Name: 中リコンビナーゼ媒介カセット交換による組換えヒト多能性幹細胞の迅速かつ効率的な生成 AAVS1軌跡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学ぶリコンビナーゼ媒介カセット交換（RMCE）によるヒト多能性幹細胞のAAVS1座標遺伝子編集法。15日間で無作為挿入を排除した同型細胞株を効率的に作成し、遺伝子機能解析やトランスジェネシス研究に有用です。

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L.O.は、IWT/OZM/090838、IACS BPAMER3/08/04、およびアラゴン政府FMI048/08によって資金提供されました。RB by IWTフェローシップSB-121396;FWO 1288714NによるMP。オランダ糖尿病財団によるR.S.N.H.、J.V.、K.C.、Q.C.は、それぞれIWTフェローシップSB-121396、SB-101230、SB-91228、SB-093228の支援を受けました。C.M.V.への資金提供は、FWO G.0667.07、G.0975.11、およびKU Leuven(EIW-B4855-EF/05/11、ETH-C1900-PF、EME-C2161-GOA/11/012)、IWT-HEPSTEM、BELSPO-IUAP-DEVREPAIR、FP7-HEMIBIO(266777)から行われました。

トランスフェクションのためのFRT含有HPSCマスター細胞株の作製<ol><li>それぞれのhESCまたは無フィーダーIPSC媒体、（ 表1）を使用して不活性化されたマウス胚線維芽細胞をオンまたはオフに標準的な手順（iMEF）の下で培養したhESC / IPSCマスター細胞株。各実験条件について2（フィーダー上）または6ウェルプレート中hPSCsの1（フィーダーなし）をウェルを準備します。 </li><li>文化を観察し、細胞が60に達したとき - 70％の密集度、プレート薬剤耐性iMEF（iDR4を）。簡単に説明すると、コートに必要な0.1％ゼラチン溶液0.5mlを12ウェルプレートのウェルとを、室温で5分間インキュベートします。 iMEF培地（ 表1）でO / Nをプレートウェルあたり125,000 iDR4sとインキュベートします。 </li></ol>ヌクレオ2. HPSCトランスフェクション<ol><li>翌日、37℃で1時間、10μMのRho関連タンパク質キナーゼ（ROCK）阻害剤（Y-27632）を含む新鮮な培地でのhESC / IPSC培養物を予備インキュベートします。 Nextが、室温に暖かい事前に冷蔵庫からのhESCトランスフェクション溶液を取ります。 </li><li>ヌクレオ条件ごとのヌクレオメッキ培地（ 表1）の1ミリリットルを準備します。室温1mLのPBSで洗浄し、ウェルをオフiMEF培地を取り、中をメッキヌクレオの500μLを追加します。滅菌した1.5mLチューブに他の500μLを移し、メッキまで37℃で保管してください。注：2のpFLPeベクトル：0、2：1、および0：典型的なRMCE実験は、3つの異なるRMCE供与体の分子比の条件が含まれています1。 </li><li>単一細胞懸濁液にしたhESC / IPSCを外します。 <ol><li> 、メディアを脱いRT PBS 2mLでそれを洗って、それぞれ、フィーダまたは無フィーダーHPSC培養に1 mLのトリプシンを0.05％ACCUTASEを追加します。 37℃で5（ACCUTASE）分 - 7（トリプシン）または2インキュベートします。 Accutaseの治療のために - 細胞は緩いが、結合した状態でなければなりません。 </li><li>慎重にインキュベーターからとすることなく、プレートを取り外しllowing細胞は、切り離し吸引により解離剤を除去します。 1ミリリットルのhESCのメディアを加え、穏やかに発泡を避け、板面にメディアをフラッシュすることによって緩い細胞を解離します。細胞は、単一細胞懸濁液中であることを確認します。 </li><li>清潔で滅菌15または50 mLチューブ内の細胞を収集します。 hESC媒体の1 mLで、ウェルを洗浄し、同じ15または50 mLチューブに細胞を収集します。細胞計数器を用いて、（次のステップの間に）計数のために、50μLのアリコートを取ります。コレクションのボリュームを書き留め、総細胞数を計算します。室温で5分間、300×gで細胞をスピンダウン。 </li></ol></li><li> 5 mLの血清学的ピペットと穏やかにピペッティングを使用してPBSで10 6細胞/ mLの懸濁液に細胞ペレットを再懸濁します。発泡は避けてください。きれいにする実験条件（約2×10 6細胞）を、滅菌した15 mLの試験管あたり2 mLのを転送します。 </li><li>遠心分離が、事前に10μLの最大音量でpFLPeプラスミドミックスドナー- RMCEを削減します。 <ol><li>清潔、滅菌した1.5mLチューブにpFLPe（6.5 KB）の2.5μgのを転送します。 pFLPeベクトルにRMCEドナーベクター13の1分子比：2を追加します。たとえば、12 KB RMCEドナーベクターの約10μgの。 </li></ol></li><li>全ての工程で発泡避け、ヌクレオに進みます。 注：一部のHPSCトランスフェクションプロトコルはステップ2.4前に追加iMEF枯渇のステップを適用します。しかし、実際には、iMEFが大幅にトランスフェクション効率を変更しない単一の懸濁液中のマイナーな細胞画分であり、また彼らは非増殖性であるため、それが混入した組換え細胞を作成します。また、生存率を増加させるために、トランスフェクションプロセス中に急速に進行するために不可欠です。これらの理由から、iMEF枯渇は適用されません。 <ol><li>メッキ媒体とiDR4プレートと1.5 mLチューブを削除インキュベーターから。