ストレス植物から単離された葉緑体へのタンパク質のインポートの分析

この方法論の全体的な目標は、ストレスの影響に特に焦点を当てて、核にコードされたタンパク質の葉緑体へのインポートを研究することです。この方法は、葉緑体タンパク質の輸入がどのように制御されているかなど、葉緑体分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の特定の利点は、ストレスが葉緑体タンパク質の輸入に及ぼす影響を評価できることです。

この方法は、モデル植物であるシロイヌナズナで使用するために開発されましたが、作物植物などの他のシステムで使用するために変更して適応させることができます。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるQihua Lingです。まず、付属のテキストプロトコルで説明されているように、シロイヌナズナの植物を育てます。

その後、植物が生後8日になったら、ストレス治療を行います。寒天プレートから植物を手でそっとこすり落とし、ストレッサーを含む液体MS培地の滅菌フラスコに入れます。実験の性質によっては、ストレッサーなしで同様のフラスコに追加の植物をコントロールとして入れることも必要かもしれません。

フラスコの口を滅菌したホイルで覆い、オービタルシェーカーで植物をさらに2日間成長させます。まず、50ミリリットルの遠心分離チューブに13ミリリットルのPercoll、13ミリリットルの2×クロロプラスト分離バッファー、および5ミリグラムのグルタチオンを混合することにより、連続的な密度勾配を調製します。次に、混合物を遠心分離します。

遠心分離後は、グラジエントを乱さないように注意してチューブを取り扱い、後で使用するために氷の上に置いてください。次に、1条件あたり100ミリリットルの葉緑体分離バッファーを1リットルのビーカーに移します。苗をふるいに傾けて、液体培地から苗を取り除きます。

次に、それらを葉緑体分離バッファーを含むビーカーに移します。組織をバッファーですすぎ、残留培地を除去してから、バッファーを100ミリリットルの新鮮な分離バッファーと交換します。均質化の最初のラウンドでは、植物組織を手で50ミリリットルのビーカーに移し、前のバッファーを指から排出させます。

次に、組織ホモジナイザーのプローブを組織に配置し、それぞれ1〜2秒の2つのパルスで均質化します。ホモジネートを2層のろ過布でろ過し、250ミリリットルの遠心分離チューブに入れます。生地を優しく絞るようにして仕上げます。

濾液を保持し、植物組織を50ミリリットルのビーカーに戻します。次に、2番目の20ミリリットルの葉緑体分離バッファーを50ミリリットルのビーカーに入れ、最初の均質化ラウンドで使用されなかった残りの組織を追加します。均質化とろ過のステップをさらに4回繰り返します。

プールしたホモジネートを1, 000倍gで摂氏4度で5分間遠心分離します。遠心分離後すぐに上清を注ぎ、ペレットを乱さないように注意してください。チューブを氷の上に置き、チューブを穏やかに攪拌して、ペレットを残留上清に再懸濁します。

次に、パスツールピペットを使用して、ホモジネートを既製の連続密度勾配の上部に、受け入れチューブの壁を介して穏やかに転写します。次に、ブレーキをオフにして、スイングバケットローターで7、800倍g、摂氏4度で10分間、サンプルを遠心分離します。終了したら、グラデーションに見える 2 つの緑色の帯を観察します。

壊れた葉緑体を含む上部のバンドを廃棄し、パスツールピペットを使用して、無傷の葉緑体を含む下部のバンドを新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。次に、25ミリリットルのHMSバッファーをチューブに加え、チューブを2回反転させて葉緑体からパーコールを洗い流します。次に、チューブをスイングバケットローターに戻し、葉緑体を再ペレットします。

上清を注ぎ、氷上でチューブを穏やかに攪拌することにより、ペレットを残留バッファーに再懸濁します。必要に応じて、HMSバッファーを100〜300マイクロリットル追加しますが、サンプルを希釈しすぎないようにしてください。再懸濁した葉緑体を氷の上に保存します。

