Name: ストレス植物から単離された葉緑体へのタンパク質のインポートの分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぼう、ストレス条件下での葉緑体タンパク質輸入の調節機構をArabidopsis thalianaを用いて解明する方法。この技術は迅速かつ簡便で、植物生理学の研究に有用です。

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この作品は、バイオテクノロジー・生物科学研究会議からPJへの助成金によってサポートされていました（BBSRC; REFを付与BB / K018442 / 1。）。

1.シロイヌナズナ植物の成長とストレス処理<ol><li> MS基礎塩混合物4.3グラム添加することによって、1ムラシゲのL及びスクーグ（MS）培地を調製し、10gのスクロース0.5 gで2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）1 Lの純水まで、および調整水酸化カリウム（KOH）で5.7のpH。 120℃で20分間phytoagar、オートクレーブの6グラムを追加します。 <ol><li>固化する前に、（ - プレートあたり25 mLのMS培地20と直径9センチメートル、高さ1.5センチメートル、）ラウンドペトリ皿に培地を注ぎます。プレートは蓋を閉じる前に、層流フード中〜1時間乾燥することができます。 </li></ol></li><li> 70％の1mLの0.02％（v / v）のトリトンX-100を含有し、連続して5〜10分間振盪（v / v）エタノールを添加することによって表面滅菌1.5 mLの試験管にシロイヌナズナの種子を置きます。 150本の苗木 - 各遺伝子型/条件については、10ペトリ皿ごと運ぶ〜100を準備します。 </li><li>種子がに落ち着くまで、約10秒間待ってくださいチューブの底、その後、ピペッティングにより上清を捨てます。 100％エタノール1 mLを加え、10分間再びチューブを振ります。 </li><li>種子は殺菌されている間、層流フードを準備します。 、サンプルあたりろ紙一枚を取る播種を容易にするために、半分に折り、そしてフード100％エタノール中に浸します。それが完全に乾くまで待ってください。それは、より迅速に、70％エタノールより蒸発するように100％エタノールを使用することに留意されたいです。 </li><li>細かい端から〜5ミリメートル1 mLのピペットチップカットを使用してピペットで濾紙上に種子を転送します。 15分 - 約10を取るべきである、それらを乾燥することができます。 </li><li>各MS培地ペトリ皿上に均等に150殺菌した種子、および外科テープで各プレートをシール - 〜100をまきます。 </li><li>奨励し、発芽を同期させるために4日間 - 逆さま2用の4℃でプレートを保管してください。古い種子を4℃で（週まで）長く滞在する必要があるかもしれません。 </li><li>植物組織培養室にプレートを移し、逆さまアップそれらを残します。20℃で長い日サイクルで8 D（1、光、8時間暗- - 2・sで16時間100マイクロモル・メートル）のために植物を育てます。 </li><li>植物が流フード中で、8日齢であるストレス処理については、優しくストレッサーを含む液体MS培地の滅菌フラスコに、エタノール滅菌手袋を着用して手でそれらを掻き落とし、寒天培地からそれらを転送する（ 例えば 、 、200mMのマンニトール）。寒天培地の上に運ぶことは避けてください。滅菌ホイルでフラスコの口を覆い、植物が穏やかに振盪（〜100 rpm）ででオービタルシェーカーでさらに2日間の工程1.8と同様の条件で成長することができます。 </li></ol> 2. in vitro転写/翻訳により前駆体タンパク質を作ります注：このプロトコルは、私は、テンプレート/プレタンパク質としてD前駆体（pPsaDを）サブユニットシロイヌナズナ光化学系の使用を想定していますが、この方法は、他の人と互換性があります。 <ol&gt; <li> pBlueScript II SKベクター（または上流のT7プロモーターを有する任意の他の同様のベクター）13の多重クローニング部位（MCS）にpPsaDのコード配列（CDS）をクローニング。 DNA単離キットを用いてプラスミド（をpBSK-pPsaD）を精製し、DNA配列決定により配列を確認してください。 注：すべての手順は、標準的な分子クローニング技術を採用しています。 </li><li> 260 nmの吸光度を測定するように設定し、分光光度計を用いたpBSK-pPsaDプラスミドDNA濃度を決定します。 10 ngの/μLの最終濃度にプラスミドを希釈します。 </li><li>テンプレートとして希釈したプラスミドを用いて、（35サイクル）20μLPCRを実行します。 2μLの10×ポリメラーゼバッファー、2μLの2mMのdNTPを、1μLの5 mMのM13フォワードプライマー（5&#39;-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 &#39;）、1μL5 mMのM13リバースプライマー（5：次のように反応を準備します「-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3 &#39;）、1μLは、最大全反応容量を作ることをpBSK-pPsaDプラスミド、1 UのTaqポリメラーゼ、及び蒸留水を希釈20μL。以下のように、標準的なPCRプログラムを使用してください：95°C、5分。 [95°C、30秒の35サイクル。 56℃、30秒。 72℃、30秒）。 72℃、5分間。 </li><li> cDNAの正確​​な増幅を確認し、関連を定量化するためにTAE緩衝液中の1％（w / v）アガロースゲル（トリス-HCl、pH7.6の、20mMの酢酸、1mMのEDTA）でPCR産物の5μLを実行します濃度を確認するための基準に相対的なバンド。さらにアプリケーションのために-20℃で製品の残りの部分を格納します。 </li><li>以下のように、PCR DNAと互換性のウサギ網状赤血球溶解物ベースの無細胞転写/翻訳系を用いて、50μLの反応を準備します。