Name: 水中の内分泌活性のスクリーニング市販の使い方インビトロトランスバイオアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学ぶ、水質モニタリングにおける内分泌活性化学物質のスクリーニング方法。受容体ベースの細胞アッセイを用いて、従来の化学分析法より高速に複数の化合物を検出し、水質問題を診断する技術です。

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資金は、州水資源管理委員会(協定番号10-096-250および14-090-270)によって提供されました。S. Abbasi、M. Connor、S. Engelage、K. North、J. Armstrong、S. Asato、M. Dojiri、D. Schlenk、S. Snyder、S. Westerheide、B. Escher、F. Leusch、G. Pelanek、K. Bi、J. Printenに感謝します。著者は利益相反を宣言せず、商号への言及は推奨を意味するものではありません。

1.収集し、プロセス水サンプル（エッシャーらから変更された。9） <ol><li>関心の水試料でトップに1グラムのアジ化ナトリウムおよび50mgのアスコルビン酸を含む清浄な1 Lアンバーガラスボトルを埋めます。 72時間内のショップ4°Cでのサンプルおよびプロセス。 注：アジ化ナトリウムは非常に毒性があり、慎重に取り扱わなければなりません。保護具（目/顔、手袋、衣服）を使用し、適切に機能してヒュームフード内で重量を量ります。計量のための金属へらを使用しないでください。 </li><li> 1.6μmのガラス繊維フィルターを通して試料を通過した後、5-10 ml /分の流速で前処理固相抽出（SPE）カートリッジを通して。流量を制御するために、真空ポンプの圧力を調整します。 </li><li>真空を15分間カートリッジを乾燥させます。 </li><li>ヘキサン（1：1、v / v）のアセトン10ml、続いてメタノール10mlでカートリッジを溶出します。 </li><li>高純度窒素の穏やかな流れの下で〜1mlに溶出液を濃縮します。溶媒ジメチルスルホキシド（DMSO）500μlのを追加し、ダウンを500μlの抽出液を蒸発させることによって交換。 </li><li>アンバーガラスオートサンプラーバイアルに抽出液を転送します。 -20℃で保管してください。 </li></ol> 2.アッセイ特定の参照化学物質の希釈液と水抽出物を準備します<ol><li> 検量線用の9希釈液を調製します。 <ol><li> 100％DMSO中のアッセイ特定の参照化学物質の原液を作ります。最終濃度は、ERアッセイのために2μM17βエストラジオール、およびGRアッセイのために、100μMデキサメタゾンでなければなりません。 -20℃でストック溶液を保管してください。 </li><li> （チューブ＃1）滅菌チューブにアッセイ培地285μlに適切な参照化学株式の15μLを加えます。上下にピペッティングすることによって、サンプルを混ぜます。 </li><li> 8追加のチューブ（チューブ＃2-9）でアッセイ培地中で5％のDMSO溶液200μlを追加します。 </li><li>浴槽を通してチューブ＃2にチューブ＃1からの100μlのアリコートを転送E＃9は、3倍希釈系列を実行します。各希釈サンプルは、一定分量を取り、次のチューブに追加する前に、ピペットで十分に混合しなければなりません。 </li></ol></li><li>アッセイ培地190μlのDMSOを10μlを混合することにより、溶媒対照サンプルを準備します。 </li><li>各水抽出するための4つの希釈液を調製します。 <ol><li>第1のチューブでは、アッセイ培地の95μLの水抽出物の5μLを加え、よく混ぜます。 3他のチューブにアッセイ培地中で5％のDMSO 50μLを加えます。 </li><li>次へ1管から溶液50μlを転送することにより2倍希釈を行います。 </li></ol></li></ol> 3. FRETバイオアッセイを実施するために細胞懸濁液を準備します<ol><li>製造元の指示に従ってアッセイ特定のメディアを準備します。アッセイ培地は4℃​​で保存し、使用前に水浴中で37℃に温めなければなりません。 </li><li>極低温自由のうち、ERまたはGR分裂停止細胞のバイアルを取りますZERは、穏やかに攪拌しながら2分間、37℃の水浴中でバイアルを配置することによって、迅速に細胞を解凍し、。 70％エタノールでバイアルを除染し、クラスII生物学的安全キャビネットに入れてください。 </li><li>無菌技術を使用して、バイアルを開き、アッセイ培地10mlに細胞を移します。 </li><li> 5分間200×gで遠心分離します。 </li><li>滅菌ガラスピペットを用いて上清を吸引し、アッセイ培地6ml中に細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>生体染色溶液5μlの細胞懸濁液の5μLを混合し、計数室にアリコートを追加します。 </li><li>光学顕微鏡または自動細胞カウンターを使用して生細胞の数をカウントし、細胞懸濁液中の生細胞の密度を推定します。