リバーシブルジスルフィド架橋ミセルの生産のための簡便かつ効率的なアプローチ
2016年12月23日
高い特異性で副作用を軽減して腫瘍部位に抗がん剤を送達するためには、ナノ粒子に基づく新しい方法が必要です。ここでは、過酸化水素を介した酸化によって容易に調製でき、還元腫瘍環境下で効率的に解離してペイロードを放出できるジスルフィド架橋ミセルについて説明します。
この手順の全体的な目標は、標的薬物送達のために薬物をロードしたジスルフィド架橋ミセルを合成するためのシンプルで効果的なプロトコルを提供することです。この方法は、ナノメディシン分野の質問に答えるのに役立ちます。例えば、安定したナノ製剤を効果的に製造する方法など。
この技術の主な利点は、ジスルフィド架橋ミセルを大規模に容易に合成できることであり、これは患者の臨床研究に非常に望ましいものです。この手順を開始するには、丸底フラスコに2グラムのモノメチル末端ポリエチレングリコールモノアミンを追加します。.無水DMFを10ミリリットル加えて溶解します。
氷の上で冷やします。ヒドロキシベンゾトリアゾール3等量、DIC3等量、およびジ-eth-moc保護リジン3等量を丸底フラスコに加えます。次に、10ミリリットルの無水DMFを追加します。
混合物を磁気攪拌板で20分間攪拌します。次に、モノメチル末端ポリエチレングリコールを含む丸底フラスコに混合物を追加します。丸い底のフラスコを氷浴から取り出し、室温で一晩かき混ぜます。
攪拌が完了したら、テキストプロトコルに詳述されているように、反応の完了を確認します。反応フラスコに200ミリリットルの氷冷エーテルを加えます。6, 000 x gで摂氏4度で6分間遠心分離し、沈殿したポリマーを分離します。
沈殿と遠心分離のプロセスを2回繰り返し、沈殿する前に毎回製品を10ミリリットルのDMFに再溶解します。次に、ポリマーを氷冷エーテルで3回洗浄します。チューブを高真空源に接続して、残留エーテルを除去します。
この後、DMF中の20ミリリットルの20%4-メチルピペリジンをポリマーに加えます。溶解が完了するまで攪拌します。3時間、反応を楽しませてください。
反応の完了を確認したら、高分子生成物を乾燥させます。次に、真空下でポリマー中間体番号2を行い、テキストプロトコルに概説されているように追加のポリマー合成ステップを実行します。ポリマー中間体10番が生成されたら、それを反応フラスコに移します。
無水DMFを30ミリリットル加えます。新しいフラスコに24相当の活性コール酸を20ミリリットルのDMFに溶解します。次に、48当量のN、N-ジイソプロピルエチルアミンを追加します。
10分間かき混ぜます。攪拌が完了した後、混合物をポリマー中間体番号10を含む反応フラスコに移します。反応が一晩中実行されるのを待ちます。
翌日、反応の完了を確認し、テキストプロトコルに概説されているように、ポリマー中間体番号11を沈殿させます。次に、脱イオン水中でポリマー中間体をダイヤルします。サンプルを凍結乾燥して白い粉末を生成します。
ミセルを調製した後、20ミリグラムのテロデンドリマーと5ミリグラムのPTXを1ミリリットルのクロロホルムに溶解します。ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去し、均質な乾燥ポリマーフィルムを取得します。1ミリリットルのPBSでフィルムをボルテックスして再構成します。
その後、40キロヘルツで30分間超音波処理します。3%の過酸化水素を添加して、テロデンドリマー上のチオール基を酸化します。テキストプロトコルで説明されているように、追加の準備および検証手順を実行します。
ミセルの調製が完了したら、動的光散乱装置でミセルのサイズとサイズ分布を測定します。室温で測定を行い、ミセル濃度を1ミリグラム/ミリリットルに保ちます。次に、PBS中のドデシル硫酸ナトリウムの7.5ミリグラム/ミリリットルの原液を調製します。
次に、PBS中のジスルフィド架橋ミセルの1.5ミリグラム/ミリリットルのストック溶液を調製します。これらのストック溶液を使用すると、最終的なSDS濃度が2.5ミリグラム/ミリリットルの混合物が作成されます。そして、ミセル濃度は1ミリリットルあたり1.0ミリグラムです。