一度に一つの管は、細胞ペレットを乱すことなく、慎重にPBSをオフにピペット。可能な限り削除します。軽くピペッティングすることによりトランスフェクション溶液の100μLでペレットを再懸濁。プラスミドミックスを含む1.5 mLのチューブに細胞懸濁液を移し、穏やかに混合します。 </li><li>気泡を導入しない注意を払って、transfectorキュベットに細胞DNA混合物を転送します。プログラムA13（フィーダー上で培養した細胞）またはF16（フィーダーなし）のヌクレオデバイスでキュベットを導入し、適用します。 注：他のトランスフェクション法またはヌクレオデバイスは、これらのプログラムまたはトランスフェクション条件の最適化を必要とするかもしれません。 </li><li>キュベットを取り戻すと、ヌクレオキットで利用可能な使い捨てのトランスファーピペットを用いて、めっき培地0.5mlを適用し、すべてのボリュームを吸引することにより、その内容を収集します。しかし、穏やかに1動きで、すぐにこの工程を行います。 </li><li>プレート滴下12ワットでiDR4とメディアをメッキの500μLを含むエルプレート。次の実験条件について2.6.4 - を繰り返して、2.6.1を繰り返します。 </li></ol></li><li>インキュベーター内で棚の上に培養皿を置き、均等に細胞懸濁液を配布するために左右にゆっくりと前後に動かし、サイド。細胞は10μMのROCK阻害剤（Y-27632）の存在下で回復できるようにするために次のメディア変更の前に24時間のためにそれをインキュベートします。 </li></ol> 3.ポジティブ及びネガティブ選択細胞の受けRMCE <ol><li>毎日変更培地（/ウェル1 mL）を加え、2から3次元トランスフェクション後には、100 ngのピューロマイシン/ mLの選択を開始します。 注：ポジティブ及びネガティブ選択試薬の最適濃度は、それぞれ新たに生成HPSCマスター細胞株について実験的に決定される必要があります。最小の視覚的毒性が7を後に明らかとなるで低用量（濃度を決定するために、マスター細胞株を使用して、死滅曲線13を実行します選択のDが、文化が生い茂っていない）、最適用量（すべてのセルが選択の7日後に死んで最低濃度）、および高用量（明らかな毒性を引き起こした濃度、2の後にすべての細胞を殺す - 3日）ピューロマイシンおよびFialuridine（FIAU）の両方のために。 <ol><li> hESCの培地を吸引除去します。 PBS 1mLで洗浄します。 100 ngの/ピューロマイシンのmLでのhESC媒体を追加します。 </li></ol></li><li>死と成長がバランスするように、細胞の成長を観察します。ステップ3.1.1以下、毎日ピューロマイシンでメディアを変更します。 250 ngの/ mLでの最大値まで50 ngの/ mLの - 成長率は細胞死を追い越すときは、25のブロック内のピューロマイシン濃度を高めます。 7日間 - 5のためのピューロマイシン選択を続行します。 </li><li> 3 - ピューロマイシン選択を開始した後の4 dは、6日後、トランスフェクションの周りに、0.5μMFIAUで選択を開始します。毎日メディアを変更し、超えない7日間連続のためにFIAUを維持します。 </li></ol> RMCE行の4拡大とキャラクタリゼーション<oL&gt; <li>選択終了後、D14の周り - 15、耐性RMCEのコロニーが存在し、新しいRMCEラインを構成しています。標準的な手順（継代1、P1）は、次の2：1の比で大量に分割します。 </li><li>プレート（オリジナルのマスターセルラインの定期的な培養条件に依存上またはフィーダーオフ、）12ウェルプレートの2ウェルに。さらなる拡大、ストレージ、または実験のセットアップ（これらの手順の追加の説明は、このプロトコルで行われていない）、および特徴付けのための他のいずれかの1つのウェルを使用してください。 </li><li> P1からの細胞を分割する準備ができたら、2.4で説明したように単一細胞懸濁液に特徴づけのために十分に解離し、15 mLの試験管内の細胞を収集します。注：それぞれHPSC WTから使用細胞（なしの遺伝子改変）および陰性および陽性対照としてマスターセルライン、特徴付けのため。 </li><li>室温で5分間、300×gでスピンダウン。 1mlのPBSに再懸濁し、フローサイトメトリーのための2つの試料に分割そしてDNA分析13。 </li><li>分析13（300μL）フローサイトメトリー： <ol><li> 5％の最終濃度までPBS中の細胞にウシ胎児血清を加えます。セルストレーナーできれいFACSチューブに細胞を移し、氷上で保管してください。 注：細胞生存率は、これらの条件で高いので、非生存細胞（ 例えば、7-AADまたはPI）蛍光染色を使用する、可能な限り、必ずしも必要ではありません。 </li><li>細胞分析装置フローサイトメーターで分析に直ちに進んで20,000を記録 - 3万イベントを。分析のために、WT陰性対照試料を用いて、GFPまたはTDTバックグラウンド蛍光の上にゲートを設定します。 </li></ol></li><li> DNA分析13（700μL）： <ol><li>きれいな1.5 mLチューブに細胞を移します。室温で5分間、300×gでスピンダウンし、上清を吸引除去します。市販のキットを用いてDNA抽出に進み、製造元の指示に従ってください。緯度のために-20℃で乾燥したペレットを保存えー分析。 </li></ol></li><li> DNA濃度を測定します。 <ol><li> 25分- 。15、150 Vで1×DNAゲル染色を含む2％アガロースゲル上の図3の条件と表2 13を実行したPCRサンプルに応じて、標準的なPCR反応を準備します。ゲルアナライザで実行を分析します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