アッセイ培地1ml当たり55万生細胞の最終濃度を得るために、必要に応じて希釈します。 </li></ol> 4.プレート96ウェル黒壁透明底プレート中の細胞と希釈し、水エキスを追加します。 <ol><li>プレートを作成します。各水抽出物についての較正曲線、QA / QCサンプルと複数の希釈特定9ポイントアッセイを含むレイアウト。 96ウェルプレートのレイアウトの例が図1に示されています。 </li><li>複製細胞を含まない対照ウェルにアッセイ培地90μlのを追加します。 </li><li>無菌分注容器内の細胞懸濁液を注ぎ、マルチチャンネルピペットを使用して他のウェルに細胞懸濁液90μlを添加します。 </li><li>適切なウェルへのステップ2の間に調製した希釈サンプルの10μlのを追加します。ウェル当たりDMSOの最終濃度は0.5％、最大でなければなりません。 </li><li>蓋付きのプレートをカバーし、16時間、37℃で5％CO 2インキュベーターに入れてください。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54725/54725fig1.jpg" /> 図1：96ウェルプレートのレイアウトの例のマルチウェルプレートは、3種類のアッセイ特定の較正曲線を含むように設計されています。QA / QCコントロールのと水抽出物あたり4希釈（メディアのみ、DMSO中のきれいな培地中の細胞と細胞が培地をスパイクしました）。各制御および水抽出物の希釈は三連ウェルで分析されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54725/54725fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 5.ローディング溶液を準備し、各ウェルに追加<ol><li>インキュベーション後、プレートを室温に平衡化することができます。このFRETバイオアッセイのために、5.6を介して5.2が直接光の不存在下で行われるべきであるステップ。 </li><li>製造元の指示に従って6×ローディング溶液を準備します。 </li><li>各ウェルに6×ローディング溶液20μlを追加します。 </li><li>希釈した水抽出物の細胞毒性を評価するために、各ウェルに細胞生存性試薬10μlのを追加します。 </li><li>アルミニウム接着フィルムでプレートを密封します。 </li><li> 2時間室温で暗所でプレートをインキュベートします。 </li></ol> 6.メジャーの細胞毒性および内分泌活動レスポンス<ol><li>製造業者の指示に従って下読み取り機能を備えたマイクロプレートリーダーを設定します。 </li><li> FRETトランスバイオアッセイのために、青色の蛍光（460分の409 nmの励起（例）/発光（EM）波長）と緑（409例/ 530エムnm）のチャネルを測定します。 </li><li>細胞傷害性アッセイのために、560例/ 590エムnmで蛍光を測定します。 </li></ol> 7.データの品質を決定するために、QA / QCチェックを評価します<ol><li>平均生の無細胞（専用メディア）の蛍光および細胞のみ（きれいなアッセイ培地中の細胞）を対照と比較します。メディアのみのバックグラウンド蛍光は、細胞のみの対照の応答よりも少なくとも25％低いことが必要です。 </li><li>生FRETデータを処理します。 「青」と「グリーン」データセットの両方について、よく含むすべての細胞からの細胞を含まない対照ウェルの平均蛍光を引きます。計算各実験ウェルについての青/緑比。 </li><li> DMSOコントロールを持つ唯一の細胞 - 細胞の青/緑比を比較してください。これらのコントロールの蛍光値は、15％相対標準偏差（RSD）の範囲内でなければなりません。 </li><li>ログ分子量（Mをログ）として表現試料濃度に対する青/緑比などのアッセイ特定の較正曲線をプロットします。スロープ、R 2を計算し、EC 50（50％影響濃度）を記録します。較正パラメータは、 表1に記載予想範囲内であるべきです。 </li><li>すべての三連のウェルのためのRSDを計算します。レプリケート間のばらつきが20％未満であるべきです。 </li><li>細胞毒性データ（560例/ 590エムnm）のために、すべての細胞を含むウェルからの細胞を含まない対照の平均（すなわち、メディアの背景を）引きます。 </li><li>各サンプルの平均バックグラウンドを差し引いた蛍光を計算します。 DMSO対照のパーセントとして得られる蛍光データをプロットします。サンプル希釈はいけません細胞のみで、DMSO対照と比較して20％以上の細胞死を示します。 </li></ol> 8.データ分析<ol><li>最小キャリブレーション応答に加えて、その応答の平均値の2標準偏差として検出（LOD）の測定限界を計算します。 </li><li>用量反応を示す試料について、EC 50を導出します &#160;基準化学物質の10と50％効果濃度と較正曲線の線形回帰の傾きを用いて、水抽出物。 </li><li> / EC水サンプルの50参照化学物質のBEQ = EC 50：式を使用して、バイオアナリティカル当量濃度（BEQ）を計算します。 </li></ol>

