モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

このDNAアセンブリプロトコルの全体的な目標は、DNAデバイスの再現性があり、スケーラブルで、自動化されたハイスループットな生産を可能にすることです。この作業は、高レベルのDNAデバイス設計に基づいてリキッドハンドラーのピペッティング指示を生成できる、堅牢でユーザーフレンドリーなソフトウェアワークフローのニーズに対応します。この手法の主な利点は、自動反応調製が再現性と拡張性に優れており、手作業による調製と比較して、必要な作業時間がわずか4%であることです。

この手法は、自動化ステップの習得が難しく、実験方法と計算方法の組み合わせであるため、視覚的なデモンストレーションが重要です。この研究のために、スクリプト生成を自動化できるソフトウェアツールを開発しました。任意のWebブラウザを使用して、MoCloAssemblyに移動します。

comおよびCombinatorial DNAデバイスの設計に含まれるすべてのDNAパーツのGenBankファイルをアップロードします。すべてのファイルがアップロードされたら、目的のDNAパーツを選択します。パーツのコレクションと個々のパーツを選択できます。

パーツを空白のキャンバスにドラッグします。各パーツの 5 つのプライム オーバーハングと 3 つのプライム オーバーハングが一致するように DNA パーツを順序付けます。DNAパーツの意図した最終順序でパーツタイプを配置します。

ページの右下にある[組み立て]をクリックします。ソフトウェアツールは、BSA1酵素による分解時に各部品に隣接する4つの塩基対オーバーハングに基づいてのみ、有効なビルド可能なアセンブリを生成することに注意してください。[プラン] タブに移動し、ツールによって生成されたファイルをダウンロードします。

これらのファイルには、科学者がDNAサンプルと反応に必要な試薬を準備するための人間が読めるプレートマップ、リキッドハンドラーの選択リスト、および組み立てるすべてのDNAデバイスの完全に注釈されたGenBankファイルが含まれます。モジュラーDNAアセンブリを開始する前に、テキストプロトコルに記載されているようにプラスミドDNAを調製してください。この手順の最も重要なステップは、ツールによって生成されたプレートマップを使用して、セットアッププレートと試薬プレートを正しく装着することです。

アセンブリツールで生成されたPDFファイルのプレートマップに従って、希釈した各DNA部分の指示された容量を、フルスカートの96ウェルPCRプレート上の適切なウェルに入れます。必要になるまで、このセットアッププレートを氷の上に置きます。氷上で、以下の成分を含むリアクションマスターミックスを調製します。

反応20マイクロリットルごとに、0X T4 DNAリガーゼバッファー2マイクロリットル、T4 DNAリガーゼ0.5マイクロリットル、BSA1酵素1マイクロリットルを添加します。生成されたPDFの試薬プレートのプレートマップに従って、酵素マスターミックスを新しいフルスカートの96ウェルPCRプレートの適切なウェルに分配します。この試薬プレートは氷上または96ウェルのコールドブロックの上に置いてください。

この手順を開始するには、セットアッププレートと試薬プレートをリキッドハンドラーのデッキに置きます。空のフルスカートの96ウェルPCRプレートを含めます。空のプレートは、反応が組み立てられる出力プレートになります。

準備した各サンプルと試薬プレートのインスタンスを作成し、MoCloAssembly. comによって生成されたプレートマップに表示されるとおりに正確に名前を付けて、リザーバーとラベル付けされたきれいな脱イオン水のトラフを含む、リキッドハンドラー制御ソフトウェアを準備します。制御ソフトウェアのWorklistコマンドを使用して、ソフトウェアツールによって生成されたGWLファイルをロードし、その後、最初のコマンドでロードされたGWLファイルを実行する別のWorklistコマンドをロードします。

コントローラソフトウェアのRunコマンドを使用してスクリプトを実行します。ロボット リキッド ハンドラーがスクリプトの実行を完了したら、リキッド ハンドラー デッキからすべてのプレートを取り外します。残りのDNAは、セットアッププレートをアルミ製シーリングフィルムで密封し、マイナス20°Cで保存することで保存します。