セーフハーバーの遺伝子座における遺伝子の編集方法がhPSCsに遺伝子導入を開発するために不可欠なツールのまま。 AAVS1のセーフハーバー文字は最近、いくつかのアプリケーション13,18のために疑問視されてきたが、この遺伝子座は、現在、ヒト由来の細胞株で最もよく特徴付けられたまま。 hPSCsでその限界の意識は、信頼性の高いデータを得るのを助けることができます。したがって、AAVS1はまだgain-および機能喪失研究や決定の遺伝的背景内との間の同質遺伝子コンテキストを必要とする要因の誘導性/構成的発現のために、例えば、有用なサイトであることが期待されます。 AAVS1遺伝子座は、ZFNは、TALENまたはCRISPR / Cas9 1,2,19を使用して、多くのグループが標的とされています。これらのヌクレアーゼが大幅に決定された遺伝子座における相同組換えの効率を高めます。しかしながら、この方法では、画面に、完全にランダムINTEGの自由正確に標的クローンを、特徴づけます飼料および多能性およびゲノムの完全性は、（最適化された遺伝子の編集ツールを使用して）3ヶ月かかることがあります維持する（ 図3）。最後の二つは、オフターゲットヌクレアーゼ活性によって生成された可能性の突然変異によって引き起こされ得ます。ここで使用されるRMCEシステムは、しかし、リコンビナーゼ特異的標的配列がAAVS1座に事前統合されると、わずか2週間で、この目的を達成するために、迅速、効率的、かつエレガントな方法を提供しています。ポジティブ/ネガティブ選択し、適切な選択プログラムの使用は、RMCEによるAAVS1遺伝子座における遺伝子編集の簡素化に寄与する主な要因です。 新しいトランスジェニック系統の遺伝子型の特徴づけは、かなり（ノークローンスクリーニングが必要ありません）減少し、オフターゲットヌクレアーゼ活性に関連した特徴付けが原因でFRTS用FLPeの特異性に不要レンダリングされます。特徴付けも示すことによってルーチンRMCE実験を低減することができますフルカセット交換とランダム統合の欠如は、すでに十分にPCR（ 図2B）によって実証されているので、マスター細胞株（ 図2A）からのGFP発現の完全な喪失、およびサザンブロット13。ポジティブ/ネガティブ選択を使用することは、以前の報告との主な相違点を構成します。以前AAVS1または他の遺伝子座のいずれかで、hPSCsにRMCEを説明したいくつかのグループは、単一の正の選択ステップ7,14,16を採用します。コロニーのスクリーニングも同様にクローンレベルで正確な統合およびランダム組込みが存在しないことを実証するために行わなければならないので、これは、ヌクレアーゼを用いて行わ遺伝子編集上の主要な技術的利点を構成しません。 複数のhESC / IPSCラインでこのRMCEシステムの使用は、それぞれ独立したラインのAAVS1座に記載FRT-含むカセットのプレインテグレーションが必要です。しかし、一度生成、その迅速性とシンプルさは、上記の用途のために定義された同質遺伝子設定で、遺伝子スクリーニングは、そうでなければ、技術的に非常に時間がかかるようになり、半高スループットを開発することが可能となります。また、すべてのRMCEベクターは、ZFNを持つ遺伝子座を標的とするために使用PZ AAVS1遺伝子ターゲッティングベクター内に構築されていますが、TALENsまたはCRISPR / Cas9も報告されました。 RMCEベクトルの二重性は、FRTの有無にかかわらずhPSCsで決定された導入遺伝子のための複数の行を生成するのに非常に有用です。例えば、一つのヒットは、理想的には、結果を確認するために、複数のHPSC株で試験する必要があるRMCEによって行わ決定遺伝子スクリーニングに成功が実証されました。複数RMCEに適したマスター細胞株の非存在下では、ヌクレアーゼを用いて、ヒットの標的の直接遺伝子を行うことができました。 RMCEベクトルの二重人格の有用性は、私たちのグループ20によって証明されています。本研究では、遺伝子補正は患者由来で行いました前頭側頭型認知症（FTD） プログラ （PGRN）の発現欠損を引き起こす突然変異を負う性IPSC。 PGRNレベルを回復したカセットのAAVS1遺伝子座でのZFN媒介挿入による遺伝子相補性は、突然変異の存在に関連したcorticogenesisに欠陥表現型を修正しました。加えて、同程度の線は、外因性PGRN発現のためのコントロールとして使用するWTのヒトES細胞においてRMCEによって生成されました。 組換えコロニーが存在しない場合には、RMCEドナーベクターのトランスフェクション効率を確認してください。 30％よりも優れたトランスフェクション効率は、上記に示した結果が得られます。低いトランスフェクション効率は、再結合効率を低下させます。最後に、RMCEシステムはAAVS1遺伝子座で生成されたが、それは、他の遺伝子座にも適用可能です。