<ol><li>Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ToxCast+program+for+prioritizing+toxicity+testing+of+environmental+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals.</a> Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).</li>
<li>Reif, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+profiling+and+prioritization+of+environmental+chemicals+using+ToxCast+data%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data.</a> Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).</li>
<li>Maruya, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tiered%2C+integrated+biological+and+chemical+monitoring+framework+for+contaminants+of+emerging+concern+%28CECs%29+in+aquatic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Environ.+Assess.+Manag%22%5BJournal%5D)">A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems.</a> Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).</li>
<li>Van der Linden, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+multiple+hormonal+activities+in+wastewater+effluents%2C+surface+water%2C+using+a+panel+of+steroid+receptor+CALUX+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays.</a> Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).</li>
<li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+in+vitro+bioassays+to+measure+estrogenic+activity+in+environmental+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters.</a> Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).</li>
<li>Jarosova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Europe-wide+survey+of+estrogenicity+in+wastewater+treatment+plant+effluents%3A+the+need+for+effect-based+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).</li>
<li>Sonneveld, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+screening+models+for+androgenic+and+estrogenic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities.</a> Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).</li>
<li>Piersma, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+alternative+in+vitro+test+battery+for+detecting+reproductive+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants.</a> Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).</li>
<li>Escher, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+organic+micropollutants+in+wastewater%2C+recycled+water+and+drinking+water+with+in+vitro+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays.</a> Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Prioritization+of+the+endocrine+disruptor+screening+program+universe+of+chemicals+for+an+estrogen+receptor+adverse+outcome+pathway+using+computational+toxicology+tools%22">Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools</a>. , OCSPP/OW/ORD/NCCT. (2012).</li>
<li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+wastewater+and+recycled+water+quality%3A+a+comparison+of+lines+of+evidence+from+in+vitro%2C+in+vivo+and+chemical+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses.</a> Water Res. 50, 420-431 (2014).</li>
<li>Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+budget%3A+accounting+for+glucocorticoid+bioactivity+and+fate+during+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).</li>
<li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genomics+profiling+of+environmental+chemical+modulation+of+human+nuclear+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors.</a> Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).</li>
<li>Mehinto, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+comparison+of+in+vitro+bioassays+for+screening+of+endocrine+active+chemicals+in+recycled+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water.</a> Water Res. 83, 303-309 (2015).</li>
<li>Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrutinizing+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+wastewater+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment.</a> Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).</li>
<li>Tang, J. Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+characterization+of+urban+stormwater+with+bioanalytical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools.</a> Water Res. 47, 5594-5606 (2013).</li>
<li>Scott, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+endocrine+activity+in+Australian+rivers+using+chemical+and+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).</li>
<li>Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminants+of+emerging+concern+in+municipal+wastewater+effluents+and+marine+receiving+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water.</a> Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).</li>
<li>WateReuse Research Foundation (WRRF). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Direct+potable+reuse%3A+a+path+forward%22">Direct potable reuse: a path forward</a>. , WRRF. Alexandria, VA. (2011).</li>
<li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+application+of+bioanalytical+tools+as+surrogate+measure+of+chemical+contaminants+in+recycled+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water.</a> Water Res. 49, 300-315 (2014).</li>
<li>Schriks, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+glucocorticoid+activity+in+various+surface+waters+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands.</a> Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).</li>
<li>Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+glucocorticoid+receptor+agonist+in+effluents+from+sewage+treatment+plants+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tot.+Environ%22%5BJournal%5D)">Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan.</a> Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).</li>
<li>Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+effects+of+effluents+from+sewage+treatment+works%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works.</a> Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).</li>
<li>Kidd, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+a+fish+population+after+exposure+to+a+synthetic+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).</li>
<li>Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+estrogen+and+androgen+receptor+activities+in+200+pesticides+by+in+vitro+reporter+gene+assays+using+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells.</a> Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).</li>
<li>Kugathas, S., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+glucocorticoids+in+the+environment%3A+First+results+on+their+potential+impacts+on+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish.</a> Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).</li>
<li>Van der Linden, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+panel+of+high-throughput+reporter-gene+assays+to+detect+genotoxicity+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Genet.+Toxicol.+Environ.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).</li>
<li>Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+designer+drugs%3A+when+transformation+may+not+eliminate+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk.</a> Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このようなNG / L濃度23,24でこれらの化学物質のための17βエストラジオール（E2）、ワラントのスクリーニングなどの環境エストロゲン、のよく文書効力。本研究では、汚水排水（BEQ範囲：2.3〜17 ngのE2 / L）のためのER応答は、オーストラリアのWWTPs 20から二次処理水のために報告されたものよりやや高かった、表面水のBEQs一方（&lt;0.5〜4 ngのE2 / L ）16（&lt;1〜11 ngのE2 / L）面と他の場所で雨水のために報告された範囲内でした。地表水の試料で測定ER活性の低レベルにもかかわらず、このアッセイは、水の品質評価に関連するスクリーニング・エンドポイントを表しています。ビスフェノールA及びアルキルフェノール界面活性剤などのエストロゲンは、多くの場合、水生環境中で検出され、それらは、従来の分析化学を使用して定量化することは困難です。小島らによって示されるようにER-細胞アッセイはまた、現在新たに登録された農薬のスクリーニングに有用であることを証明することができます25。 <p class="jo...