40μL網状赤血球溶解液を転写/翻訳系から、2.5μL放射性標識された[35 S]メチオニン、11μCiの/ mLの（比活性：&gt;千CI /ミリモル）、2.5μLの滅菌蒸留水、および5μLpPsaD PCR産物（100から800 ngの）。 注意：手袋、実験用衣類や安全GLASを着用SES放射性物質を取り扱います。作業面や機器を監視し、除染。承認された廃棄物容器内のすべての放射性廃棄物を処分。 </li><li> 30℃の水浴中で90分間、反応をインキュベートします。氷の上にサンプルを置くことによって反応を停止させます。 </li><li>オートラジオグラフィー、フルオロまたは蛍光イメージングに続く標準ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で確認するための試験試料と反応（同じ体積でも、ステップ5.7の入力コントロールとして機能することができる）の1μLを除去します。良好な結果がpPsaD（〜23 kD）の分子量に対応するはっきりと強いバンドの観察によって示されています。さらにアプリケーションのために-80℃で反応の残りの部分を格納します。 </li></ol> 3.葉緑体の単離<ol><li>以下のストック溶液を準備します。 <ol><li> 0.6 Mソルビトール、10mM塩化マグネシウム：葉緑体の単離緩衝液（CIB、2倍）を準備（のMgCl 2）、10 mMのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、10mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、20mMの重炭酸ナトリウム（ 炭酸水素ナトリウム）、40mMの4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES） ; KOHでpH 8.0に調整します。 、2X CIBの2リットルを調製し、アリコートを作製し、長期保存のために-20℃に保管し、又は短期貯蔵のために4℃で。蒸留水で1;：1xのCIBを作成するには、2倍CIB 1を希釈これは、葉緑体の分離実験の日に新たに調製することができます。 </li><li> HEPES-のMgSO 4 -Sorbitolバッファ（HMS、1倍）を準備します50mMのHEPES、3mMの硫酸マグネシウム（MgSO 4）し、0.3 Mソルビトール;水酸化ナトリウム（NaOH）でpH8.0に調整します。 、緩衝液を400mLを調製アリコートを作成し、長期保存のために-20℃に保管し、又は短期貯蔵のために4℃で。 </li></ol></li><li>低温室でまたは氷の上で次の手順のすべてを行っています。目の前にソリューション、デバイス、機器、およびローターのすべてを予冷arting。 </li><li> 50 mL遠心チューブに13 mLのパーコール、13 mLの2倍CIBバッファ、および5mgのグルタチオンを混合し、4℃で30分（ブレーキオフ）のために43,000×gで混合物を遠心分離することにより、連続的な密度勾配を準備します。遠心分離した後、勾配を乱さないよう、後で使用するために氷の上にそれを維持するために注意してチューブを処理します。 </li><li> 1リットルのビーカーに遺伝子型/条件当たり1×CIBの100ミリリットルを転送します。 <ol><li>ふるいにそれらを傾けて液体媒体から苗を取り出し、別のCIB含有ビーカーに移します。その後、新鮮なCIBの100mLでそれを交換する前に、すべての残留液体培地を除去するために、CIBで組織をすすぎます。 </li></ol></li><li>均質化のために、各50 mLビーカーに開催された新鮮なCIBの20ミリリットルを使用してラウンド、均質化の5つの連続したラウンドでサンプルあたり1×CIBの100ミリリットルの合計を使用します。 <ol><li>均質化の最初のラウンドのために、できるように、手で50 mLのビーカーに植物組織を転送前の保持バッファは、あなたの指を介して排出します。最初のラウンドでの組織のほとんどを使用してみてください、それは緩衝液で浸されていることを確認します。これが不可能な場合は、第二ラウンドで残りの未使用の組織をご紹介します。 </li></ol></li><li>組織内に組織ホモジナイザーのプローブを配置し、1の2つのパルスを用いて均質化 - 2秒ごと。穏やかな圧搾により250 mLの遠心管に濾過布の2層を通してホモジネートをフィルタリングします。ろ液を保持し、50 mLビーカーに戻って組織を移します。 </li><li>均質化の最初のラウンドで使用されていない残りの組織を追加し、50 mLのビーカーに第20 mLのCIBのアリコートを配置し、均質化および濾過手順を繰り返します。このように、繰り返しCIBの100ミリリットルの全てまで、3.5と3.6のステップ（ すなわち 、20ミリリットルの5アリコート）まで使用し、得られたろ液を組み合わせてきました。 </li><li>遠心分離機4℃で5分（上のブレーキ）1,000×gでプールされたホモジネート、およびオフ注ぎます上清をすぐにペレットを乱さないように注意しながら、遠心分離が完了したことを以下に示します。軽くチューブを氷上に攪拌することにより、チューブ内に残っ残留上清中にペレットを再懸濁。ピペッティングまたはボルテックスによって活発に再懸濁されません。 </li><li>穏やか受信チューブの壁を介してそれを適用するためにパスツールピペットを使用して、既成の連続的な密度勾配の上部にホモジネートを転送します。勾配を乱すことは避けてください。 4℃で10分（ブレーキオフ）のための7800×gで、スイングバケットローターで遠心分離。 注：2つの緑のバンドが、遠心分離後の勾配で見ることができます下のバンドは、無傷の葉緑体を含み、上のバンドは、壊れた葉緑体が含まれています。 </li><li>ピペッティングによりトップバンドを捨て、その後、勾配当たり最大8ミリリットルの容量を維持し、新鮮な50 mL遠心管にパスツールピペットで下側のバンドを移します。 </li><li>トン〜1×HMSの25 mLのチューブにバッファを追加し、二回チューブを反転O葉緑体からパーコールを洗います。 