ターゲットを絞ったゲノム組換えは、研究の多くの分野の急速な進歩を促進してきました。マウスでは、ゲノムの編集や幹細胞研究の相乗効果は、遺伝子機能および遺伝子調節の複雑な機構の増加理解を可能にしました。ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）の第1の分離、およびそれ以降の人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）以来、長年にわたり、遺伝子編集は、技術的なハードルを構成しているが、このような進歩は、同様にヒト多能性幹細胞（hPSCs）に期待されています。対象となるヌクレアーゼ - ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはクラスタ化された定期的interspaced短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）を使用して、ゲノム工学における最近の進歩は、私たちはこれらを克服することができました3 -標的組換え効率的なプロセス1を作る難しさ、。 メートル内の特定の遺伝子座Rosa26、HPRT1、またはCOL1A1のような副作用の不在下で、安定した信頼性の高い、ユビキタス導入遺伝子の発現を可能にするウーズゲノムは、遺伝学的研究のパフォーマンスに不可欠なツールとなっています。セーフハーバーの遺伝子座は、同質遺伝子の文脈におけるマウスの異なる系統間で比較分析を可能にします。これは、挿入突然変異誘発は、用量依存的な効果、または多彩な導入遺伝子の発現のようなよく知られた制限に関連付けられている標準的なランダムな統合方法を用いて達成することができません。セーフハーバーの遺伝子座における遺伝子編集しやすさと柔軟性は、具体的には（それぞれ、loxP配列またはFRT）標的配列を認識し、同一のターゲット間の効率的な組み換えを触媒するのCreまたはフリッパーゼ（FLPe）などの部位特異的な標的にリコンビナーゼの使用によって増加されます。これらの特性に、事前統合セーフハーバー座でのloxPまたはFRT配列を用いてリコンビナーゼ媒介遺伝子編集は、トランスマウスで使用される一般的なツールです。起源。同一の標的配列との間の媒介カセット挿入または切除することに加えて、非相溶性のloxPまたはFRT部位の使用は、リコンビナーゼ媒介カセット交換を可能にする（RMCE）4。 人間では、実施されたセーフハーバー遺伝子座を識別しようとします。マウスオルソロガスHPRTは、機能喪失レッシュ・ナイハン症候群、およびROSA26との関連にもかかわらずはhPSCsに標的にされてきた。HPRTが急速にROSA26のように、ESCに導入遺伝子の発現をサイレンシングし、することが報告された、中に導入遺伝子の発現を維持する能力7 -最終的に分化した細胞は5を調査しませんでした。 CCR5遺伝子のホモ接合ヌル突然変異がヒトにおいて十分に許容されると思われるので、安全な港としての価値を評価した。CCR5を標的としたESC 8,9を含む様々なヒト細胞株に安定した導入遺伝子の発現を維持することが報告されました。しかしながら、後者は長期培養中にクローンレベルで証明されていなかった、とユビキタス導入遺伝子発現は、3つの胚葉の分化した子孫で実証されていませんでした。AAVS1、アデノ随伴ウイルス2型（AAV）の自然な統合部位を、試験しましたなぜなら10をサイレンシングトランスジーンに報告耐性の、ヒトES細胞でも同様。それ以降、多くのグループは、 インビトロおよびインビボ 2,8,11,12 の両方で 、すべての3つの胚葉のそれらの分化した子孫にAAVS1遺伝子座を用いて、未分化hPSCsに安定な導入遺伝子発現を記載し、ならびに。 AAVS1遺伝子座は、未分化ヒトES細胞及び肝細胞の子孫13のin vitroでの変数の導入遺伝子の阻害を発揮することが判明したとして、最近の結果にもかかわらず、これらの知見をニュアンス。 GENOを見つけることを目的とした単一コピーの組込みを決定するために、ランダムな統合アプローチおよび方法を使用して追加のスクリーニング研究hPSCsの拡大と分化14,15の間に導入遺伝子サイレンシングに耐性マイク組込み部位。全体的に、今まで、何のゲノム部位は完全にhPSCsとその子孫に安全な港として確認されていません。ユビキタス安定した導入遺伝子発現、hPSCsでなく、in vitroおよびin vivoでその区別子孫ではないだけのための適切な部位の同定は、解決されないままです。すべての研究の遺伝子座の中およびその限界にもかかわらず、AAVS1は残る最高の特徴と幹細胞研究に最もよく使用さ。 RMCEが成功裏FLPeがCreを17よりも効率的である兆候があっても、主にCreリコンビナーゼを用いて、これらの遺伝子座6,7,14,16の一部でhPSCsで行われています。これら全ての場合において、一つの正薬物耐性カセットは、組換えコロニーの選択のために使用しました。成功しているが、これらの手順は、標準的な遺伝子 - 以上の技術的進歩を構成するものではありません。ZFNを使用して編集手順、TALENsまたはCRISPR / Cas9は、単一の抗生物質選択の手順として、ランダムな統合を排除し、正確に標的クローンを同定するためにコロニースクリーニングを必要としません。 この手順では、我々は（事前統合カセット内）で±15日間でポリクローナルトランスジェニック株の生成を可能にする選択を（着信カセット内に）正の組み合わせを使用してAAVS1座にhPSCsにRMCEを実行する方法を説明し、負100％効率とランダム組込み事象の自由。したがって、この方法は、hPSCsに現在記載RMCE技術を超えた進歩を表しています。

<table><tbody><tr><td>DR4 マウス胚性線維芽細胞 (MEF)</td><td>AMS bio</td><td>GSC-6204G</td><td>hPSC フィーダでの培養</td></tr><tr><td>CF-1 MEF、マイトマイシン-C 処理</td><td>AMS Bio</td><td>GSC-6001M</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% ゼラチン溶液</td><td>ミリポア</td><td>ES-006-B</td><td>iMEF めっき</td></tr><tr><td>DMEM/F-12、HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清置換 </td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8540</td><td>hESC培地</td></tr>用 <tr><td>L-グルタミン、200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>iMEF培地</td></tr><tr><td>用 2-メルカプトエタノール、50&nbsp;mM</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Human basic FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18C</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 in Solution</td><td>VWR</td><td>688001-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Gibco</td><td>41965-039&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>フィーダー上のhPSC培養</td></tr><tr><td>Matrigel、hESC認定</td><td>VWR</td><td>734-1440</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 完全培地キット</td><td>幹細胞技術</td><td>05850</td><td>フィーダーフリー培養</td></tr><tr><td>用 StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>フィーダーフリー培養用</td></tr><tr><td>Y-27632 溶液</td>中 <td>VWR</td><td>56726</td><td></td></tr><tr><td>ヒト幹細胞ヌクレオフェクターキット 2</td><td>ロンザ</td><td>VVPH-5022</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン二塩酸塩</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>FIAU (フィアルウリジン)</td> <td>ABX</td><td>2910</td><td></td></tr><tr><td>ハイグロマイシン B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3274</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) から pFLPe</td><td></td><td></td><td></td> に改変され、ピューロマイシン</tr><tr><td>RMCE ドナー</td>を除去 <td>-</td><td>-</td> <td>pZ ドナーから改変 AAVS1 puromycin ベクター (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13</td></tr><tr><td>5 mL 丸底ポリスチレン試験管、Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA kit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>K182001</tr><tr><td>GoTaq Flexi DNAポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Device</td><td>Lonza (Amaxa)</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-100</td><td>Chemometec</td><td>NC-100</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Canto</td><td>BDバイオサイエンス337175</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオカセット</td><td>ケモメテック</td><td>941-0002</td><td></td></tr></tbody></table>