現在の水質のモニタリングを正確かつ精密に野生動物とヒトへの暴露の代用としての化学汚染物質の発生を測定する能力を前提としています。しかし、この化学・バイ・化学的モニタリングと評価のパラダイムは、我々が直面して刻々と変化する化学の世界でペースを維持することはできません。私たちは、合成および天然の化学物質の運命と影響についての詳細を学ぶように、私たちは期待生物学的影響に対処測定ツールを探し続け、同時にそれは、化学物質の生産、使用状況や環境入力の変化に免疫があります。このようなツールは、未知または新規化学物質、および変換製品は、私たちの注目に値するかどうかを理解するために特に関連しています。また、水中に存在する化学物質の複雑な混合物はあまり個々の化学モニタリングによって対処されます。したがって、私たちはより良い表層水の股関節にこれらの問題に対処するために既存の監視ツールボックスの近代化の課題に直面しますトン下水処理水排水と都市/雨水流出の排出を受けます。 近年、生物分析技術は、水の品質評価のためのスクリーニングツールとして有望であることが示されています。知ら介して作用する化学物質への対応、特に、in&#39;vitroバイオアッセイでは、アクション1,2の特定のモードは、環境モニタリングのコミュニティ3に大きな関心が持たれています。多数の調査は飲酒、表面および廃水4 -6の内分泌活性を定量化するためにインビトロバイオアッセイで使用しています。また、バイオアッセイの数は、分子の開始イベントを（ 例えば、受容体活性化）、潜在的に有害な結果の経路を介して有害な影響にリンクさせることができる7,8を分析対象としています。 水質評価のためのbioscreeningの進化は、in vitroバイオアッセイのエンドポイントでの異なる数百人が彼らのために評価されたと、比較的急速にされていますユーティリティ9,10。水質5,6の間で分化する能力を発揮しながら、現在、バイオアッセイのほんの一握りは、（研究所内）、良好な測定精度を達成することが示されています。特に下水処理水排水のために、エストロゲンおよびグルココルチコイドステロイドの発生に成功ビトロトランスアッセイ11,12 に用いて会計処理されています。しかし、現在までのほとんどの研究は、その細胞株独自のもの（したがって、広く利用可能ではない）バイオアッセイを採用しており、継続的なケアと操作、またはその両方が必要です。その結果、プロトコルを標準化研究室間のキャリブレーション演習を行い、最終的に水資源のコミュニティに、このスクリーニング技術を転送する能力は、ヒンダードまま。 米国ToxCastプログラムを通じて吟味のin vitroバイオアッセイの少なくとも1つのサプライヤは、使いやすい「凍結融解で13市販されています。4;フォーマット。これらの分割阻止セル「キット」は、処置14の異なるレベルを表す水から抽出された化学物質の活性を測定することで堅牢であることが示されています。ベンダープロトコルは、個々の化学物質または混合物の生物活性をスクリーニングするために利用可能であるが、それらは、水サンプルに適用する前に、それらのいくつかは、修正を必要とします。下水処理水の流出物15、雨水流出16、受信水は17,18そして最近再生水の19,20水質コミュニティに関心のある水性媒体の主な例です。 本研究では、市販されている使用して、水試料中の内分泌活性を測定するための単一の、標準化されたプロトコルを提示し、分割逮捕ビトロトランスバイオアッセイで 。私たちは、TWの応答の背景、用量応答性と再現性を総合的に評価を通じてプロトコルの堅牢性を実証しました特に関心のエストロゲンとグルココルチコイド受容体トランスのOエンドポイント（ERおよびGR、それぞれ）。プロトコルは、カリフォルニアの淡水システムから下水処理水排水と表面水の画面サンプルに適用しました。