4℃で5分（上のブレーキ）1,000×gで、スイングバケットローターと遠心機で再びチューブを置きます。 </li><li>上清を捨て、慎重に穏やかにチューブを氷上に攪拌することにより、チューブ内に残っ残留HMSで葉緑体ペレットを再懸濁します。 （ペレットの大きさと第4節でカウントに基づいて）必要であれば、HMSの300μL、あまりにも多くのサンプルを希釈しないようにしてください - 追加の100を追加します。 <ol><li>氷の上で葉緑体を保管してください。葉緑体は、下流の用途に使用される前に、毎回、それらを再懸濁し、チューブを横に振ります。常に葉緑体を転送する（拡大細孔を持つ）カットピペットチップを使用します。 </li></ol></li></ol>葉緑体の収量および無傷の4分析<ol><li> 1.5 mLのチューブで495μLの1x HMSのバッファに分離された葉緑体の5μLを追加し、1得るためにチューブを転倒混和：100希釈を。 </li><li>プラ血球計の計数室の上にカバーガラスをCE。ゆっくりピペット〜40 - カバーガラスと計数室との間の隙間に希釈された葉緑体懸濁液60μL。 10Xや20X目的とした位相差顕微鏡を使用して、無傷の葉緑体は、ラウンドと明るく見える光のハローに囲まれています。 注：顕微鏡下で、1ミリメートル2カウント面積が25大きな四角であり、計数室の中心に16の小さな正方形を含む各。 </li><li> 10大きな四角内の葉緑体の数をカウントします。少なすぎたり多すぎたり、葉緑体が存在する場合、それに応じて希釈係数（上記のステップ4.1）を調整し、手順を繰り返して10〜30の大平方あたりの葉緑体の数が平均化する必要があります。 </li><li>次のようミリリットル（濃度）あたりの葉緑体の数を計算します。nは（ステップ4.3で算出された大きな広場あたりの葉緑体の平均数）25×（大正方形の総数））100（希釈係数×25の正方形上記のボリュームが0.1mm 3であるので、（）、1ミリリットルあたりのデータを表現するためにスケーリング係数10×4。 </li><li>ステップ3.12で得られた葉緑体懸濁液の体積濃度を乗じて葉緑体の実際の収量を計算します。通常、50以上×10 6葉緑体を得ることができます。 </li></ol> 5.葉緑体のタンパク質のインポート<ol><li>以下のストック溶液を準備します。 <ol><li> 10倍HMSバッファを準備します：500mMのHEPES、30mMのMgSO 4を、および3.0 Mソルビトール; NaOHでpHを8.0に調整します。短期保存用の長期保存のために4℃で、このバッファ、アリコートし、-20℃で保存、50mLのを準備します。 </li><li> 1×HMS緩衝液に溶解し、50mMのEDTA：輸入停止緩衝液を準備します。 -20℃で、このバッファ、アリコート、および店舗の50ミリリットルを準備します。 </li><li> （W 60mMのトリス-HCl、pH6.8の、10％（v / v）グリセロール、2％：2×タンパク質装填緩衝液を調製します/ V）SDS、0.005％（w / v）のブロモフェノールブルー。 4℃で50ミリリットル、およびストアを作成します。使用直前に、バッファの900μLの1 Mの1,4-ジチオスレイトール（DTT）の100μLを追加します。 </li></ol></li><li> 、3の時点で時間経過を実行する3つの管の輸入停止緩衝液の130μLアリコートを含む各を用意し、氷の上に置いておくにします。 （遺伝子型/条件あたり）2 mL試験管中の450μLのインポート反応を準備します。使用直前にすべての材料を解凍します。 <ol><li> 1インポート反応のために、一般的にμL容積の10×10 6葉緑体を使用します。例えば、葉緑体の濃度が2.5×10 8 / mLである場合、40μL葉緑体の懸濁液を使用しています。 3つの時間点は、3×μLが必要になります（ つまり 、この例では120μL）。 </li><li> 、;（この例では、すなわち、48 B = [600-3×A] / 10）蒸留水（全量600μLを作るために）、BμLの10x HMSバッファ：次の順序で氷上で反応成分を混ぜます12μL1 Mグルコン酸（カリウム塩）、6μLの1MのNaHCO 3、6μL20％（w / v）のBSA、30μLの100mMアデノシン5&#39;-三リン酸マグネシウム塩（をMgATP）、24μLの250mMのメチオニン（放射標識されません）、および30μL、タンパク質前駆体。すぐにインポート反応を開始する前に、3×葉緑体のμLを加え、穏やかにチューブをタップして混ぜます。 </li></ol></li><li> 2・sで- - 1光100マイクロモル・メートル下の水浴中で25℃で反応チューブをインキュベートします。時折、葉緑体を再懸濁し、チューブをフリック。 </li><li>時間経過を行うために、pPsaDのために〜12分（4,8及び12分の時点が適当であるまである輸入の直線範囲内で必要な時点で反応から130μLアリコートを撤回この場合）。線形範囲の期間は、異なるタンパク質14のために変化することができます。したがって、Tを最適化する前に、各個々のプレをテストするために提案されています彼は時間を指します。 </li><li>すぐに撤退時に、優しくチューブをタップして混ぜ、氷冷輸入停止緩衝液のチューブにそれぞれ130μLのアリコートを転送し、時間経過が完了するまで氷上ですべてのチューブを保持しています。 </li><li>遠心分離機マイクロフュージで12,000×gで30秒のすべてのサンプルは、ピペットで上清を破棄し、再懸濁ペレットボルテックスで15μL2倍のタンパク質ローディングバッファーインチ</li><li>全てのサンプルに加えて、標準的なSDS-PAGE及びオートラジオグラフィー、フルオロまたは蛍光イメージング15によってpPsaD入力制御（ステップ2.7からの各インポート反応に添加量の10％にpPsaD相当を含有）を分析します。結果を定量化し、分析するために画像解析ソフトウェアを使用してください。取り込み効率の指標を提供するために、異なる遺伝子型/状態にインポートされたタンパク質の量は、それぞれ、成熟バンドに関連した放射能を測定することによって評価することができます。 </li></ol>