中リコンビナーゼ媒介カセット交換による組換えヒト多能性幹細胞の迅速かつ効率的な生成<em&gt; aavs1</em&gt;軌跡

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

でもCRISPR-Cas9率いる遺伝子ターゲッティング技術の革命で、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）の遺伝的改変は、まだ時間がかかります。セーフハーバーの遺伝子座に組み込まれた導入遺伝子を有する組換え回線を使用する比較研究は、より迅速かつオフターゲット効果を受けにくくしているのCreまたはFLPeなどの部位特異的な標的にリコンビナーゼを、使用するアプローチから利益を得ることができます。彼らはほとんどの側面にターゲッティング大幅にアウトパフォーム遺伝子をしませんが、このような方法は、記載されています。ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、我々は以前に異FRT配列に挟まれたGFP-ハイグロマイシン-TKを発現カセットを含むhPSCsのAAVS1遺伝子座におけるマスターセルラインを、作成しました。ここでは、このラインを使用してFLPeリコンビナーゼ媒介カセット交換（RMCE）を実行する手順について説明します。マスタCエルラインは、プロモーターピューロマイシン耐性を含み、FLPeリコンビナーゼとRMCEドナーベクター、トランスフェクトされます。両方（ピューロマイシン）正と負（FIAU）選択プログラムの適用はランダム統合することなく、RMCEの選択につながります。 RMCEは、100％の効率で15（d）に完全に特徴付けられた多能性ポリクローナルトランスジェニック系統を生成します。関わらず、最近AAVS1遺伝子座の限界を説明し、システムの使いやすさは、同質遺伝子設定でHPSCの遺伝子導入のための道を開く比較研究のために必要であり、そうでなければそのあろう機能解析のゲイン/損失のためのセミハイスループット遺伝子スクリーニングを可能にします非常に時間がかかること。

