水中の内分泌活性のスクリーニング市販の使い方インビトロトランスバイオアッセイ
2016年12月4日
処理された廃水や地表水を含む水サンプルの有機抽出物中の内分泌活性をスクリーニングするためのプロトコルは、市販の分割停止(「凍結融解」)in vitroトランス活性化バイオアッセイを使用して適応されました。
この標準化された手順の全体的な目標は、市販の受容体ベースの細胞アッセイを使用して、水サンプルの内分泌活性化学物質をスクリーニングすることです。この方法は、サンプルに内分泌活性化学物質が実際に存在するかどうかなど、水質モニタリング分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、現在の化学的方法よりもはるかに迅速に内分泌活性化合物のグループを分析できることです。
この技術は、内分泌かく乱化学物質の存在から生じる水質問題の診断に役立ちます。この方法は、水中の汚染物質に関する洞察を提供しますが、堆積物や組織などの他の環境マトリックスにも適用できます。一般に、この技術に不慣れな人は、ピペッティング技術を使用する際に高い精度を必要とするため、苦労する可能性があります。
この手順を開始するには、テキストプロトコールに詳述されているように、アッセイ特異的培地および参照化学物質のストック溶液で水サンプルを調製します。アッセイ特異的培地は、長期保存のために摂氏4度で保存してください。次に、滅菌チューブ内の285マイクロリットルのアッセイ培地に、適切な参照薬品ストック15マイクロリットルを加えます。
ピペッティングで上下させてサンプルを混合します。次に、アッセイ培地中の200マイクロリットルの5%DMSOを8本のチューブに追加して加えます。100マイクロリットルのアリコートをチューブ1からチューブ2に移し、3倍希釈シリーズを開始します。
希釈したサンプルをチューブ2でピペットで十分に混合します。次に、100マイクロリットルのアリコートをチューブ2からチューブ3に移します。各チューブについてこのプロセスを続けます。
次に、10マイクロリットルのDMSOを190マイクロリットルのアッセイ培地に混合して、溶媒制御サンプルを調製します。次に、4つの新しいチューブを収集してラベルを付けます。95マイクロリットルのアッセイ培地を最初のチューブに加えます。
次に、5マイクロリットルの水抽出物を加え、よく混ぜます。アッセイ培地中の50マイクロリットルの5%DMSOを他の3本のチューブに加えます。次に、50マイクロリットルの溶液を1つのチューブから次のチューブに移すことにより、2倍希釈を行います。
まず、ERまたはGR分裂停止細胞のバイアルを極低温冷凍庫から取り出します。バイアルを摂氏37度の水浴に入れ、2分間穏やかに攪拌しながら、細胞を迅速に解凍します。次に、バイアルを70%エタノールで除染します。
クラス2の生物学的安全キャビネットに入れます。無菌技術を使用してバイアルを開き、細胞を10ミリリットルのアッセイ培地に移します。200倍gで5分間遠心分離します。
遠心分離が完了したら、滅菌ガラスピペットを使用して上清を吸引します。次に、細胞ペレットを6ミリリットルのアッセイ培地に再懸濁します。5マイクロリットルの細胞懸濁液と5マイクロリットルのバイタル染色液を混合します。
次に、アリコートを計数室に追加します。光学顕微鏡または自動セルカウンターを使用して生細胞の数をカウントします。次に、細胞懸濁液中の生細胞の密度を推定します。
必要に応じて希釈して、アッセイ培地のミリリットルあたり550, 000個の生細胞の最終密度を得る。まず、9ポイントアッセイ特異的検量線、QA/QCサンプル、および各水抽出物の複数の希釈を含むプレートレイアウトを作成します。90マイクロリットルのアッセイ培地を複製セルフリーコントロールウェルに加えます。
細胞懸濁液を滅菌ピペッティングリザーバーに注ぎます。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、90マイクロリットルの細胞懸濁液を他のウェルに加えます。希釈したサンプル10マイクロリットルを適切なウェルに加えます。
プレートに蓋をします。次に、プレートを摂氏37度の5%C02インキュベーターに16時間置きます。インキュベーションが完了したら、プレートを室温まで平衡化します。
次に、直射日光がない状態で次のステップを実行する必要があります。製造元の指示に従って、6xローディング溶液を準備します。次に、各ウェルに20マイクロリットルのローディング溶液を追加します。
