイルス回収ステップの間にいくつかの点で合流に達する必要がありますが、彼らはすべての方法最後の収集まで、高力価のウイルスストックを生産継続します。ヘルパーT細胞の効率的な分化は、良好なセルの品質がので、単離された細胞は、 図1に示した純度であることを確認が必要である。同様に、細胞の品質は、マウスFRに依存しますそれらは単離されたOM。これらの研究のために、我々は6〜8週齢のC57BL / 6マウスを使用しています。古いマウスは少ないナイーブ細胞を持つことができ、他の株は、それらの分化に異なる場合があります。上述したように、例えば、BALB / cマウスは、C57BL / 6マウス17よりTh2応答をより受けやすいように、C57BL / 6 T細胞はTh2応答を誘導することは困難です。また、分化条件のいずれかが研究室に研究室から若干異なる場合があり、そして様々な偏光条件でのサイトカイン濃度を滴定する必要があるかもしれないので、遺伝子の過剰発現の効果は、サブ最適な条件で明らかになるであろう。最終的に、細胞増殖の過剰発現遺伝子の作用や偏光状態は、目的の遺伝子のように測定することの効果は、偏光試薬のタイミングおよび濃度を最適化する必要ができる形質導入効率に影響を与えることができます。すべてのこれらの要因を最適化すると、このシステムでの有益な結果をもたらすはずです。

免疫反応は、感染を排除するために高度に制御されなければなりませんが、自己免疫につながる自己組織への攻撃を防ぐ必要があります。ヘルパーT細胞は免疫応答の調節に重要な役割を果たしており、その発生と機能を理解するために多大な努力が払われてきました(最近のいくつかのレビュー1-3で示されています)。しかし、多くの疑問が残されており、ヘルパーT細胞の発生と機能を制御するメカニズムを研究するために多くのアプローチが利用されてきました。これらは、in vitro細胞培養システムの使用から動物全体まで多岐にわたります。細胞培養システム、特に細胞株を使用する細胞培養システムには、使いやすさと、高度な生化学分析を行うための大量の材料を生成する能力という利点があります。しかし、免疫応答で発生する実際の状態を再現する能力が限られていることに苦しんでいます。対照的に、全動物実験は関連性という利点がありますが、操作の難しさや正確な制御を行う能力に加えて、多額のコストと倫理的影響に苦しむ可能性があります。それにもかかわらず、今日のヘルパーT細胞研究の大部分は、細胞株が動物全体で発生する正確なステップを複製できないため、初代T細胞を含む全動物実験の使用を依然として必要としています。したがって、非常に情報量の多い費用対効果の高いアプローチを利用することが不可欠です。
遺伝学はヘルパーT細胞の発生と機能を研究するための強力なツールの一つですが、遺伝子ノックアウトや導入遺伝子を含む従来の方法は時間と費用がかかるため、小さな研究室では手の届かないことが多いです。しかし、レトロウイルス形質導入は、特定の遺伝子産物のメカニズムを研究するための強力で迅速、かつ費用対効果の高い遺伝的アプローチを提供します。そのため、ヘルパーT細胞の発生と機能を研究する論文で一般的に使用されています。
ヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入の手順を最適化しました。pMIG(Murine Stem Cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein)レトロウイルス発現ベクターを利用しており、レトロウイルスの長末端反復(LTR)4から目的の遺伝子をクローニングして発現させることができます。さらに、挿入された目的遺伝子の下流には、内部リボソームエントリー配列(IRES)とそれに続く緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子があるため、形質導入された細胞はGFPの発現を容易に追跡できます。このベクターはもともとマウス幹細胞ウイルス(MSCV)ベクターに由来し、LTRのリプレッサー結合部位に変異が含まれており、サイレンシングに耐性があるため、ヘルパーT細胞5,6を含む多くの細胞タイプで高発現しています。高力価レトロウイルスの作製には、ヒト胚性腎臓(HEK)293T細胞の簡単な一過性トランスフェクションプロトコルと、MIGベクターとレトロウイルスGAG、Pol、およびEnv遺伝子を発現するヘルパーウイルスベクターが必要です。このために、pCL-Ecoヘルパーウイルスベクター7は、高力価の複製、無能なレトロウイルスの産生にうまく機能します。
ここでは、レトロウイルス産生と初代マウスT細胞の形質導入のためのこれらのプロトコルが説明されています。また、このアプローチを使用して、ヘルパーT細胞の分化を制御する遺伝子発現のmiRNA制御を研究する結果の一部に加えて、miRNAは長さが約22ヌクレオチドの小さなRNAで、メッセンジャーRNAをコードするタンパク質の相同配列を標的とし、翻訳と誘導を抑制することにより、転写後的に遺伝子発現を調節しますメッセージの不安定性 8,9.miRNAは、発生遺伝子の制御に重要な役割を果たします。miRNAを産生できない胚は非常に早い段階で死滅するため、発生の最も早い段階で不可欠です10。さらに、miRNAは、多くの組織の後の発達において重要です。それらは、発生プログラム1に必要な遺伝子の発現を微調整することで機能すると考えられています。ヘルパーT細胞では、miRNAは複数の役割を果たし、制御性T細胞(Treg)の発達に必要です11-14。私たちは、Treg分化のmiRNA制御のメカニズムを解剖する手段としてレトロウイルス形質導入を使用しました15。このような研究を通じて、レトロウイルスを介した過剰発現によって重要な個々のmiRNAが決定されました。その後、これらのmiRNAによって制御される関連遺伝子を同定し、ヘルパーT細胞の分化におけるmiRNAによって制御される分子経路を理解しました。