AAVS1特異ZNFsを使用して、異FRT標的配列を含む完全に特徴付けられたhESC / IPSCマスター細胞株が生成され、13に記載されました。 FRT含有マスター細胞株は、ZFN処理後多能性ゲノムの完全性を維持し、安定して、in vitroおよびin vivoで GFPを発現しました。 RMCEはFLPeリコンビナーゼとRMCEドナーベクター（ 図1A）を有するマスター細胞株の共トランスフェクションすることによって行われます。 RMCEベクターは、導入遺伝子に隣接するAAVS1マスター細胞株におけるものと同一のFRT配列を含む図1Bは、恒常的に発現TDT PZを使用してRMCE監視します。。F3-P CAGGS tdTPH-Fは、トランスフェクションの後、HPSCが均等に分散細胞の小グループを形成しiDR4 MEF層、及びHPSCをトランスフェクトは、GFPだけでなく、過渡TDT（ 図1B、D 2）の両方を発現します。 3 - 細胞を2回復させます選択を開始する前に、D、トランスフェクション後。正の選択最初のRMCEドナー挿入を有利にするために、ピューロマイシンの低用量を使用して開始されます。初期の大量の細胞死がプロセスを生き残るために彼らができなくなって、再結合を受ける単一細胞につながる可能性があるため、ピューロマイシンは、開始時に静かに適用されます。次の日には、ピューロマイシン濃度はnonrecombined細胞が徐々に死滅する組換え細胞は、小さなコロニーに成長することを可能にするために最適な用量まで段階的に上昇させる必要があります。 3から4 D（D 6トランスフェクション後の周りの）正の選択を開始した後、負の選択は、FRT媒介組換え事象のためにのみ選択するために開始されます。 RMCEは、チミジンキナーゼ（TK）自殺遺伝子の喪失、したがってFialuridine（FIAU）に対する感受性を生じさせます。 4 GFP - - / TDT +（RMCE）細胞されている中2の小さなクラスター、この時点で適用される負の選択、このようなイベントでは、AAVS1遺伝子座におけるTkの遺伝子が影響を受けないままであるためFIAU（ 図1B、D 6）の最適な濃度に耐えることができ、ランダムな組込みを防ぐことができます。キャラクタリゼーション（ 図2B）の間に、後にランダム組込み事象が存在しないことによって実証されるように同時FRT媒介とランダム統合の発生が、可能性はほとんどありません。 混合RMCEのGFP - 10トランスフェクション後、いくつかの完全に選択されていない混合RMCEコロニーが（ 図1B）見つけることができます- D 9によってように、より均質なりながら/ TDT +コロニーは、成長を続けています。 RMCEがFLPeの非存在下では発生しませんが、使用されている：（1 2） - GFP / TDT + RMCEコロニーはRMCEドナーとFLPeの両方が存在する場合のみです（2：0）。 13日目までFIAUとの完全な選択- / TDT + cultur - 15トランスフェクション後、均質なGFPを生じさせます電子。 RMCEは、15日13で12.8±6.8（n = 6）がプーロR / FIAU Rコロニーの平均が得られます。 / TDT +表現型（ 図2A） -新規に生成されたRMCEライン（非クローン細胞集団で組み合わせプーロR / FIAU Rの RMCEコロニー）の特性フローサイトメトリーは、100％の細胞がRMCE GFP提示することを確認します。蛍光レポーターの構成的発現せずRMCEドナーが使用される場合、結果として得られるプーロR / FIAU R RMCE HPSCラインが均一にGFPであります- 。 非クローンRMCEラインのPCRの特徴付けは、完全なカセット交換（検出することができるマスター細胞株のカセットの痕跡）を示し、使用される選択プログラムは、RMCE供与体との両方FLPe発現（ランダムな組込みフリーラインを生成することベクトル）（ 図2B）。これらの結果は、さらにsが証明されましたouthernブロットとは、加えて、我々は、RMCE線が多能13ままであることを実証しました。これは、もはや必要なルーチンRMCEの実験中にランダムな組込みのゲノムワイドな評価や多能性試験のいずれかを実行するために行うものではありません。要約すると、このプロトコルを使用して、ランダムな組込みの自由AAVS1遺伝子座におけるHPSCトランスジェニック細胞株は、容易に100％の効率で15 Dおよび広範な特徴付けを必要とせずに生成することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54718/54718fig1.jpg" /> 図1：RMCE の概要図 RMCE選択プログラムの（A）のタイムライン。左：マスターセルライン（MCL）、FRTが側面にカセットを保有する（三角形）GFPおよび（2Aの自己切断ペプチドによってリンクされている）ハイグロ-TKを発現し、FLPe発現ベクターでヌクレオ（NF）によってトランスフェクトされ、 RMCEドナーベクター、WH可変実験カセット（X） - ICHは、プロモーターピューロマイシン耐性遺伝子（SA-プーロRスプライシングアクセプター）が含まれています。右：新しいRMCEライン（RMCEL）ピューロマイシン（赤い三角形）およびFIAU（青線）との選択が完了した後に得られました。 （B）RMCE構成TDT発現ドナーとドナーDNAの異なる比を使用しFLPe DNA（0：1,2：1,2：0）（GFP赤色蛍光- -緑色蛍光、TDT）蛍光顕微鏡によってモニター別に時間点。 D 2と6：スケールバーは100μmで表します。 D 10：スケールバーは200μmで表す。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54718/54718fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54718/54718fig2.jpg" /> 図2：RMCE ラインの特性によりRMCEの（A）決意。フローサイトメトリー。 GFPおよびTDTの発現は、構成TDT発現ベクター（CAGGS TDT）を用いてD 15ポストヌクレオでWTライン、マスター細胞株（MCL）、及び新たに生成されたRMCEラインのために示されている、またはグースコイドプロモーターにより駆動されるGFPとドナー（GSCP GFP、胚体内胚葉マーカー）またはAATプロモーター （APOeAATp GFP、肝細胞のマーカー）。 RMCEの（B）確認（5 &#39;/ 3&#39; JA RMCEL）、マスターセルラインの（MCL）カセット（5 &#39;/ 3&#39; JA MCL）、およびランダム統合の欠如が存在しない（5 &#39;/ 3&#39; / FLPe RI ）PCRによって示されたプライマー対を用いて。 WT、MCLからのDNA、RMCEライン（1から5）、ドナーRMCEベクトル（+ RI）、FLPe発現するベクター、および鋳型なしコントロール（NTC）を使用しました。 （Ordovas ら 、2015）から変更された図13。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54718/54718fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ページ内= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54718/54718fig3.jpg" /> 。AAVS1左でRMCEとターゲティング図3. RMCEに適したマスター細胞株の生成と遺伝子の比較 ：遺伝子ターゲッティングは、マスター細胞株の生成のために、図1Aに記載のドナー（カセットで同時トランスフェクトされた改変されていないWT細胞を使用しています、MCL）および特定の最適化のZFN。完全な特性を完了するためのプロセスは、3ヶ月までかかります。右：RMCEはFLPeベクターによるドナーの共トランスフェクションすることにより行われ、かつ完全に特徴付けラインが15（d）に生成されます。 