サンプルをロードし、ミセル溶液のサイズとサイズ分布を2分間隔で測定します。ヌードマウスから新鮮なクエン酸血液を収集した後、1ミリリットルの血液サンプルを1, 000 x gで10分間遠心分離し、赤血球を収集します。それらをPBSで3回洗浄し、次に細胞ペレットをPBSで最終濃度2%に再懸濁します赤血球懸濁液200マイクロリットルをPTX NCMの1ミリグラム/ミリグラム溶液と混合します。
次に、200マイクロリットルの赤血球懸濁液をPTX DCMの1.0ミリグラム/ミリリットルの溶液と混合し、これらの混合物をインキュベーターシェーカーで摂氏37度で4時間インキュベートします。インキュベーションが完了した後、混合物を3, 000 x gで5分間遠心分離します。
各サンプルの上清100マイクロリットルを96ウェルプレートに移します。この後、マイクロプレートリーダーを使用して、540ナノメートルの遊離ヘモグロビンの吸光度を測定します。エルマンズテストで測定したように、酸素媒介酸化の48時間後に遊離チオール基からジスルフィド結合への変換率は85%に達しました。
ここでは、過酸化水素を介した酸化法が代替法として採用されています。コンバージョン率は30分で88%に達します。これは、酸素媒介アプローチの96倍の速さです。
このより効率的なアプローチを使用して、50グラムを超えるナノ粒子が生成され、測定された粒子サイズは27ナノメートルで、サイズ分布は狭くなっています。PTXを装填したジスファイド架橋ミセルの安定性は、厳しいミセル破壊条件下でも調査されています。ミセルの粒子サイズは時間の経過とともに安定しており、ミセルが無傷のままであることを示しています。
GSHを細胞内濃度で導入した後、薬物を充填したジスルフィド架橋ミセルのサイズは30分間そのままのままで、その後突然1ナノメートルに減少しました。これは、ミセルの急速な解離の前提条件であるジスルフィド結合の臨界数の減少を意味します。PTXをロードしたミセルの溶血活性の代表的な結果を以下に示します。
PTX NCMは、用量依存的な赤血球溶解数を有する。しかし、ジスルフィド架橋を有するPTX DCMは、観察可能な溶血活性を示さない。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、別のテクニックで行うことができます。
この手順を試みる際には、ジスルフィド形成のために等量の3%過酸化水素を追加することを忘れないでください。この手順に続いて、ジスルフィド架橋ミセルの血液適合性を評価するために、溶血アッセイを実施することができます。このビデオを見れば、薬物を充填したジスルフィド架橋ミセルを効果的に合成する方法を十分に理解できるはずです。
これらの化学物質の一部は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に個人用保護具の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
本記事では、がん治療における標的薬物輸送を目的とした、薬物封入ジスルフィド架橋ミセルの合成プロトコルを紹介します。この手法では、ミセル調製に過酸化水素介在性酸化を利用しており、還元的な腫瘍環境において解離することで治療薬を放出することが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- ナノメディシン
- がん治療
- ドラッグデリバリーシステム
背景
- 標的薬物送達は、がん治療における副作用を最小限に抑えるために極めて重要です。
- ナノ粒子は、腫瘍部位に特異的に薬物を届けるための有望なアプローチを提供します。
- 薬物の安定性と放出を向上させるために、ジスルフィド架橋ミセルを合成することができます。
- 過酸化水素を介した酸化は、合成プロセスにおける重要なステップです。
研究目的
- 薬物封入ミセルの合成に向けた、簡便かつ効果的なプロトコルを開発すること。
- 臨床応用に向けた安定なナノ製剤の作製における課題を解決すること。
- 潜在的な患者研究に向けた、ミセルの大規模合成を促進すること。
使用方法
- 無水DMF中でのモノメチル末端ポリエチレングリコールモノアミンの調製。
- ミセル形成のための過酸化水素媒介酸化。
- 安定性と薬物放出特性に関するミセルの特性評価。
- 還元環境におけるミセルの性能評価。
主要な結果
- ジスルフィド結合により架橋されたミセルの合成に成功した。
- ミセルは、還元環境において効果的に解離することが示された。
- がん治療薬の標的輸送への応用の可能性がある。
- 臨床研究に適した、スケールアップ可能な製造方法である。