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン溶液</td><td>Σ</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Σ</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td></td><td>Σ M3148</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Σ</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MIG ベクトル</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 9094</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Ecoベクター</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 12371</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic beads mouse CD4 cell kit&nbsp;</td><td>Invitrogen (Dynabeads)</td><td>11415D</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジンビーズ&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-102</td><td></td></tr><tr><td>MS細胞分離カラム</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>LS細胞分離カラム</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD25 Biotenylated MAb&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>85059</td><td>クローン7D4</td></tr><tr><td>CD62Lバイオテニル化MAb&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553149</td><td>クローン MEL-14</td></tr><tr><td>ポリブレン (臭化ヘキサジメトリン)</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>clone 145-2C11&nbsp;</td></tr><tr><td>抗CD28</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>クローン37.51&nbsp;</td></tr><tr><td>抗IL-4</td><td>BD Biosciences</td><td>559062</td><td>クローン 11B11</td></tr><tr><td>抗IFN-γ</td><td>BD Biosciences</td><td>559065</td><td>クローン XMG1.2</td></tr><tr><td>抗IL-2</td><td>BD Biosciences</td><td>554425</td><td>cloneJES6-5H4</td></tr><tr><td>組換えIL-12 p70</td><td>eBiosciences</td><td>14-8121</td><td></td></tr><tr><td>組換えIL-4</td><td>BD Biosciences</td><td>550067</td><td></td></tr><tr><td>組換えTGF-β</td><td>eBiosciences</td><td>14-8342-62</td><td></td></tr><tr><td>組換えIL-6</td><td>eBiosciences</td><td>14-8061</td><td></td></tr><tr><td>組換えIL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>PMA&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>イオノマイシン</td><td>シグマ</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>ブレフェルジン A</td><td>eBiosciences</td><td>00-4506</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>16005</td><td>パラホルムアルデヒドは有毒ですので、取り扱いには十分な注意を払ってください&nbsp;</td></tr><tr><td>Foxp3染色バッファーセット</td><td>eBiosciences</td><td>00-5523</td><td></td></tr><tr><td>抗CD4&nbsp;FITC</td><td>eBiosciences</td><td>11-0041</td><td>クローンGK1.5&nbsp;</td></tr><tr><td>抗CD8a perCP-cy5.5</td><td>eBiosciences</td><td>45-0081-80</td>クローン<td>53-6.7&nbsp;</td></tr><tr><td>抗MHCII PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0920</td><td>&nbsp;クローンHIS19</td></tr><tr><td>抗CD25 PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0251-82</td><td>&nbsp;クローンPC61.5&nbsp;</td></tr><tr><td>抗CD62L PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0621-82</td><td>クローンMEL-14&nbsp;</td></tr><tr><td>抗CD44 APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0441</td><td>クローンIM7&nbsp;</td></tr><tr><td>反IFN-γ FITC&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>11-7311-81</td>クローン<td>XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-4 PE</td><td>BD Biosciences 554435</td><td></td><td>クローン11B11</td></tr><tr><td>Anti-IL-9 PEまたはAPC</td><td>eBiosciences/Biolegend</td><td>50-8091-82/514104</td><td>クローンRM9A4</td></tr><tr><td>Anti-IL-17a PE</td><td>BD Biosciences 559502</td><td></td><td>クローンTC11-18H10</td></tr><tr><td>Anti-Foxp3&nbsp;APCまたはPE</td><td>eBiosciences</td><td>17-5773-82/12-5773-80&nbsp;</td><td>クローンFJK-16s</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Σ</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Σ</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2O</td><td></td><td>Σ71643</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース/グルコース</td><td></td><td>ΣG7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、遊離酸</td><td></td><td>ΣH3375</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Σ</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ</td>二ナトリウム <td>D2900000</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>237205</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;CaCl<サブ >2</サブ>&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>C5670</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーt細胞のレトロウイルス形質導入