AAVS1における遺伝子ターゲッティング効率は、以前の研究1,2からである。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54718/54718fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> AYS &quot;&gt; <tbody><tr><td> メディア </td><td> コンポーネント </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td rowspan="7">ヒトES細胞培地</td><td> DMEM-F12、HEPES </td><td> 80％ </td></tr><tr><td>血清代替培地</td><td> 20％ </td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td> 146 mg / mlで</td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸溶液（100倍） </td><td> 1倍</td></tr><tr><td> 2-メルカプトエタノール</td><td> 0.1 mMの</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> 0.1％ </td></tr><tr><td>ヒト塩基性FGF </td><td> 4 ngの/ mLの</td></tr><tr><td rowspan="6"> iMEF培地</td><td> DMEM高グルコース</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td> 15％ </td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> 0.1％ </td></tr><tr><td> L-グルタミン200mMの</td><td> 4 mMの</td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸酸溶液（100倍） </td><td> 2倍</td></tr><tr><td> 2-メルカプトエタノール</td><td> 0.1 mMの</td></tr><tr><td rowspan="2">メッキ培地</td><td>ヒトES細胞培地</td><td> 100％ </td></tr><tr><td> ROCK阻害剤（Y-27632） </td><td> 10μM </td></tr></tbody></table> 表1培地組成物。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 検定 </td><td colspan="2"> フォワード </td><td colspan="2"> 逆 </td><td> 単位複製配列 </td><td> PCRサイクル </td></tr><tr><td> 5&#39;JA MCL </td><td colspan="2"> CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC </td><td colspan="2"> CGTTACTATGGGAACATACGTCA </td><td> 1.1 KB </td><td> 95ºC、5 &#39; - [95ºC、30&#39; &#39; - 68ºC（-0.5ºC/サイクル）、1&#39; 30 &#39;&#39;] X15 - [95ºC、30 &#39;&#39; - 58ºC、30 &#39;&#39; - 72ºC、1 &#39;30&#39; &#39;] X25 - 72ºC、5&#39; </td></tr><tr><td> 3&#39;JA MCL </td><td colspan="2"> TAACTGAAACACGGAAGGAG </td><td colspan="2"> AAGGCAGCCTGGTAGACA </td><td> 1.4 KB </td><td> 95ºC、5 &#39; - [95ºC、30&#39; &#39; - 68ºC（-0.5ºC/サイクル）、1&#39; 30 &#39;&#39;] X15 - [95ºC、30 &#39;&#39; - 58ºC、30 &#39;&#39; - 72ºC、 1 &#39;30&#39; &#39;] X25 - 72ºC、5&#39; </td></tr><tr><td> 5&#39;JA RMCEL </td><td colspan="2"> CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC </td><td colspan="2"> CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC </td><td> 1.1 KB </td><td> 95ºC、5 &#39; - [95ºC、30&#39; &#39; - 68ºC（-0.5ºC/サイクル）、1&#39; 30 &#39;&#39;] X15 - [95ºC、30 &#39;&#39; - 58ºC、30 &#39;&#39; -72ºC、1 &#39;30&#39; &#39;] X25 - 72ºC、5&#39; </td></tr><tr><td> 3&#39;JA RMCEL </td><td colspan="2"> TTCACTGCATTCTAGTTGTGG </td><td colspan="2"> AAGGCAGCCTGGTAGACA </td><td> 1.5 KB </td><td> 95ºC、5 &#39; - [95ºC、30&#39; &#39; - 68ºC（-0.5ºC/サイクル）、1&#39; 30 &#39;&#39;] X15 - [95ºC、30 &#39;&#39; - 58ºC、30 &#39;&#39; - 72ºC、 1 &#39;30&#39; &#39;] X25 - 72ºC、5&#39; </td></tr><tr><td> 5&#39;RIドナー</td><td colspan="2"> GTACTTTGGGGTTGTCCAG </td><td colspan="2"> TTGTAAAACGACGGCCAG </td><td> 0.5 KB </td><td> 95ºC、5 &#39; - [95ºC、30&#39; &#39; - 60ºC、30&#39; &#39; - 72ºC、30&#39; &#39;] X25 - 72ºC、5&#39; </td></tr><tr><td> 3&#39;RIドナー</td><td colspan="2"> CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC </td><td colspan="2"> ACACAGGAAACAGCTATGAC </td><td> 0.5 KB </td><tD&gt; 95ºC、5 &#39; - [95ºC、30&#39; &#39; - 60ºC、30&#39; &#39; - 72ºC、30&#39; &#39;] X25 - 72ºC、5&#39; </td></tr><tr><td> RI FLPe </td><td colspan="2"> CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG </td><td colspan="2"> GTATGCTTCCTTCAGCACTAC </td><td> 0.65 KB </td><td> 95ºC、5 &#39; - [95ºC、30&#39; &#39; - 60ºC、30&#39; &#39; - 72ºC、30&#39; &#39;] X25 - 72ºC、5&#39; </td></tr></tbody></table> PCRジェノタイピング。Ordovas ら、2015年13から変更されたために使用される表2のプライマーセット 。