<table><tbody><tr><td>GeneBLAzer ER alpha DAアッセイキット</td><td>ThermoFisher</td><td>K1393</td><td>Kitには、ER分裂停止(DA)細胞とLiveBLAzer FRETローディングキットが含まれています。</td></tr><tr><td>GeneBLAzer GR DAアッセイキット</td><td>ThermoFisher</td><td>K1391</td><td>Kitには、GR分裂停止(DA)細胞とLiveBLAzer FRETローディングキットが含まれています。</td></tr><tr><td>PrestoBlue細胞生存試薬&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー、PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td> 0.4%&nbsp;<td>T8154</td><td>ThermoFisher</td></tr><tr><td>Corning 96ウェルブラックウォール、クリアボトムプレート</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>個包装、蓋付き</td></tr>滅菌 <tr><td>Whatmanガラス繊維フィルター、GF/A、1.6 & マイクロ;M</td><td>シグマ-アルドリッチ&nbsp;</td><td></td><td></td>WHA1820025</tr><tr><td>マイクロプレートアルミ封止フィルム</td><td>E&K Scientific</td><td>T592100</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 6 cc カートリッジ、吸着剤 200 mg</td><td>ウォーターズ</td><td>WAT106202</td><td></td></tr><tr><td>17&β;エストラジオール</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E2758</td><td>CAS #50-28-2</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A61-100</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Dexamethasoneでも入手可能&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>D4902</td><td>CAS #50-02-2</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D8418</td><td>分子グレード</td></tr><tr><td>溶剤(アセトン、ヘキサン、メタノール)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>HPLCグレード</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S2002</td><td>ケミカルは非常に毒性が高いため、取り扱いには注意が必要です。防護服を使用し、ドラフトの下で体重を量ります。EMD Milliporeでも購入できます。</td></tr><tr><td>自動セルカウンターまたは血球計算盤</td><td>さまざまな*</td><td></td><td>サプライヤーには、Bio-Rad、Fisher Scientific、Sigma-Aldrich、ThermoFisherが含まれます。</td></tr><tr><td>クラスII生物学的安全キャビネット</td><td>各種*</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>各種*</td><td></td><td></td></tr><tr><td>極低温冷凍庫&nbsp;</td><td>各種</td><td></td><td>*液体窒素貯留デュワーがおすすめです。&nbsp;</td></tr><tr><td>蛍光マイクロプレートリーダー</td><td>Various*</td><td></td><td>&nbsp;リーダーには、下部読み取り機能が必要です。</td></tr><tr><td>*推奨されるソースはなく、この機器の選択は予算、使用頻度、およびラボスペースによって異なります。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

水中の内分泌活性のスクリーニング市販の使い方<em&gt;インビトロ</em&gt;トランスバイオアッセイ

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

試験管内トランスバイオアッセイではしかし、彼らの採用および広範囲のアプリケーションが原因で標準化された方法で堅牢な、ユーザーフレンドリーな技術の利用可能性の欠如に部分的に妨げられてきた、水質監視ツールとして有望であることが示されました。本研究では、市販されている、分割逮捕された細胞株を定量的環境の質の専門家への関心の水試料中に存在する化学物質の内分泌活性をスクリーニングするために使用しました。総合的な品質保証/品質管理（QA / QC）のチェックを含め、単一の、標準化されたプロトコルは、細胞ベースの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）アッセイを用いて（それぞれERおよびGR）エストロゲンおよびグルココルチコイド受容体活性のために開発されました。カリフォルニア（米国）での淡水システムから処理された下水排水や地表水のサンプルは、固相抽出を用いて抽出し、標準化されたプロトを使用して、内分泌活性について分析しましたCOL。背景とエンドポイント固有の参照化学物質の用量反応は、信頼性の高い測定のために必要と認められるQA / QCのガイドラインを満たしました。地表水試料のバイオアッセイスクリーニング応答は、主に検出されませんでした。これとは対照的に、二次処理工場からの流出物サンプルは、ERのための392 ngのデキサメタゾンGR用/ Lおよび17 ngの17βエストラジオール/ Lまでの推定バイオアッセイ同等の濃度（BEQs）で、最高の測定可能な活性を有していました。三次流出物サンプルのためのバイオアッセイ応答は、高度処理後の内分泌アクティブな化学物質の低い残留を示し、二次排水のために測定されたものよりも低かったです。このプロトコルは、市販の利用ビトロトランスバイオアッセイで 、分割逮捕セル「キット」、水中の内分泌活性をスクリーニングするために適合させることができることを示しました。