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我々は最近、葉緑体タンパク質のインポートが積極的に葉緑体の機能や植物の生存3のために重要であるストレスによって調節することができることを示しました。その研究では、このような調節をモニターするために、我々は、ストレス条件下で生育させた植物の輸入能力の評価を可能にするために、私たちの葉緑体の単離およびインビトロ取り込みアッセイ手順で修飾しました 。結果は、葉緑体タンパク質の輸入規制でSP1の重要な役割を示しました。 従来のin vitroでの輸入アッセイは、標準のMS寒天培地6,17,18上に成長させた植物を使用しています。ここに記載SP1突然変異体の場合には、このような従来のアッセイは、WT 3タンパク質インポート相対の違いを明らかにしませんでした。タンパク質取り込みは、本明細書に記載される方法（ 図1）を用いて、ストレス条件下で評価される場合しかし、タンパク質取り込みの調節におけるSP1の役割が明確に明らかにされます。それメートルしばらくAY直接（メソッドはそれぞれ、液体培養及び寒天培地上で成長した植物を利用するように）従来のアッセイから得られたものとストレス状態の分析からインポートデータを比較することはできない、ストレスと非ストレス条件間の比較が可能ということに提供されています植物は、すべてまたはストレス要因なしで、同じ液体培地で増殖させます。 寒天培地上のストレス処理と比較して、液体培養物は、インビトロ取り込みアッセイのために必要な植物の多数の治療のためのより便利です。また、短期ストレス治療のために特に重要である、すべての植物に、ストレッサーの均一な適用を容易にします。ここに提示された方法は、マンニトール処理を用いて浸透圧ストレスを研究するために適用されているが、容易に他のストレスの広い範囲に適合させることができます。例えば、対応するストレッサーをb可能性があるために、短期的な塩ストレスと酸化ストレス、eは、同様にMS液体媒体を介して適用されます。ストレスの他のタイプのために、私たちはストレスの度合いが最初に最適化されている示唆しています。過度に厳しい処置は、単離された細胞小器官の収率および/または輸入能力に悪影響を与える可能性があり。 以下に詳述するように、1つは、特別な注意を払う必要があるプロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。 メーカーによって - （w / vで、0.9％0.6）MS培地のための最適な寒天濃度が異なることがあります。したがって、経験的に実験を開始する前に寒天濃度を最適化することをお勧めします。媒体は、それが収穫段階（ステップ1.9）で組織にこだわっていない、どちらも、それは植物の根の発達を阻害することに一生懸命でなければならないほどソフトであってはなりません。スクロース濃度を使用しても、植物に応じて調整することができます。 （w / v）のスクロースは、植物がよく育つのを助けることができる3％ - 特に病気の突然変異体で作業する場合、MS培地は、2を補いました。ときアプリストレス処理横たわって、液体培地（ 例えば 、&gt; 14日齢）に非常に古い工場を移転するのはよくないです。古い植物のより発展した根がより簡単譲渡の際に破損しているためです。 小麦胚芽に基づくもの、およびウサギ網状赤血球に基づくもの：転写/翻訳系に関しては、2つの主要なシステムがあります。これらのキットは、このような線状化プラスミド、unlinearizedプラスミド、またはPCR産物などの異なるテンプレートを使用することができます。キットはまた、T3、T7、およびSP6プロモーターに特異的です。我々はここでお勧めのキットは、PCR産物およびT7プロモーターとの使用にのみ適していることに注意してください。しかし、未知の理由のために、このシステムで作られたいくつかの放射性標識されたプレタンパク質は、インポートアッセイで効率的に動作しない場合があります。このような場合に、一つはコムギ胚芽抽出物系またはプラスミド鋳型のためのもの、網状赤血球溶解物系を試みる考慮することができます。 1つはまた、転写/翻訳の再の結果を改善することができますメーカーのハンドブックに従って反応条件を変更することによって、アクション。 無傷の細胞小器官の分離を妨げることができ、光合成による葉緑体の内部のデンプンの蓄積を避けるために早朝（または早期成長チャンバの光サイクルにおける）における葉緑体の分離を開始することが重要それです。葉緑体の単離手順は不要な遅延なく迅速に行わなければならず、孤立した葉緑体は常に冷たい保たなければなりません。これは徐々に良くない彼らの生存能力を、失うことになる葉緑体を単離し、観察を軽減することです。新たに解凍したCIBまたはHMSバッファを使用している場合は、均一な溶液を得るために、使用前によくバッファーを混合するようにしてください。植物材料の均質化のための最適な条件は、経験的に確立されており、異なる組織ホモジナイザーを使用している場合変更することができます。 異なる植物遺伝子型はsimilaが含まれている場合Rクロロフィル濃度は、クロロフィルの定量化は、インポートアッセイを行う前に、サンプルを正規化する別の方法として使用することができます。クロロフィルは、80％で単離された葉緑体の試料の抽出（v / v）のアセトン水溶液19,20以下の分光光度法で測定することができます。植物の輸入率は（ 例えば 、クロロ表現型を有する変異体）が比較される別のクロロフィル内容を示す場合は、インポートアッセイで葉緑体のサンプルを正規化するためにカウント葉緑体番号を使用します。なお、ステップ3.11で徹底的に葉緑体を再懸濁することが特に重要です。不十分な再懸濁は、それが困難な正確な数字をカウントするようになりますので、輸入反応で正しいロードを妨げるであろう、葉緑体の集合体を残すことができます。重度の凝集は顕微鏡下で見ている場合（ 例えば 、&gt; 10葉緑体を接合して集約）、aggregatまで氷上に葉緑体サンプルを振っ続けますESは削除されます。バッファの小容量で葉緑体を再懸濁する方が簡単です。 