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T細胞の発生と機能は、特定の病原体を排除しながら自己免疫を防ぐ適切な免疫応答を誘導するために、厳密に制御されなければなりません。ヘルパーT細胞の発生と機能を制御するメカニズムを理解するために、さまざまなモデル生物を含む多くのアプローチが利用されてきました。しかし、マウスモデルを用いた研究は、遺伝的、細胞的、生化学的システムが利用可能であるため、非常に有益であることが証明されています。多くの研究室で使用されているマウスの遺伝的アプローチの1つに、一次ヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入があります。これは、比較的容易であるため、強力なアプローチであり、分子生物学と免疫学の基本的なスキルを持つほぼすべての研究室にアクセスできます。したがって、野生型または変異型の複数の遺伝子のヘルパーT細胞の機能について容易に試験し、その重要性と作用機序を理解することができます。このアプローチを最適化し、ここでは、高力価レトロウイルスの産生、初代マウスヘルパーT細胞の単離、レトロウイルスによるそれらの形質導入、および異なるヘルパーサブセットへの分化のためのプロトコルについて説明します。最後に、このアプローチの使用については、ヘルパーT細胞の発生と機能を制御する経路を制御するためにマイクロRNA(miRNA)が利用するメカニズムの解明で説明しています。

この実験系の成功は、T細胞および高力価のレトロウイルス調製物の純度の高い集団を必要とします。代表的な結果は、成功した実験の例として示されている。 図1ナイーブヘルパーT細胞単離プロトコールの各段階で前後選択集団の典型的な純度を示す。 図2及び図3は、GFPの発現を介して、レトロウイルス産生の分析を示しますトランスフェクトされたHEK 293T細胞において（ 図2）および形質導入T細胞（ 図3）。 HEK 293T細胞のトランスフェクション効率は、異なるレトロウイルス構築物で有意に変化し得るが、これは多くの場合、GFP + T細胞の数で観察レトロウイルス産生のレベルと相関しません。また、GFP + T細胞の数は、偏光状態に依存して変化し得ます。また、メートルGFPのEAN発現レベルと集積ウイルスコピーの数に応じて変化することができ、挿入された遺伝子、転写の組込み部位の効果、およびウイルスの転写に影響する転写後調節機構。 最後に、 図4は、miRNAののmiR-15bは/ 16が過剰発現されたときに我々は、ヘルパーT細胞の分化と観察しているいくつかの典型的な結果を示しています。これらの結果は、そのように真の効果は、ヘルパーT細胞の異なる調製物を使用して複数回の反復実験の統計分析によって実証されている必要があり、個々の実験内で発生することができ変動のいくつかを示しています。これらの実験において、Th2応答は、それらがTh1応答の傾向があるので、ここで使用されるC57BL / 6行目に観察することは困難です。同様に、IL-9染色は、バックグラウンドを上回る検出するのが困難であることができます。したがって、アイソタイプコントロールを行い、正しいGAを確保するために適切な補償を設定することが不可欠ですサイトカイン発現のティン。我々の結果では、我々は、miR-15bは/ 16が部品のRictorおよびmTOR 15の発現を抑制することを通じてシグナル伝達経路のmTORを阻害することにより、iTregの誘導を増強することを発見しました。 miR-15bは/ 16は時々、個々の実験でTh0の、のTh1およびTh17細胞の分化に影響を与えることができるが、複数回の反復実験で調べ有意な影響はありません。対照的に、のmiR-15bは/ 16過剰発現は有意に（18を参照する参照）TH9の分化を抑制しません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> 分離の各段階でのヘルパーT細胞の図1.標準的な純度。示された抗原の結果代表的なフローサイトメトリーは、前方散乱（FSC）および側方散乱光（SSC）プロットに指定された生細胞のゲートから示されています。 （A）前後のCD4陰性選択。 CD4の発現プロファイル、CD8a、およびMHCIIが示されています。これらは、ヘルパーT細胞の濃縮および細胞傷害性T細胞およびMHCクラスIIを発現する細胞の損失を示します。良好な精製は、この段階で〜90％のCD4 + T細胞をもたらすはずです。 （B）CD25選択。左側にはCD4、CD8a、およびMHCIIの発現プロファイルであり、右側にCD4とCD25の発現は、事前と事後選択をプロファイルしています。この時点で&gt; CD25陰性に選択された細胞の95％がCD4 + CD25であるべきです- 。 （C）CD62L選択。 CD4、CD8a、およびMHCII発現プロファイルは、左側に示されています。右側にはCD62LおよびCD44のための発現プロファイルは、ポスト、選択された細胞のCD4とCD62L発現プロファイルと一緒に前後のCD62L選択したセルについて示されています。 CD62L選択した後、実質的に全てのメモリセル（CD44 +）は、10〜15％のエフェクター細胞（CD62L 低）が含まナイーブヘルパーT細胞の高度に濃縮された集団を残して除去されます。すべてのためにFACSプロファイルは、特定のパラメータのための同等の設定とスケールが全体で維持しました。