各ウェルに10マイクロリットルの細胞生存試薬を添加し、希釈した水抽出物の細胞毒性を評価します。プレートをアルミ粘着フィルムで密封します。その後、プレートを暗所で室温で2時間インキュベートします。
インキュベーションが完了したら、プレートをボトムリーディング機能を備えたマイクロプレートリーダーに追加します。蛍光を測定し、テキストプロトコルに詳述されているようにデータを分析します。この研究では、処理された都市排水の24時間複合サンプル4つ、南カリフォルニアの淡水システムからの表層水のグラブサンプル6つ、および超純水からなるフィールドブランクを分析しました。
ER活性は10の代表的な水サンプルのうち7つで検出され、GR活性は4つで検出されました。エストロゲン受容体およびグルココルチコイド受容体アッセイのQA/QC性能ガイドラインは、こちらでご覧いただけます。細胞毒性とサンプル精度に関する研究結果は、許容基準内に十分収まり、水サンプルの測定値が検証されました。
バイオアッセイと同等の濃度が最も高いのは二次流出液で見られ、三次流出液のGR活性はバイオアッセイの検出限界を下回っていることがわかりました。同様に、ほとんどの地表水サンプルは、検出限界を超えるGR活性を示さず、二次流出物よりもER活性のレベルがはるかに低かった。廃水処理プラントの廃液サンプルの大部分は、ERバイオアッセイとGRバイオアッセイの両方で検出限界を超える線量反応を示しました。
これらのサンプルの平均青/緑蛍光比の代表的な結果を、相対濃縮係数に対してプロットした結果をここで見ることができます。この手法は、適切に実行すれば、24時間で実行できます。それを試みるときは、すべてのQA/QCガイドラインに従うことが重要です。
この手法は、管理者が水中の内分泌かく乱化学物質を監視するための代替アプローチを模索する道を開きました。アジ化ナトリウムの取り扱いには危険が伴うことを忘れないでください。適切に機能するドラフトで作業するなど、予防策を講じる必要があります。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本記事では、受容体ベースの細胞アッセイを用いて水試料中の内分泌活性物質をスクリーニングするための標準化されたプロトコルを提示します。この手法は、従来の化学分析法よりも効率的に内分泌系攪乱化学物質の存在を特定することで、水質モニタリングを強化することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 環境科学
- 水質モニタリング
- 毒性学
背景
- 内分泌活性物質は、水生生態系およびヒトの健康に重大なリスクをもたらす可能性があります。
- これらの化学物質を検出するための現状の手法は、時間がかかり、効果が低い場合があります。
- 受容体ベースの細胞アッセイを用いることで、より迅速なスクリーニングの代替手段が得られます。
- 本手法を成功させるには、ピペッティング技術の精度が極めて重要です。
研究目的
- 内分泌活性化学物質を検出するための水質サンプルスクリーニングプロトコルを開発すること。
- 従来の化学分析法に代わる、より迅速かつ効率的な代替手法を提供すること。
- 内分泌攪乱化学物質に関連する水質問題への理解を深めること。
使用方法
- 市販のin vitroトランスアクティベーション・バイオアッセイの適応。
- 処理済み排水および地表水サンプルのスクリーニング。
- 検出のためのレセプターベース細胞アッセイの利用。
- 再現性を確保するための手順の標準化。
主な結果
- 本プロトコルにより、水サンプル中の内分泌活性化学物質の存在を効果的に特定できます。
- 結果は、従来の分析手法と比較して分析時間が短縮されることを示しています。
- この手法は、水以外のさまざまな環境マトリックスにも適用可能です。
- 信頼性の高い結果を得るためには、ピペッティングにおける高い精度が必要です。
結論
- この手法は、水質および汚染問題に関する貴重な知見を提供します。
- 内分泌攪乱化学物質のモニタリング体制を強化できる可能性があります。
- 新しいユーザーがこの技術を習得するには、さらなるトレーニングが必要な場合があります。
よくある質問
業界における重要性
市販の細胞株を用いた標準化されたin vitro経経路活性化バイオアッセイにより、環境水試料中の内分泌活性を迅速かつ定量的にスクリーニングすることが可能です。このアプローチは、内分泌攪乱化学物質の強固で再現性のある検出へのニーズに応えるものであり、環境毒性学のパイプラインにおける早期のハザード特定およびメカニズムに基づいたリスク低減を支援します。検証済みでユーザーフレンドリーなプロトコルの導入は、水質モニタリングおよび環境リスクアセスメントにおける予測の信頼性とポートフォリオの意思決定を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 環境毒性学におけるメカニズム的なリスク低減のため、内分泌受容体経路の解析を可能にします。