出力プレートを粘着フィルムでシールし、サーモサイクラーまたはヒートブロックに入れて、次のサイクルパラメータで実行します。摂氏37度で2時間、摂氏50度で5分間、摂氏80度で10分間、摂氏4度で保持します。無菌性を維持するために、この手順は裸火の近くで実行する必要があります。

必要な数の有能な大腸菌細胞アリコートを氷上で解凍します。細胞が解凍されている間に、適切な抗生物質を含むLB寒天プレートを準備します。IPTGとX-GALを含むマスターミックスを作成します。

マスターミックス100マイクロリットルを各プレートの表面にピペットで固定し、ガラスビーズを使用してプレートを均一にコーティングします。プレートを摂氏37度で少なくとも15分間インキュベートしてから、バクテリアをプレーティングします。各反応につき10マイクロリットルのコンピテントセルを氷上の新しい96ウェルPCRプレートに分注して、形質転換プレートを調製します。

出力プレートから形質転換プレート内の対応するウェルに各反応の1〜3マイクロリットルを加え、氷上で5分間インキュベートします。トランスフォームプレートを接着フィルムで密封し、サーモサイクラーで摂氏42度のヒートショックを30秒間行います。すぐにプレートを氷の上に2分間置きます。

形質転換プレートの同じウェルに、150マイクロリットルのSOC培地を加え、接着シールで密封し、900RPMで振とうしながら摂氏37度で1時間インキュベートします。1時間後、トランスフォームプレートの各ウェルの全内容物を、前に調製したLB寒天プレートにプレートします。ガラスビーズを使用して、プレートの表面を均一にコーティングします。

プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。形質転換の翌日に、ウェルあたり1.5ミリリットルのLBブロスを含む1つまたは複数の96ウェルディープウェル培養ブロックを準備します。滅菌爪楊枝を使用し、直火の近くで作業し、形質転換反応の各LB寒天プレートから単一の白いコロニーを選び、ディープウェル培養ブロックを接種します。

培養ブロックをガス透過性シールでシールし、摂氏37度でインキュベートし、900 RPMで一晩振とうします。その後、市販のキットを使用して細菌培養物から血漿DNAを単離し、クローンを検証するためのサンガーシーケンシングに提出します。反応アセンブリ時間を3つのモダリティすべてで比較しました。

手作業による組み立てには2時間10分かかり、そのすべてが手作業でした。リキッドハンドラーは、ピペッティングコマンドの実行に同様の時間がかかりましたが、その時間のうちハンズオンだったのはわずか5分でした。音響ディスペンサーは、液体移送の実行にかかる時間を大幅に短縮し、ハンズオン時間を最小限に抑えました。

このグラフは、各組み立て方法の反応あたりのコストを示しています。このコストには、使用する酵素とピペットチップの価格が含まれています。96の手動およびリキッドハンドラーセットのうち95%で正しい配列が得られました。

全96個のアセンブリのうち、アコースティックディスペンサーで調製したサンプルから変換されたのは12個だけで、83%が正しかった。2つの反応では、出力プレート中のDNAと酵素マスターミックス液滴の混合が不十分であったためと思われるため、白いコロニーが得られませんでした。クローニング反応効率を、コロニーの総数に対する白色コロニーの比率で測定すると、手動でアセンブルされた反応とリキッドハンドラーでアセンブルされた反応の割合が同等であることがわかります。

当社のツールを使用すると、研究者はリキッドハンドリングロボットを活用して、組み合わせDNAライブラリを構築できます。この方法は再現性と拡張性に優れており、研究者の貴重な時間を節約し、人間が複雑なピペッティング作業を繰り返すことで生じるピペッティングエラーの可能性を低減します。このビデオをご覧いただければ、当社のオンラインツールを使用してモジュール式クローニング反応の組み合わせアセンブリを生成する方法と、生成された2つのピペッティングスクリプトをリキッドハンドリングロボットで実行する方法を理解できるはずです。

私たちは、リキッドハンドリングロボットによる自動DNAアセンブリを、将来の合成生物学研究室の1つのステップとして想定しています。設計の複雑さが増すにつれて、このようなアプローチがますます普及すると予想されており、このプロセスの最初のステップを表わしたことに興奮しています。