数字は、ゲート集団内の細胞の割合を表します。最初の選択後の細胞の大きさのわずかな減少は、プロトコル中の機械的ストレスにおそらくある。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> レトロウイルストランスフェクションHEK 293T細胞の図2分析。GFPの発現は、ウイルス培養上清を回収した後、非トランスフェクトまたはトランスフェクトし、分析のいずれかであったHEK 293T細胞において示されています。 GFP分析はFSCと最初のパネルでSSCプロット上のゲートからの生細胞で行いました。数値は、ゲート領域内のGFP +細胞の割合を表します。典型的なトンransfection効率は30から90までパーセントの範囲である。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> レトロウイルス形質導入されたヘルパーT細胞の図3.分析。GFPの発現は3日間Th0を、のTh1、Th2を、TH9、Th17細胞およびTregの偏光状態の分化した後、レトロウイルス形質導入ヘルパーT細胞において示されています。分析は、FSC / SSCパネルに示されているライブや活性化細胞にゲートされました。形質導入効率は、構造と偏光状態に応じて10-75％の間で変化することができます。同様に、GFP発現の平均蛍光強度が変化することができる。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 異なる偏光条件でのヘルパーT細胞の分化に対するのmiR-15bは/ 16過剰発現の図4.影響。代表的サイトカインプロファイルは、 図3からの細胞のGFP +集団に示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> 表1： これらのプロトコルで使用されるバッファの <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">Excelスプレッドシートとしてこの表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> ヘルパーT細胞の分極条件</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th0を</td><td>抗IL-4 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td>抗IFN-γ </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td>組換えIL-12 </td><td> 20 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>抗IL-4 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2の</td><td>組換えIL-4 </td><td> 40 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>抗IFN-γ </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> TH9 </td><td>組換えTGF-β </td><td> 2.5 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>組換えIL-4 </td><td> 40 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>抗IFN-γ </td><td> 10μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17細胞</td><td>組換えTGF-β </td><td> 2.5 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>組換えIL-6 </td><td> 50 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>抗IFN-γ </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td>抗IL-4 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td>抗IL-2 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregは</td><td>組換えTGF-β </td><td> 2.5 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>組換えIL-2 </td><td> 5 ngの/ mlの</td></tr></tbody></table> 表2： ヘルパーT細胞サブセットの偏光状態。

多くの実験系は、免疫応答におけるT細胞の発達および機能を調節するメカニズムを理解するために利用されています。ここではレトロウイルス形質導入を用いた遺伝子アプローチは、調節経路を同定することに、経済的、時間効率的な、そして最も重要なのは、非常に有益である、記載されています。