タンパク質輸入反応（第5節）は、それらの放射性性質の適切な予防措置を用いて実施されなければならないことを認識することが重要です。必要な予防措置が含まれます：監視と作業面と機器の汚染除去、および承認された廃棄物容器内のすべての放射性廃棄物の処分、使い捨て手袋、実験室の衣類と安全メガネを着用して。また、正しい浸透圧が輸入反応の間葉緑体の完全性を維持するために重要であるということを覚えておいて、これは主にHMSバッファによって維持されています。 10X HMSが粘性であるので、最初に室温にまで加温しても、その後完全に混合し、そして正確な体積の測定を確実にするために切断されたピペットチップを使用して適用すべきです。インポート反応において、冷メチオニンは無関係chloroplに遊離放射標識メチオニンの取り込みを阻害するために添加されますインキュベーション工程の間オルガネラ翻訳を通じてASTタンパク質、BSAは、プロテアーゼの基質として作用することによってタンパク質分解を最小限にするために使用されます。

葉緑体は植物の緑の組織内に存在する非常に豊富細胞小器官です。彼らは、光合成におけるそれらの重要な役割、糖に二酸化炭素を変換するので、地球1のほぼすべての生活を支援するために光エネルギーを使用して処理するためのよく知られています。また、葉緑体（および色素体と呼ばれる関連オルガネラの広いファミリーは）、アミノ酸、脂質、顔料、および、重力や病原体のチャレンジとして環境シグナルの感知の生合成を含む、植物の他の多くの重要な役割を果たしています。光合成は、特定の状況下で有用な役割を有する、副生成物として、反応性酸素種（ROS）を生成するが、場合に損傷あるいは致死効果を引き起こす可能性が過剰生産します。 ROSの過剰産生は、特に有害な環境条件によって促進され、したがって、葉緑体は密接にそのような塩分や浸透圧ストレス2などの非生物的ストレスに対する応答にリンクされています。 Chのloroplastsは、複雑な構造を有しています。それぞれの葉緑体は、外側と内側の膜で構成され、エンベロープと呼ばれる二重膜の外層に囲まれています。内部的には、光合成の光反応が起こるチラコイドと呼ばれる別の膜システムがあります。 2膜システムとの間の水性区画コール炭素固定に関与している間質、があります。葉緑体は、最大3,000〜に異なるタンパク質を含んでいてもよく、これらのタンパク質の大部分は、前駆体の形で細胞質ゾルで合成され、エンベロープ膜1における専用のタンパク質transloconsを介して細胞小器官にインポートする必要があります。興味深いことに、最近の研究では、葉緑体タンパク質のインポートが積極的に規制されていることが示されており、そのように葉緑体プロテオームの制御の重要なレベルを発揮することができます。例えば、タンパク質移入は番目の豊富の直接の調節を介して非生物的ストレスに応答することができることを2015年に報告されましたユビキチン-プロテアソーム系3によって葉緑体（TOC）の外側エンベロープ膜における電子トランスロコン。 精製された葉緑体を使用してインビトロ合成前駆体タンパク質において 、タンパク質取り込みは、in vitro 4,5 で再構成することができます。したがって、in vitroの方法は、タンパク質の輸入機械の推定成分の分析のためにとタンパク質のインポートとその調節のメカニズムを発見するための重要な手法となっている別の変異植物6にインポートの速度を評価するために使用することができます。また、葉緑体は、葉緑体タンパク質7,8のサブオルガネラ局在化およびトポロジーの研究を容易にすることができるin vitroでの輸入、以下、さらに分別またはプロテアーゼ消化を用いて処理することができます。 我々は説明しますようにストレスによってタンパク質移入の調節を研究するために、私たちは日常的葉緑体分離法を修正しましたここに。重要なことには、葉緑体を8日間培地寒天標準ムラシゲ・スクーグ（MS）上で増殖させ、その後、比較的短い、制御された応力の治療を提供し、ストレッサーを補充した液体MS培地に移しておいた植物体から単離しました。このようなストレス処理した植物から単離された葉緑体の収率および能力は、in vitroタンパク質移入アッセイ3 の下流と互換性があります。葉緑体の分離プロトコルに加えて、我々は、堅牢であることが判明していると広く3,9-12を使用されているin vitroでのタンパク質のインポート、私たちの日常的方法を提示します。

<table><tbody><tr><td>ムラシゲとスクーグの基礎塩&nbsp;</td><td>メルフォード</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>フィトアガー</td><td>メルフォード</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-モルフォリノ) エタン スルホン酸 (MES)</td><td>メルフォード</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>フィッシャー</td><td>BPE151-500</td><td></td></tr><tr><td>サージカルテープ (e.g., Micropore, 3M)</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>フィッシャー</td><td>FB59023</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fisher</td><td>10607095</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール四酢酸 (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>D/0700/53</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>濾過布 (ミラクロス)</td><td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>50 mL遠心分離管</td><td>Fisher</td><td>CFT-595-040M</td><td></td></tr><tr><td>250 