ここでは、以前に記載されたシステムを改良するヒト多能性幹細胞（hPSCs）のAAVS1座にRMCEに基づいて、迅速かつ効率的な遺伝子編集方法を報告しています。この技術を用いて、同質遺伝子系統を迅速かつ確実にhPSCsで形質転換媒介性の研究を容易に、適切な比較試験のために生成することができます。

中リコンビナーゼ媒介カセット交換による組換えヒト多能性幹細胞の迅速かつ効率的な生成<em&gt; AAVS1</em&gt;軌跡

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

この手順の全体的な目的は、フリッパーゼを用いたリコンビナーゼ媒介カセット交換（RMCE）法を用いて、ヒト多能性幹細胞（human PSCs）のAAVS1において、迅速かつ効率的な標的ゲノム編集を行うことです。RMCEはAAVS1遺伝子座への配列の標的挿入を改善します。これは、過剰発現またはノックダウンによって分子の機能を迅速に検証できるため、幹細胞生物学において非常に重要です。この手法の主な利点は、ランダムな組み込みがなく、多能性を維持し、かつ正常な核型を持つヒトPSCラインを、わずか15日間で作成できることです。この手法は、AAVS1遺伝子座における外来遺伝子導入のための有用なツールとなりますが、その他のヒトの許容性遺伝子座にも適用可能です。まず、ヒトPSCマスター細胞株を、不活性化マウス胚性線維芽細胞（iMEF）上または非iMEF条件下で、標準的な手順に従って6ウェルプレートで培養します。細胞のコンフルエンシーが60%から70%に達したら、まず0.1%ゼラチン溶液を用いて12ウェルプレートの必要なウェルをコートし、室温で5分間インキュベートして、薬剤耐性iMEFを播種します。次に、1ウェルあたり125,000個のiDR4を播種し、iMEF培地を用いて一晩培養します。翌日、10 micromolarのROCK Inhibitorを含む新鮮な培地を用いて、ヒトPSC培養物を37 degrees Celsiusで1時間プリインキュベートします。その間に、ヒトESCトランスフェクション溶液と細胞解離剤を室温に戻しておきます。ニュークレフェクションの条件ごとに、1 mLのニュークレフェクション用播種培地を調製します。次に、ウェルからiDR4培地を除去し、室温のPBS 1 mLを用いて細胞を洗浄した後、ニュークレフェクション用播種培地を添加します。播種培地をサンプルあたり500 µLずつ滅菌済みの1.5 mLチューブに移し、播種まで37 °Cで保存します。ヒトPSCを単一細胞懸濁液として回収するため、培地を除去し、室温のPBSで細胞を洗浄した後、フィーダー存在下またはフィーダーフリーのhPSC培養に応じて、0.05% TrypsinまたはAccutaseを1 mL添加します。培養物を37 °Cでインキュベートします。次に、インキュベーターからプレートを慎重に取り出し、細胞が剥離しないように注意しながら、解離剤を吸引除去し、1 mLのヒトPSC培地を添加します。泡が発生しないように注意しながら、プレート表面に培地を穏やかに注入して、剥離した細胞を分散させます。細胞を清潔で滅菌済みの15または50 milliliterチューブに回収し、単一細胞懸濁液にします。その後、1 milliliterのhESC mediumを用いて細胞を洗浄し、同じチューブに回収します。細胞懸濁液から50 µLを分注して細胞数を計測し、残りの細胞を室温で300 ×g、5分間遠心分離する。遠心分離を行っている間に、細胞計数装置を用いて細胞数を計測する。上清を除去し、室温のPBSを用いて細胞ペレットを緩やかに再懸濁し、細胞濃度を10⁶ cells/mLに調整する。次に、実験条件ごとに2 mLずつ清潔な滅菌済みの15 mLチューブに移し、遠心分離を繰り返します。サンプルの遠心処理中に、flippaseプラスミドを2.5 µg使用し、ドナーflippaseの分子比を0:1、2:1、2:0としたプラスミドミックスを、3本の清潔な1.5 mLチューブで調製します。ヌクレオフェクションに進むため、iDR4プレートと播種培体が入った1.5 mLチューブをインキュベーターから取り出します。ペレットを乱さないように注意しながら、1本ずつチューブからPBSを慎重にピペットで吸い出し、可能な限りバッファーを除去します。100 µLのトランスフェクション溶液を用いて、緩やかにピペッティングしてペレットを再懸濁します。その後、細胞懸濁液をプラスミドミックスを含む1.5 mLチューブに移し、静かに混合します。気泡が入らないように注意しながら、細胞DNA混合液をトランスフェクターキュベットに移します。キュベットをニュークレオフェクター装置に挿入し、フィーダー上で培養した細胞の場合はプログラムA13を、フィーダーフリーでトランスフェクションを行う場合はプログラムF16を実行します。キュベットを取り出し、キット付属の使い捨て転送ピペットを使用して、0.5 millilitersの播種用培地をキュベットにゆっくりと、しかし素早く一度の動作で加えます。次に、同様の方法で液量を回収し、iDR4と播種用培地を入れた12ウェルプレートに滴下して播種します。培養皿をインキュベーター内の棚に置き、ゆっくりと前後左右に動かして細胞懸濁液を均一に分散させます。培地を交換する前に、24時間培養します。トランスフェクションの2〜3日後に、セレクションを開始します。培地を吸引し、1 milliliterのPBSを用いて細胞を洗浄した後、100 nanograms per milliliterのピューロマイシンを含むヒトESC培地を添加します。細胞の増殖を観察し、ピューロマイシンの濃度を最大250 nanograms per milliliterまで適宜上げながら、7日間ピューロマイシンセレクションを継続します。ピューロマイシンによる選択を3〜4日間行った後、0.5 µMのフィアルリジン（FIAU）による選択を開始します。培地を毎日交換し、FIAUによる選択を連続して7日を超えない範囲で維持します。選択完了後の14〜15日目頃には、RMCE耐性コロニーが出現し、これが新しいRMCEラインとなります。標準的な手順に従い、細胞を1:2の比率で継代します。Key 1のウェルが継代のタイミングになったら、ビデオの前半で説明した方法で、特性解析用のウェルを単一細胞懸濁液に解離させ、15 mLチューブに回収します。室温で300 ×g、5分間遠心分離して細胞を回収します。次に、1 mLのPBSを用いて細胞を再懸濁し、サンプルを2つに分けます。一方のサンプルはセルストレーナーでろ過してフローサイトメトリーに供し、もう一方はテキストプロトコルに従ってDNA解析に使用します。flippase recombinaseおよびtdT RMCEドナーによるトランスフェクション後、hPSCはiDR4 MEF層上に均等に分布した小さな細胞集団を形成し、構成的GFPおよび一過性tdTを発現しました。ピューロマイシンを用いたポジティブセレクションによりRMCEドナーの挿入を促進し、次にFIAUを用いたネガティブセレクションを行うことで、TKを欠損したFRT介在性組み換えイベントのみを選別します。トランスフェクションから約6日後、RMCE GFP陰性かつtdT陽性の細胞が小さなクラスターとして確認できます。ここで示されるように、GFP陰性かつtdT陽性のRMCEコロニーは、RMCEドナーとフリッパーゼの両方が使用された場合にのみ出現し、フリッパーゼが存在しない場合にはRMCEは起こりません。ピューロマイシンおよびFIAU耐性を持つRMCEコロニーを非クローナル細胞集団として合わせて統合し、新たに作製したRMCEラインをフローサイトメトリーで解析した結果、100%の細胞がRMCE GFP陰性およびtdT陽性の表現型を示すことが確認されました。hPSCにおいてレコーダー活性を持たないRMCEドナーを使用した場合、細胞の100%がGFP陰性となります。ここに示す非クローンのRMCE株のPCR特性解析により、カセット全体が置換されていること、および使用した選別プログラムによってRMCEドナーとフリッパーゼ発現ベクターの両方がランダム統合されていない株が生成されることが示されています。要約すると、このRMCE法は、標的ヌクレアーゼと比較して、特定の遺伝子座におけるhPSCの遺伝子編集を大幅に簡略化します。この手法を習得すれば、15日で完了させることができます。したがって、RMCEは非常に迅速な遺伝子編集ツールであり、アイソジェニックな設定での比較研究を可能にします。この手順を用いる際は、トランスフェクション効率を30%以上にすること、および適切なコアストレージ選択剤を使用することが重要です。このビデオを視聴することで、ヒトPSCのAAVS1遺伝子座においてRMCEを実施する方法と、組換え細胞株を特性解析する方法について十分に理解できるはずです。

rapid-efficient-generation-recombinant-human-pluripotent-stem-cells

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中リコンビナーゼ媒介カセット交換による組換えヒト多能性幹細胞の迅速かつ効率的な生成

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