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

このプロトコルの総合的な目的は、マウス一次ヘルパーT細胞を単離し、目的遺伝子のレトロウイルス発現構築物を導入することです。免疫応答におけるT細胞の発達と機能のリグレーションメカニズムを理解するために、多くの実験系が利用されてきました。ここでは、経済的で時間効率が良く、調節経路の特定において非常に有用な、レトロウイルス導入を用いた遺伝学的アプローチについて説明します。私たちはこの手法を用いて、遺伝子発現の重要な調節因子であるmicroRNAの機能を解析してきました。レトロウイルス導入法を用いることで、個々のmicroRNAの機能とヘルパーT細胞の分化について検証することができました。共同研究者のOliver Gardenが初代T細胞の単離を、私がレトロウイルス導入法を実演します。トランスフェクションの24時間前に、コンフルエントになった細胞プレートを10 cmプレートに1:10の比率で分割し、翌日に細胞が約50%コンフルエントになるようにします。トランスフェクションの約1時間前に、細胞から培地を除去し、細胞がプレートから剥がれるのを防ぐため、新鮮なHEK293 T培地を9 mL慎重に加えます。6 mLラウンドボトムチューブまたは15 mLコニカルチューブに、5 µgのレトロウイルスDNA、5 µgのヘルパーウイルスDNAを加え、水を加えて全量を420 µLにします。次に、2.5 M 塩化カルシウムを 80 µL 加えて、最終容量を 500 µL にします。その後、溶液が絶えず混合され、リン酸カルシウムが均一なサイズの結晶として沈殿するように、DNA混合液に 2x HBS 500 µL を穏やかにボルテックスしながらゆっくりと滴下します。続いて、リン酸カルシウムDNA混合液を組織培養フードへ移動させます。プレートを絶えず緩やかに揺らしながら、混合物を細胞にゆっくりと加え、その後、細胞をインキュベーターに戻します。翌日にウイルスを回収するために、培地を取り除き、細胞がプレートから剥がれないように注意しながら、10 millilitersの新鮮なHEK293 T培地を添加します。夕方に、3.5 millilitersの新鮮なHEK293 T培地を添加し、細胞を4 °Cで12時間インキュベートします。約12時間後、培地を回収し、再び3.5 millilitersの新鮮なHEK293 T培地を細胞に添加します。培地の回収を約12時間の間隔でさらに2回繰り返し、合計で約10 millilitersのウイルスストックを回収します。この手順では、脾臓とリンパ節をセルストレーナーに入れ、5 millilitersシリンジプランジャーの先端を用いてすり潰します。その後、R10培地1〜2 mLで洗浄します。次に、細胞を15 mLコニカルチューブに移し、R10培地を加えて液量を14 mLにします。4°Cで600 ×g、5分間、遠心分離を行います。その後、細胞ペレットを乱さないよう、一度のスムーズな動作で上清を捨てます。次に、2 mLの冷えた赤血球溶血バッファーを細胞に加えます。混合し、緩やかに混ぜながら3.5分間氷上に置きます。次に、12 mLのR10培地を加え、直ちに4°Cで600 ×gで5分間遠心分離します。細胞から残留した赤血球溶血バッファーを除去し、リンパ球の死滅を防ぐため、R10培地を用いて洗浄工程をさらに2回繰り返します。このステップでは、コニカルチューブあたり8〜10 × 10⁷個の細胞を分注し、4°Cで600 ×gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱さないよう、一度のスムーズな動作で上清を捨てます。次に、細胞を100 µLの熱不活化FBSで再懸濁します。続いて、100 µLの抗体ミックスを細胞に加え、ローラーを用いて緩やかに混合しながら、4 °Cで30分間インキュベートします。その後、30秒以上ボルテックスして、バイアル内のビーズを再懸濁します。次に、ビーズを15 mLのコニカルチューブに移し、ビーズ1 mLあたり2 mLのR10培地を加えます。チューブをマグネットに1分間置きます。その後、上清を捨て、ビーズを4 mLのR10培地で再懸濁します。抗体インキュベーションの終了後、チューブあたり10 mLのR10培地を加え、4 °Cで600 ×gにて5分間遠心分離して細胞を洗浄します。細胞ペレットを乱さないよう、一動作で速やかに上清を捨て、その後、細胞を1 mLのR10培地で再懸濁します。続いて、洗浄したビーズ 2 milliliters を抗体処理した細胞のチューブに加え、ローラーで緩やかに混合しながら 4 °C で 30 分間インキュベートします。