結論
- 開発されたプロトコルは、薬物封入ミセルの作製における実行可能な手法を提供する。
- ミセルは、腫瘍への薬物送達の特異性を向上させることができる。
- このアプローチにより、従来のがん治療に伴う副作用を軽減できる可能性がある。
よくある質問
産業界における重要性
本プロトコールでは、がんの標的薬物配送に向けたジスルフィド架橋ミセルのスケーラブルな製造を可能にし、ナノ医学の実用化における主要なボトルネックを解消します。H₂O₂媒介酸化を利用することで、従来の手法よりも96倍速い架橋を実現し、前臨床および臨床研究における製造可能性を向上させています。得られたナノ粒子は、血中での安定性と、還元的な腫瘍微小環境におけるトリガー放出能を示し、治療指数を向上させ、オフターゲット毒性を低減します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 科学的価値：パクリタキセルなどの細胞毒性ペイロードを安定したナノキャリアに製剤化することを可能にし、腫瘍標的配送のメカニズム研究に寄与する。
- 運用的価値：製剤のバリエーションを迅速に作成できるため、薬物放出速度における構造活性相関の評価を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 腫瘍の還元条件を模倣した環境下で、薬物放出プロファイルをスクリーニングするための再現可能なナノ粒子プラットフォームを提供する。
- 実用的価値： 一貫したアッセイ性能と規制上の比較可能性に不可欠な、狭い粒度分布（27 nm）を実現する。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 非架橋ミセルと比較して溶血活性が低下することを実証し、血液適合性の安全性プロファイルを向上させる。
- 運用上の価値： 50 gを超えるバッチ生産を可能にし、IND申請に向けた毒性試験および薬物動態試験をサポートする。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期の処方スクリーニングから前臨床検証に至るナノ医療発見のコンティニュアムに適合し、酸化還元応答性デリバリーシステムの反復的な設計を可能にします。
- 探索生物学： ジスルフィド架橋による腫瘍特異的な薬剤蓄積が、遊離薬剤と比較して向上するかどうかという仮説検証を促進します。
- スクリーニング： 高い薬剤充填効率を持つ標準化されたミセルを提供し、細胞毒性アッセイにおける信頼性の高い化合物評価を可能にします。
- 分析学： DLSおよび溶血アッセイを通じて、製剤の性能を比較するための定量的なサイズおよび安定性データを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ： 細胞内還元環境におけるトリガー放出（GSH誘導による1 nmへのサイズ崩壊）を検証することで、探索段階から前臨床段階への継続性をサポートします。
- 企業での再利用： 多様なペイロードや標的リガンドに適応可能な、モジュール式のテロデンドリマーベースのプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 検証済みの酸化還元応答性解離による、腫瘍選択的な薬剤放出への予測的信頼性。
- 運用上の価値： 強固な粒子径制御と高い薬剤封入量を備えた、標準化可能でスケールアップ可能な合成。
- 戦略的価値： 溶血の最小化と腫瘍標的能の向上を通じて治療指数を改善し、後期段階での失敗リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響： スケールアップ可能でGMP適合的な製造を通じて、リスク調整されたナノメディシン候補の推進を可能にする。
実施上の考慮事項
- ペプチド化学、ナノ沈殿、および還元・酸化反応性ポリマーの取り扱いに関する専門知識が必要です。
- ポリマー合成のためには、無水DMF、過酸化水素、透析、および凍結乾燥の設備が必要です。
- 再現性のあるバッチを確保するため、ミセル調製および品質管理（DLS、溶血試験）のチーム間での標準化が求められます。
- 代替ペイロードへの適応には、溶媒留去および薬物封入パラメータの最適化が必要な場合があります。
- 実用的制限：ペイロードの分解や毒性を防ぐため、酸化後に残留過酸化物を除去しなければなりません。