mL遠心分離ボトル</td><td>Fisher</td><td>CFT-891-V</td><td></td></tr><tr><td>Polytron (例:, Kinematica PT10-35)</td><td>Fisher</td><td>11010070</td><td></td></tr><tr><td>Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S)</td><td>Fisher</td><td>11030083</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 (例:、ベックマン・コールター アバンティ JXN-26、50 mLおよび250 mLチューブ用)</td><td>ベックマン・コール</td><td>ターB34182</td><td></td></tr>固定<tr><td>角ローター、250用&nbsp;mLボトル(例:、JLA-16.250)</td><td>ベックマン・コール</td><td>ター363930</td><td></td></tr><tr><td>固定角ローター(50用)&nbsp;mLチューブ(例:、JA-25.50)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>363058</td><td></td></tr><tr><td>50 mLチューブ用スイングバケットローター(例:、JS-13.1)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>放射性標識[35S]メチオニン</td><td>パーキン・エルマー</td><td>NEG072002MC</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ網状赤血球溶解物ベースの無細胞翻訳システム(TNT T7 PCR DNA用クイックキット)</td><td>Promega</td><td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>位相差顕微鏡 (例, Nikon Eclipse 80i)</td><td>Nikon</td><td>利用できない</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤 (改良型ノイバウアー BS748 チャンバー)</td><td>Hawksley Technology</td><td>AC1000</td><td>深さ 0.1 mm, 1/400 mm2</td></tr><tr><td>カバー メガネ</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td>22 mm &times; 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm</td></tr><tr><td>1.5 mLマイクロチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL マイクロフュージチューブ</td><td>Starlab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフュージ (e.g., Eppendorf 5415D)</td><td>Eppendorf</td><td>unavailable</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPR-700-310L</td><td></td></tr><tr><td>gluconic acid (potassium salt)</td><td>Fisher</td><td>22932-2500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Σ</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td></td><td>ΣA9187</td><td></td></tr><tr><td>メチオニン</td><td>ΣM6039</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>フィッシャー</td><td>B/P620/44</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>フィッシャー</td><td>S/5200/53</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース&nbsp;</td><td>メルフォード</td><td>B2005</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>メルフォード</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア (例:, Aida Image Analyzer)</td><td>Raytest</td><td>利用不可</td><td></td></tr></tbody></table>

ストレス植物から単離された葉緑体へのタンパク質のインポートの分析

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