次に、ピペッティングで 5 回緩やかに混ぜて細胞とビーズの混合物を再懸濁させ、チューブをビーズマグネットに 2 分間置きます。陰性選択された細胞を含む上清を新しいチューブに移し、陰性選択をもう一度繰り返します。本手順では、CD4陽性T細胞を600 ×gで5分間、4°Cで遠心分離し、10⁸個の細胞あたり150～200 µLのR10培地で再懸濁します。次に、2 µLのビオチン化CD25モノクローナル抗体ストックを細胞に加え、ローラーを用いて緩やかに混合しながら、4°Cで30分間インキュベートします。その後、10 mLの細胞分離カラムバッファーを加えて細胞を洗浄し、600 ×gで5分間、4°Cで遠心分離します。次に、上澄みを可能な限り除いた後、細胞10⁷個あたり約90 µLの最終容量になるように細胞を再懸濁します。続いて、細胞10⁷個あたり20 µLのストレプトアビジンビーズを加え、軽く弾いて混ぜ合わせます。その後、4 °Cで15分間インキュベートします。細胞をインキュベートしている間に、MSカラムを準備します。インキュベート終了後、細胞分離カラムバッファーを10 milliliters加え、4 °Cで600 ×gにて5分間遠心分離して細胞を洗浄します。10⁸個の細胞あたり500 µLの細胞分離カラムバッファーで細胞を再懸濁します。その後、500 µLの細胞懸濁液をカラムに適用し、通り抜け液を回収します。それをもう一度カラムに通し、再度通り抜け液を回収します。次に、500 µLの細胞分離カラムバッファーでカラムを3回洗浄し、各通り抜け液を回収したCD25陰性細胞に加えます。前述の洗浄、ストレプトアビジンビーズの結合、および細胞分離カラムの準備を行いますが、今回はLSカラムを使用してください。この際は、フロースルーを廃棄し、付属のプランジャーを用いてカラムから細胞をフラッシュしてください。ナイーブT細胞を単離している間に、24ウェル組織培養プレートをDPBSで希釈したanti CD3およびanti CD28抗体でコートし、37 °Cで2時間インキュベートします。細胞を培養する直前に、未結合の抗体を除去するため、1ウェルあたり250 µLのDPBSでプレートを洗浄します。次に、DPBSを除去し、R10培地で調製したナイーブCD4陽性T細胞を1 mL加え、一晩静置します。翌日、細胞を30 °Cで900 ×g、10分間遠心分離します。その後、培地を回収し、ウイルス製造プロトコルに従って調製したウイルス培養上清を1 mL添加します。続いて、ウイルスの取り込みを促進するため、8 mg/mL polybreneを1 µL、1 M hepesを10 µL添加し、細胞を30 °Cで900 ×g、90分間遠心分離します。細胞を分化させるため、ウイルス培養上清を注意深く除去し、IL2およびその他のT細胞増殖因子を含む、 previously回収した培地を1 mL添加します。次に、付随する原稿の表2に示された試薬を添加し、細胞を3〜4日間培養して、細胞を特定のサブセットへと分化させます。この図は、ナイーブヘルパーT細胞単離プロトコルの各段階における、選択前後における集団の典型的な純度を示しています。CD4、CD8A、MHC II、CD25、CD62LおよびCD44の発現プロファイルは、MHCクラスII陽性細胞に加え、細胞傷害性T細胞、調節性T細胞、およびメモリーT細胞が消失していることを示しています。これにより、CD4陽性T細胞が95%以上となり、そのうち約85%から90%がナイーブT細胞、残りの10%から15%がエフェクター細胞である集団が得られます。この図では、未導入またはトランスフェクションを行ったHEC293 T細胞におけるGFP発現を示しており、ウイルス培養上清の回収後に解析しています。GFP解析は、FSEおよびSSEプロットのゲート内の生細胞に対して行われました。一般的なトランスフェクション効率は30%から90%の範囲です。ここでは、Th0、Th1、Th2、Th9、Th17、およびT regの分極条件下で3日間分化した後、レトロウイルスによって導入されたヘルパーT細胞におけるGFP発現を示しています。導入効率は、コンストラクトと分極条件に応じて10%から75%まで変動します。以下は、異なる分極条件下でのヘルパーT細胞分化における代表的なサイトカインプロファイルです。これらの手法を習得すれば、遺伝子機能やヘルパーT細胞の発達および機能の解析において強力な手段となります。有益な結果を得るには、細胞と試薬の品質が重要であることを忘れないでください。したがって、導入プロトコル、およびヘルパーT細胞の単離と分化を最適化することが不可欠です。