- 複雑な水マトリックスにおける受容体介在活性の機能的検証をサポートします。
- 環境汚染物質のハザード特定および優先順位付けにおける予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 水サンプルのハイスループットスクリーニングに向けた、標準化され再現性のある細胞ベースのアッセイを提供します。
- 厳格なQA/QCおよび検量線の統合により、定量的な出力を保証します。
- 環境モニタリングにおけるスケーラブルな多検体ワークフローに適合した、バリデート済みの生物学的システムを構築します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 環境スクリーニングの結果を、エコシステムヘルスのためのトランスレーショナルバイオマーカー戦略に適合させます。
- 内分泌活性の発見から、水系汚染物質の前臨床リスクアセスメントまでの連続性を提供します。
- 強固な受容体活性データに基づき、リスク調整された緩和戦略の推進を可能にします。
パイプラインおよびワークフローへの統合
本プロトコルは、初期の発見からスクリーニング、そしてトランスレーショナルなリスクアセスメントに至る環境毒性学のパイプラインに統合されており、仮説主導型およびサーベイランスベースの両方のワークフローをサポートします。
- 探索生物学：環境サンプル中の内分泌攪乱物質の存在および活性に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：多検体での定量スクリーニングキャンペーンに適した、アッセイの準備完了状態と再現性を提供します。
- 分析：比較分析のための蛍光ベースの定量読み取り値および用量反応データを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：探索的知見を、前臨床のエコシステムおよびヒトの健康リスクモデルへと橋渡しします。
- 組織内での再利用：多様な環境マトリックスやモニタリングプログラムに適応可能な、標準化されたキットベースのプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：環境ハザード特定における予測の信頼性を向上させ、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用の価値：内分泌活性スクリーニングの標準化、再現性、および拡張性を高める。
- 戦略的価値：環境モニタリングポートフォリオにおける意思決定（Go/No-go）および資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整に基づいた優先順位付けを可能にし、軽減策または浄化戦略を推進させる。
実施上の検討事項
- 細胞ベースのアッセイ操作および精密なピペッティングに関する技術的専門知識が必要です。
- 蛍光マイクロプレートリーダーおよび制御されたインキュベーション設備へのアクセスが必要です。
- チーム間でのデータ比較可能性を確保するため、QA/QCプロトコルの厳格な遵守が求められます。
- 適切な抽出および希釈調整を行うことで、さまざまな環境マトリックスに適応可能です。
- 潜在的な制限として、細胞毒性による干渉や、慎重な試料調製が必要な点が挙げられます。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Prepare Dilutions of the Assay-specific Reference Chemical and Water Extract
2:42
Prepare the Cell Suspension to Conduct the Fret Bioassay
4:05
Plate Cells in a 96-well Black Wall Clear-bottom Plate and Add Diluted Water Extract
4:54
Measure Cytotoxicity and Endocrine Activity Response
5:51
Results
7:22
Conclusion