葉緑体は、光合成が、多数の他の代謝およびシグナル伝達機能のみならず、植物の多くの重要な役割を持つ細胞小器官です。さらに、葉緑体には、塩分濃度や浸透圧ストレスなどの様々な非生物的ストレスに対する植物の応答のために重要です。葉緑体は、それ自身のゲノムによってコードされているいくつかの〜3,000の異なるタンパク質まで含むことができます。しかし、葉緑体タンパク質の大部分は、核にコードされ、細胞質ゾル中で合成し、これらのタンパク質は、葉緑体エンベロープ膜でtransloconsを通して葉緑体にインポートする必要があります。最近の研究では、葉緑体タンパク質の取り込みを積極的ストレスによって調節することができることを示しています。生化学的ストレス条件下でのタンパク質の取り込みのような調節を調べるために、我々は簡単に任意の実験室で達成することができる迅速かつ簡単な手順としてここで説明された方法を開発しました。この方法では、植物は、通常のconditio下で増殖させその後、ナノ秒と液体培養でのストレス条件にさらさ。植物材料を回収し、葉緑体は、次いで、均質化によって放出されます。粗ホモジネートを、無傷の葉緑体の単離を可能にする、密度勾配遠心分離により分離されます。葉緑体収率は、計数によって評価され、葉緑体完全性を顕微鏡でチェックされます。タンパク質取り込みアッセイのために、精製された葉緑体は、 インビトロ翻訳された前駆体タンパク質に 35 S放射性標識とインキュベートされ、時間経過実験は、ストレス条件下での遺伝子型の間の輸入率の比較を可能にするために行われます。我々は、規制変異体から葉緑体へのタンパク質の取り込みの速度は、特に浸透圧ストレス条件下で変化していることを示し、この方法を用いて生成されたデータを提示します。

3の時点で、例えば葉緑体タンパク質移入実験は、 図1に示されている。PSADは〜23 kDの16の前駆体形態で、私は間質にさらさ光化学の〜18 kDのコンポーネントです。その定常状態レベルは、変異体3での輸入効率の変化を示唆し、ストレス条件下で、WTに対して、SP1突然変異体で上昇しているため、PSADは、インビトロのタンパク質移入アッセイのためにここで選択しました。 SP1タンパク質3 - SP1突然変異体は、葉緑体タンパク質の輸入機械の重要な調節因子の欠陥を運びます。通常の条件下で生育した植物から単離された葉緑体については、SP1とWTの間PSADインポートには明らかな差はなかった（データは示していない）3。しかし、ここで説明する方法を使用すると、浸透圧的から分離された葉緑体にPSADのインポートを評価します明確な差が検出された、植物を強調しました。我々は両方の遺伝子型を持つ時間依存的に成熟タンパク質の形の蓄積を観察しながら、輸入の割合は、我々の以前の結果3と一致している、SP1の葉緑体（ 図1）のためのよりWTの葉緑体で有意に低かった、と明らかにしストレス条件下でPSADの葉緑体の輸入を規制におけるSP1タンパク質の重要な役割。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" /> 図1.プロテインインポートアッセイは、浸透圧ストレス条件下で成長させた植物から単離された葉緑体を使用して実施。葉緑体は、10日齢のWT（COL-0）とのストレス条件下で成長SP1突然変異体シロイヌナズナ植物（200mMのマンニトール）から単離しました2日間。 （A）タンパク質の取り込みは、[35 S] -Metを用いて行きました。pPsaD hionine標識し、SDS-PAGEおよび蛍光イメージングにより分析前に4、8、12分間進行させました。並行して、 インビトロで翻訳されたタンパク質（IVT） で含むpPsaD 10％の入力制御を分析しました。間でそれらの強度は、時間経過（*）の間に変化しなかったので、おそらく切り捨てまたはタンパク質分解翻訳産物に対応する2つのバンドが存在する間pPsaDの前駆体（プレ）と（マット）の成熟形態が示されています。ストレス条件下で生育させたWTおよびSP1植物からの葉緑体への輸入の割合を比較する（B）は 、A内のインポートされた成熟タンパク質に対応するバンドの強度を定量化しました。すべてのデータは、12分後のWT植物から葉緑体でのインポートされたタンパク質の量の割合として表現されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、ストレス下での単離された葉緑体へのタンパク質のインポートを研究するための新しい方法を説明します。この方法は、迅速かつ簡単であり、葉緑体蛋白質の輸入のための異なるストレス条件、及び対応する調節機構の影響を研究するために適用することができます。

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

本手法の全体的な目的は、特にストレスの影響に焦点を当て、核ゲノムにコードされたタンパク質の葉緑体への取り込みを研究することです。この方法は、葉緑体タンパク質の取り込みがどのように制御されているかなど、葉緑体研究分野における重要な疑問の解決に寄与します。この技術の特筆すべき利点は、葉緑体タンパク質の取り込みに対するストレスの影響を評価できることです。この手法はモデル植物である Arabidopsis thaliana での使用に向けて開発されましたが、作物などの他の系に合わせて修正および適応させることが可能です。本手順の実演は、私の研究室のポストドクターである Qihua Ling が行います。まず、付属のテキストプロトコルに従って Arabidopsis 植物を育成してください。その後、植物が8日齢になった時にストレス処理を行います。植物をアガープレートから手で優しく剥がし、ストレス因子を含む滅菌済みの液体MS培地を入れたフラスコに移します。実験の性質によっては、対照としてストレス因子のない同様のフラスコに別の植物を入れる必要がある場合もあります。フラスコの口を滅菌済みホイルで覆い、緩やかに揺らすオービタルシェーカー上でさらに2日間植物を育成させます。まず、50 mL遠心チューブに13 mLのPercoll、13 mLの2倍濃度クロロプラスト分離バッファー、および5 mgのグルタチオンを混ぜ合わせ、連続密度勾配を調製します。その後、混合物を遠心分離します。遠心分離後、勾配を乱さないようチューブを慎重に取り扱い、後で使用するまで氷上に保持します。次に、条件ごとに100 millilitersの葉緑体抽出バッファーを1 literのビーカーに移します。苗を液体培地から取り出すため、ふるいに移します。その後、葉緑体分離緩衝液を含むビーカーにそれらを移します。組織を緩衝液で洗浄して残留している培地を取り除き、次いで緩衝液を100 millilitersの新鮮な分離緩衝液に交換します。最初のホモジナイズ工程では、植物組織を50 milliliterビーカーに手で移し、その際に指の間から以前の緩衝液が流れ落ちるようにしてください。