retroviral-transduction-helper-t-cells-as-genetic-approach-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々はレトロウイルス導入を用いて抗原特異的マウスT細胞を生成するためにプロトコルを提示...

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

の世代のための迅速、簡単かつコスト効率の良いプロトコルドナー由来のCMV、前売またはEBV感染症を発症する危険性がある同種造血幹細胞移植（HSCT）の受信者に注入するためmultivirus特異的CTL（rctlを）。この製造プロセスはGMPに準拠しており、専門センターを超えてT細胞免疫療法の広範な実施を確保すべきである。...

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

ナイーブCD4コクサッキーアデノウイルス受容体のトランスジェニック発現とT細胞へのアデノウイルス遺伝子導入は、制御性T細胞分化の分子解析を可能に...

ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞

このプロトコルは、HIV感染に対する幹細胞ベースの操作免疫を持つヒト化骨髄/肝臓/胸腺マウスモデルを構築する方法を説明しています。...

ヒト化マウスモデルにおけるHIV感染に対する幹細胞ベースの設計さイミュニティ

私たちは、単一のT細胞受容体(TCR)レトロウイルスベースのin vivo発現システムのための迅速で柔軟なプロトコールを提示します。 レトロウイルスベクターは、骨髄前駆細胞を形質導入するために使用され、TCRトランスジェニックマウスの代替として、in...

骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、

ここでは、ヒト細胞におけるモロニーマウス白血病ウイルスベースのレトロウイルスベクターの組み込み部位のゲノムワイドマッピングのためのプロトコールについて記載する。...

レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング

我々は、細胞有効性の注入研究のために十分な数の目的の遺伝子の優れた共発現を有する細胞を得るアカゲザル末梢血単核細胞の導入及び拡張のための9日間のプロトコルを概説する。...

中央記憶表現型の維持による9日間の主要T細胞の導入と拡張

このプロトコルでは、マウス胸腺からのダブルネガティブ胸腺細胞の単離とそれに続くレトロウイルス形質導入、およびさらなる機能分析のためのデルタ様4発現骨髄間質細胞株共培養システム(OP9-DL4)での共培養について説明します。...

T細胞白血病における癌遺伝子研究のためのデルタ様4発現間質細胞上でのマウス胸腺細胞の共培養と形質導入

現在の研究では、ウイルス特異的TFH...

急性LCMV感染マウスにおけるウイルス特異的濾胞性ヘルパーCD4+ T細胞の早期分化へのアクセス

Cas9トランスジェニックマウスの初代T細胞へのガイドRNAのレトロウイルス形質導入のプロトコールを提示し、Th17分化の研究における遺伝子編集の効率的な代替手段を提供します。...

in vitroでのTh17分化の研究のためのレトロウイルスCRISPR/Cas9媒介遺伝子ターゲティング

私たちは、トランスフォーミング受容体のレトロウイルス形質導入と、受容体媒介性臓器および微小環境特異的リンパ球のポジショニングを研究するための競合的ホーミングのための改善されたプロトコルを提示します。この方法は、免疫細胞の輸送メカニズムに関する貴重な洞察を提供し、将来の基礎研究や治療研究への応用が期待されています。...

多様な組織微小環境におけるGPCR媒介T細胞局在の研究のための効率的なレトロウイルス形質導入と競合的ホーミング

学ぶマウスヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入法。一次細胞の分離と遺伝子導入により、T細胞分化におけるマイクロRNAの機能と免疫応答の制御メカニズムを解明する効率的なアプローチです。

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

さらに動画を探す