の検出トリパノソーマバリアント表面糖タンパク質の切り替え

この方法の全体的な目標は、特定の変異体表面糖タンパク質またはVSGを発現するトリパノソーマを他の集団から単離し、開始優勢なVSGから他のVSGに切り替えた寄生虫を特定することです。この方法は、寄生虫の集団におけるVSGスイッチングに影響を与える要因やイベントなど、トリパノソーマ生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、以前に発表された方法よりも高速で、スイッチセルから非スイッチセルへの定量化が容易になることです。

同研究室が抗原変異の研究を始めた当初、最初の問題はレアなスイッチャーをどのように検出するかでした。この種の問題は、実際には数年前に免疫学で解決されており、磁気活性化セルソーティングを使用して特定の形質に陰性の細胞を濃縮することで解決されていました。非選択プロセスを抗原変異に移植することは、非常に有望なアイデアのように思えました。

まず、Lister 427株の血流トリパノソーマを0.5〜100, 000ミリリットルあたりの密度に成長させる必要があります。6細胞サンプルに10の50倍を15ミリリットルのチューブに分注し、遠心分離します。6つの細胞に10分の1を保存し、後で抗体陽性および陰性の抗体コントロールとして使用するために培養します。

上清の大部分をピペットで取り除き、チューブに約750マイクロリットルを残します。細胞を1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。最後に、細胞を摂氏4度で2800倍gで4分間遠心分離します。

そして、すべての上澄みをピペットで取り除きます。150 μLの培地に細胞を再懸濁し、さらに一次抗変異体表面糖タンパク質抗体または抗VSGを適切な希釈液で再懸濁します。次に、細胞を摂氏4度で10分間ボルテックスします。

800〜1000マイクロリットルの冷培地で洗浄します。細胞を摂氏4度で5200倍gで4分間遠心分離します。上清を吸引した後、1ミリリットルの培地で細胞を洗浄し、再度遠心分離します。

上清を取り除き、ペレットを100マイクロリットルの培地に再懸濁します。一次抗体に適したタイプの磁気活性化細胞選別マイクロビーズ110マイクロリットルを添加します。ピペッティングで上下に動かし、次にボルテックスしてよく混ぜます。

細胞がボルテックスしている間に、磁気活性化分離カラムをセットします。その下に15ミリリットルのチューブを置き、プライミング媒体を収集します。2ミリリットルの培地を加えて、カラムの下塗りを行います。

次に、サンプルをボルテックスから取り出し、800〜1000マイクロリットルの冷培養培地を追加します。サンプルを遠心分離し、上清を除去して結合していない抗体を除去します。ペレット化した細胞を1ミリリットルの培地で洗浄し、再度遠心分離します。

今回は上清を吸引しますが、チューブに100マイクロリットルを残します。ペレットが完全に再懸濁されるまで、遠心分離チューブを激しくフリックします。1ミリリットルの培地を加え、ピペットで上下に動かして細胞を完全に再懸濁します。

プライミング媒体の収集に使用した15ミリメートルの円錐形チューブを取り外し、新しい15ミリリットルの円錐形と交換して、切り替えられた寄生虫を含むフロースルーを収集します。プライミングしたカラムに細胞懸濁液を塗布します。フロースルーを15ミリリットルのチューブに集めます(通常、1ミリリットルのミディアムプラストリパノソーマには6〜7分かかります)。

次に、カラムを1ミリリットルの培地で2回洗浄し、フロースルーを同じチューブに集めます。合計約3ミリリットルのフロースルーを2本の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分割します。次に、チューブを氷の上に置きます。

カラムに3ミリリットルの培地を加え、カラムを15ミリリットルの遠心チューブに入れます。これにより、開始ドミナントVSGを発現する細胞が得られます。この溶出物を300マイクロリットル取り出して氷上に保管し、残りは廃棄できます。

ポジティブコントロールを作成するには、細胞の開始培養から約100, 000個の細胞を取り出し、それらを1.5ミリリットルの微量遠心チューブにピペットで移します。これを繰り返して、ネガティブコントロールを作成します。フロースルーサンプルとポジティブコントロールサンプルを遠心分離します。

そして、上澄みを取り除き、捨てます。ポジティブコントロール細胞を100マイクロリットルの培養培地に再懸濁し、一次蛍光色素標識抗VSG抗体を適切な希釈液で再懸濁します。次に、1つのフロースルーペレットを100 μLの培養培地に再懸濁し、一次蛍光色素標識抗VSG抗体を適切な希釈で再懸濁します。

次に、懸濁液を使用してペレットを2番目のフロースルーチューブに再懸濁し、1本のプールチューブを作ります。ピペッティングで上下させてよく混ぜます。細胞をボルテックスし、800〜1000マイクロリットルの冷培養培地を追加します。

サンプルを摂氏4度で5200倍gで4分間遠心分離し、上清を捨てて未結合の抗体を除去します。細胞を1ミリリットルの培地で洗浄し、細胞を遠心分離します。ポジティブコントロールとネガティブコントロール、および以前に氷上に保存された溶出細胞。

上清を捨てます。その後、148.5マイクロリットルの培地をサンプルに加えます。次に、25マイクロリットルの絶対計数ビーズを加え、続いて1.5マイクロリットルのヨウ化プロピジウム染色溶液を加えます。

ポジティブコントロールペレットとネガティブコントロールペレットを175マイクロリットルの培地で再懸濁します。これで、サンプルをフローサイトメーターで分析できます。これらのフローサイトメトリープロットは、二本鎖DNA切断を作成するために誘導されたトリパノソーマ集団からの細胞分離と非誘導細胞の結果を示しています。

左側のパネルには前方散乱と側方散乱が示されており、サンプルに添加された生細胞と死細胞、ビーズの解明が可能です。その後、スキャッター特性に基づいてこれらを決定するゲートを生成できます。右側のパネルには、左側のパネルで生成された散乱ゲートに基づいてライブとして分類できるセルのみが表示されます。

この場合、支配的な開始VSGはVSG2でした。ヨウ化プロピジウムに対して陽性で染色された細胞は死んだ細胞です。そして、これらはプロットのQ 1とQ 2の領域に見られます。

優勢なVSGに対して陽性で染色され、PIに対して陰性に染色された細胞は、Q 3領域に分類され、汚染物質です。最後に、Q 4の細胞は、スイッチャーと見なされる優性VSGに対して陰性に染色される生細胞です。このプロットは、トリパノソーマ集団の計算された観測されたスイッチング周波数を、誘発されたブレークがある場合とない場合を示しています。

in vitroでの確率的スイッチングのレベルはかなり低いです。ブレークを誘導すると、細胞が大幅に増加しますが、非ドミナントVSGに切り替えます。一度マスターすれば、このテクニックは約3時間で実行できます。

この手順を試行する際は、サンプルを全体を通して冷たく保ち、特にカラムで分離する前にペレットを適切に再懸濁することが重要です。この手順に続いて、RNAシーケンシングなどの他の方法を使用して、スイッチ集団でどのVSGが発現しているかなどの追加の質問に答えることができます。これらの方法は、通常、VSGスイッチングの測定に使用されますが、目的の任意の表面タンパク質を発現する寄生虫の単離および定量にも使用できます。