まず、1.5ミリリットルのチューブに入った495マイクロリットルのHMSバッファーに、5マイクロリットルの単離葉緑体を加えます。チューブを反転させて、溶液を穏やかに混合します。次に、血球計算計の計数室の上にカバーガラスを置きます。

希釈した葉緑体懸濁液の40〜60マイクロリットルを、カバーガラスと計数室との間の隙間にゆっくりとピペットで移します。位相差顕微鏡を使用して、20倍の対物レンズで葉緑体を画像化します。無傷の葉緑体は丸くて明るく見え、光のハローに囲まれています。

次に、10倍の対物レンズを使用して、10個の大きな正方形の葉緑体の数にします。大きな正方形あたりの葉緑体の数は、平均して10〜30である必要があります。葉緑体が少なすぎるか多すぎる場合は、希釈係数を調整して手順を繰り返します。

適切な範囲内に入ったら、付属のテキストプロトコルで説明されているように、ミリリットルあたりの葉緑体の数を計算します。3つのタイムポイントでタイムコースを実行するには、それぞれに130マイクロリットルの輸入ストップバッファーが入った3本のチューブを用意し、氷の上に置いておきます。2ミリリットルのチューブに、反応バッファーと放射線標識前駆体タンパク質を含む輸入反応を調製します。

テストする条件ごとに 1 つの反応がある必要があることに注意してください。1 時点あたり約 1,000 万個の葉緑体を使用します。反応チューブを摂氏25度で、限られた量の光の下で水浴中でインキュベー

時々チューブをフリックして葉緑体を再懸濁します。タイムコースを実施するには、輸入の線形範囲内の必要な時点における反応から130ミリリットルのアリコートを使用します。回収後すぐに、各130マイクロリットルのアリコートを、チューブを軽くたたいて混合した氷冷輸入ストップバッファーのチューブに移し、時間経過が完了するまでチューブを氷の上に置きます。.

最後のサンプルが除去されたら、すべてのサンプルをマイクロフュージで12, 000倍gで30秒間遠心分離します。次に、上清を捨て、ペレットを15マイクロリットルの2 x タンパク質ローディングバッファーに再懸濁します。次に、ボルテックスによってサンプルを混合します。

最後に、すべてのサンプルとプリカーサーインプットコントロールを、標準のSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィー、蛍光透視法、またはリンイメージングを使用して分析します。PsaDは、光化学系Iの18キロダルトンの成分であり、23キロダルトンのより大きな前駆体として合成されます。成熟した18キロダルトンの形態への加工は、葉緑体への輸入が発生したことを示しています。

ここで研究されたシロイヌナズナのsp1変異体は、葉緑体タンパク質の輸入機構であるsp1タンパク質の重要な調節因子に欠陥を持っています。ストレス条件下では、sp1変異葉緑体へのPsaDタンパク質の輸入量は野生型に比べて増加しますが、通常の非ストレスフル条件下では増加しません。成熟タンパク質型のPsaDは、両方の植物遺伝子型の葉緑体で時間依存的に蓄積されましたが、sp1変異葉緑体は野生型葉緑体よりも輸入率が有意に高かった。

これらの結果は、ストレス条件下での葉緑体タンパク質の輸入調節におけるsp1タンパク質の重要な役割を示唆しています。この方法は、葉緑体の単離からインポートアッセイの完了まで、一度習得すれば5〜6時間で完了することができます。この手順を試行する際は、葉緑体が最大の活性を保持するように、すべての葉緑体分離ステップを摂氏4度で実施することを忘れないようにすることが重要です。

数十年前に開発された最初の試験管クロロプラストタンパク質インポートアッセイは、この分野の研究者が葉緑体タンパク質のインポーネティックメカニズムのさまざまな側面を探求する道を開きました。ここで紹介する改良により、ストレス条件がタンパク質の輸入に及ぼす影響を調査することができます。放射性物質の取り扱いには特別な注意が必要であることを忘れないでください。

この手順を実行するときは、手袋、白衣、安全メガネの着用などの予防策を常に講じる必要があります。