次に、組織ホモジナイザーのプローブを組織に挿入し、1〜2秒間のパルスを2回加えてホモジナイズします。ホモジナイズした試料を、ろ過布2層を通して250 mL遠心チューブにろ過します。最後に、ろ過布を軽く絞って完了します。ろ液を回収し、植物組織を50 mLビーカーに戻します。次に、20 mLの葉緑体単離バッファーをさらに50 mLビーカーに加え、1回目のホモジナイズで使用しなかった残りの組織をすべて加えます。ホモジナイズとろ過の工程をさらに4回繰り返します。混合したホモジネートを4°Cで1,000 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、ペレットを乱さないように注意しながら、直ちに上清を捨てます。チューブを氷上に置き、チューブを穏やかに振ってペレットを残った上清に再懸濁させます。次に、パストールピペットを用いて、受け皿となるチューブの壁面に沿わせながら、ホモジネートをあらかじめ作成した連続密度勾配の上部に静かに転送します。その後、サンプルの入った勾配チューブをスイングバケットローターに入れ、ブレーキをオフにした状態で、4 °C、7,800 ×g で10分間遠心分離します。終了後、勾配内に現れる2本の緑色のバンドを確認します。破砕した葉緑体を含む上層のバンドを廃棄し、パストールピペットを用いて、完全な葉緑体を含む下層のバンドを新しい50 milliliter遠心チューブに移します。次に、25 millilitersのHMSバッファーをチューブに加え、チューブを2回転倒混和して、葉緑体からPercollを洗浄します。その後、チューブをスイングバケットローターに戻し、葉緑体を再ペレット化します。上清を捨て、氷上でチューブを穏やかに攪拌して、残ったバッファーでペレットを再懸濁します。必要に応じてHMSバッファーをさらに100〜300 µL加えますが、サンプルの希釈が進みすぎないようにしてください。再懸濁した葉緑体を氷上で保存します。まず、1.5 mLチューブ内の495 µLのHMS緩衝液に、単離したクロロプラスト5 µLを加えてください。チューブを反転させて、溶液を静かに混合します。次に、血球計数器の計数室の上にカバーガラスを置いてください。希釈した葉緑体懸濁液を40～60 µL、カバーガラスとカウントチャンバーの隙間にゆっくりとピペットで注入します。位相差顕微鏡を用い、20倍の対物レンズで葉緑体を撮影します。完全な葉緑体は円形で明るく見え、周囲に光のハローが観察されます。次に、10倍対物レンズを使用して、10個の大正方形内の葉緑体数を数えます。大正方形1個あたりの葉緑体数の平均が10個から30個の間である必要があります。葉緑体数が少なすぎるか多すぎる場合は、希釈倍率を調整して手順を繰り返してください。適切な範囲内に入ったら、付属のテキストプロトコルに従い、1 mLあたりの葉緑体数を算出します。3つの時間点でタイムコース試験を行う場合は、インポート停止バッファーを130 µLずつ分注したチューブを3本用意し、氷上に置きます。2 mLチューブに、反応バッファーと放射標識した前駆体タンパク質を含むインポート反応液を調製します。テストする条件ごとに1つの反応を行う必要があることに注意してください。タイムポイントあたり約10 million個の葉緑体を使用します。反応チューブを水槽に入れ、制限された光量の下、25 °Cでインキュベートします。葉緑体を再懸濁させるため、時々チューブを軽く弾いてください。タイムコース試験を行うには、取り込みの線形範囲内の必要な時間点において、反応液から130 µL分注します。分注後すぐに、各130 µL分注液を氷冷したインポートストップバッファーが入ったチューブに移し、チューブを軽く叩いて混ぜ合わせ、タイムコースが完了するまでチューブを氷上に置いてください。最後のサンプルを取り出した後、Microfugeを用いてすべてのサンプルを12,000 ×gで30秒間遠心分離します。次に、上清を捨て、ペレットを15 µLの2xタンパク質負荷用バッファーで再懸濁します。その後、ボルテックスでサンプルを混合します。最後に、標準的なSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィー、フルオログラフィー、またはフォスフォーイメージングを用いて、すべてのサンプルと前駆体入力コントロールを分析します。PsaDは光系Iの18 kilodaltonの構成成分であり、23 kilodaltonsのより大きな前駆体として合成されます。成熟した18 kilodaltonの形態へのプロセシングは、葉緑体への取り込みが起こったことを示しています。本研究で用いたシロイヌナクサのsp1変異体は、葉緑体タンパク質輸送装置の重要な調節因子であるsp1タンパク質に欠損を有しています。ストレス条件下では、野生型と比較してsp1変異体の葉緑体へのPsaDタンパク質の輸送量が増加しますが、通常の非ストレス条件下ではこの現象は見られません。成熟型のPsaDタンパク質は、いずれの植物ジェノタイプ由来の葉緑体においても時間依存的に蓄積しましたが、その輸送速度は野生型の葉緑体よりもsp1変異体の葉緑体で有意に高い結果となりました。これらの結果は、ストレス条件下における葉緑体タンパク質導入の調節において、sp1タンパク質が重要な役割を果たしていることを示唆しています。葉緑体の単離から導入アッセイの完了までの一連の手法に習熟すれば、適切に実施することで5〜6時間で完了させることができます。本手順を行う際は、葉緑体が最大限の活性を維持できるよう、単離のすべてのステップを4 °Cで実施することが重要です。数十年前に最初に開発されて以来、in vitro葉緑体タンパク質導入アッセイは、この分野の研究者が葉緑体タンパク質導入メカニズムの多くの異なる側面を探索するための道を切り拓いてきました。ここで提示する改良法により、ストレス条件下でのタンパク質導入への影響を調査することが可能になります。放射性物質を取り扱う際は、特別な注意が必要であることに留意してください。本手順を実施する際は、常に手袋、ラボコート、および保護メガネの着用などの予防措置を講じてください。

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