グループBのマウスモデル連鎖球菌膣植民地化

この動物モデルの全体的な目標は、グループB連鎖球菌、またはマウス膣管のGBSコロニー形成を確立することです。この方法は、コロニー形成に重要な細菌因子は何か、宿主の反応が膣の持続性にどのように影響するかなど、グループB連鎖球菌のコロニー形成に関する重要な問題を理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、通常、接種により、麻酔薬、免疫抑制剤、または増粘剤を使用せずに90%を超えるコロニー形成が得られることです。

マウスあたり0.5ミリグラムのベータエストラジオールを15ミリリットルの円錐管でボルテックスすることから始め、すべての塊が取り除かれ、ベータエストラジオールが微粉末として現れるまで。次に、シリンジは、マウスごとに100マイクロリットルのゴマ油を0.45ミクロンのストレーナーを介してチューブにろ過し、チューブを再度ボルテックスします。ホルモンがオイル全体に均質な懸濁液として分布している場合は、試薬を新しい10ミリリットルの注射器に引き込み、18ゲージの1インチの針を取り付けます。

マウス1匹につき100マイクロリットルの懸濁液を1ミリリットルのツベルクリン注射器に分注し、各ツベルクリン注射器に滅菌済みの26ゲージの半インチの針を装備します。次に、100マイクロリットルのβ-エストラジオールを各動物の腹腔の左下または右の象限に送達します。注射と同じ日に、トッドヒューイットブロス(THB)で目的のGBS株の5ミリリットルの一晩の液体培養物を摂氏37度で成長させます。

翌朝、GBSを新鮮なTHBで1〜10容量で継代培養し、37°Cで2〜3時間のインキュベーションを行い、細菌が中間対数期に達するまで培養します。次に、継代培養を滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に移し、細菌細胞を遠心分離します。ペレットを200マイクロリットルの滅菌PBSに再懸濁します。

次に、懸濁液の総量をマウス10匹あたり1ミリリットルのPBSまで増やし、新しい5ミリリットルの培養チューブでOD600を0.4にします。培養物を新しい15ミリリットルチューブに移し、細菌を再ペレット化します。次に、PBSの細胞を元の容量の10分の1で再懸濁します。

接種物の正確なCFUを決定するために、THB寒天上での段階希釈とメッキのために50マイクロリットルの細菌を予約します。次に、10マイクロリットルのGBSを200マイクロリットルのゲルローディングピペットチップに引き込み、最初の動物の首筋の緩い皮膚を親指と人差し指の間に手動で固定し、続いて尾を固定します。ピペットチップを膣内腔に5〜10ミリメートル挿入し、接種液の全容積を分注します。

次に、すぐに首筋を離し、尻尾を持ち上げて動物の後端を持ち上げ、前足を硬い表面で歩きます。1分後、接種材料の逆流がないか膣口を目視検査します。綿棒を拭く直前に、綿をPBSで事前に濡らし、示したようにマウスの1つを拘束します。

綿棒を膣内腔に10ミリメートル挿入し、膣壁にわずかな圧力をかけながら、時計回りに4回、反時計回りに4回ゆっくりと回転させます。100マイクロリットルのPBSが入った1.5ミリリットルの微量遠心チューブに綿棒を入れ、チューブと綿棒を約15秒間渦巻きにして綿繊維から細菌を放出します。次に、各サンプルをPBSで連続希釈し、1〜10の20マイクロリットルを1〜10,000希釈液で1〜10,000希釈し、メーカーの指示に従って調製し、摂氏37度で24時間インキュベートします。

GBSコロニーは、明るいピンクまたは藤色で表示されます。膣洗浄を収集するには、200マイクロリットルのゲルローディングピペットチップを使用して、20マイクロリットルのPBSを膣内腔に分配します。.全ボリュームをルーメン内で4回静かにピペットで上下させます。

次に、同じヒントを使用して、ボリューム全体を引き出します。下流の洗浄液分析では、洗浄液を0.7ミリリットルの微量遠心チューブに分注します。組織解剖の均質化には、安楽死させた動物の腹側腹部に70%のエタノールをスプレーし、滅菌ハサミを使用して腹骨盤腔を開きます。

生殖管が露出するように腸を変位させます。次に、子宮の体と卵巣の間の両方の子宮角を中くらいの長さで切ります。はさみと鉗子を使用して、内臓脂肪、膜、および膀胱を生殖管から分離し、組織を尾側に動かします。

次に、膣をできるだけ外陰部の近くで横方向に切断し、生殖管を体から分離します。無傷の生殖管を滅菌ペトリ皿に移し、新しいかみそりの刃を使用して子宮を子宮頸部から分離し、横方向に1回切ります。子宮頸部を膣から分離し、別の横方向のカットを行います。

次に、滅菌鉗子を使用して、各組織を、500マイクロリットルのPBSと均質化ビーズを含む、事前に計量された個々の2ミリリットルのチューブに移します。各2ミリリットルチューブの重量を量り、組織の重量を決定します。次に、スクリューキャップチューブをしっかりと密封し、組織ホモジナイザーで組織を最大速度で1分間均質化します。

細菌負荷を定量化するために、組織ホモジネートの25マイクロリットルを連続的に希釈し、1〜10から10、1000希釈を差動中寒天プレートで1〜10、24時間インキュベーションします、摂氏37°Cで。シトカイン定量のためにサンプルを保存するには、ホモジネートを摂氏マイナス 20 度で凍結します。これらの画像では、ウェットマウント膣洗浄液によって決定されるマウス発情サイクルの4つの段階が示されています。

発情促進期に接種されたマウスは、他のどの発情期よりも長くGBSに定着し、特に接種時に発情期のマウスにコロニーを形成しました。持続的な発情は、CD-1マウスのGBS A909の持続性を促進し、接種後2週間で90%のコロニー形成が観察されました。接種前にβ-エストラジオールを1回投与した典型的な実験では、接種後1週間でコロニー形成されたマウスはわずか40〜50%で、回復した平均GBSはコロニー形成の割合を模倣していました。

継続的な発情を維持することは、CD-1マウスの大部分でGBS膣の持続性を促進することを示しています。GBS A909は、近交系CD-1マウスおよび近交系FVBマウスの膣管に約1週間持続します。一方、近交系のBALB/cおよびC57BL/6マウスの大部分は、1週間で1か月以上コロニーを形成します。

接種動物におけるGFP陽性GBSの可視化は、マウスの膣上皮に付着し、他の天然の膣内細菌叢に近接したGBSの存在を示しています。接種中に逆流を防ぎ、すべてのマウスがコロニーを形成するようにすることが重要です。一度習得すると、このテクニックは動物の数にもよりますが、1〜2時間で完了することができます。

このモデルにより、宿主と病原体の相互作用の分野の研究者は、B群連鎖球菌のような細菌が女性の生殖管にコロニーを形成する能力を調査できます。この手順は、新しい化合物やプロバイオティクス治療をテストして、治療介入に関する追加の質問に答えるために使用できます。