本研究では、処理された都市下水排水の4倍24時間の複合サンプル、南カリフォルニアの淡水システムからの地表水の6グラブサンプルおよび超純水からなるフィールドブランクは、このプロトコルを説明するために選択しました。 4廃液試料の3は、従来の活性汚泥排水処理プラント（「二次流出液」）、および砂/炭素ろ過追加後の生物学的処理（「三次流出液」）との高度な排水処理プラントから4分の1からのものでした。地表水のサンプルは（オープン、農業や都市部）の異なる土地利用を表す流域から収集しました。 水抽出物の希釈は、DMSO対照（ 表1）と比較して観察された20％未満の細胞死で明らかな細胞毒性を示しませんでした。無細胞（メディアのみ）バックグラウンドが低く、CDMSOの応答を有する細胞のみ-と細胞との間omparison溶媒は、蛍光測定には測定可能な影響を与えなかったことを示しました。スロープおよびEC 50ログを含む...

処理された廃水や地表水を含む水サンプルの有機抽出物中の内分泌活性をスクリーニングするためのプロトコルは、市販の分割停止(「凍結融解」)in vitroトランス活性化バイオアッセイを使用して適応されました。

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

この標準化された手順の全体的な目的は、市販の受容体ベースの細胞アッセイを用いて、水サンプル中の内分泌活性化学物質をスクリーニングすることです。この手法は、サンプルに内分泌活性化学物質が実際に存在するかどうかなど、水質モニタリング分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、現在の化学的手法よりもはるかに迅速に、内分泌活性化合物のグループを分析できることです。この手法は、内分泌攪乱化学物質の存在によって生じる水質の問題を診断するのに役立ちます。本法は水中の汚染物質に関する知見を提供しますが、堆積物や組織などの他の環境マトリックスにも適用可能です。一般的に、ピペッティング技術において高い精度が求められるため、この手法に不慣れな方は習得に苦労する可能性があります。この手順を開始するために、テキストプロトコルに詳しく記載されている通り、アッセイ専用培地および参照化学物質のストック溶液を用いて水試料を調製します。アッセイ専用培地は、長期保存のために4 °Cで保存してください。次に、滅菌チューブ内の285 µLのアッセイ培地に、適切な参照化学物質ストックを15 µL加えます。ピペッティングによりサンプルを混合します。次に、8本の追加チューブに、アッセイ培地で調製した5%DMSOを200 µLずつ加えます。チューブ1からチューブ2へ100 µL分注し、3倍希釈系列を作成します。ピペットを用いて、チューブ2内の希釈サンプルを十分に混合します。次に、チューブ2から100 µLのアリコートをチューブ3に転送します。この工程を各チューブに対して繰り返します。次に、10 µLのDMSOを190 µLのアッセイ培地に混ぜ合わせ、溶媒コントロールサンプルを調製します。続いて、4本の新しいチューブを用意し、ラベルを貼ります。1本目のチューブに95 µLのアッセイ培地を加えます。次に、水抽出液を5 µL加え、十分に混ぜ合わせます。残りの3本のチューブに、アッセイ培地で調製した5% DMSOを50 µLずつ加えます。その後、溶液を50 µLずつ次のチューブに転移させ、2倍希釈を行います。まず、凍結保存庫からERまたはGRの分裂停止細胞のバイアルを取り出します。バイアルを37°Cの恒温水槽に入れ、2分間緩やかに揺らしながら急速解凍します。その後、バイアルを70% Ethanolで除菌します。クラス2生物学的安全キャビネット内に配置します。無菌操作を用いてバイアルを開封し、細胞を10 mLのアッセイ培地に移します。200 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、滅菌済みガラスピペットを使用して上清を吸引します。次に、細胞ペレットを6 mLのアッセイ培地で再懸濁します。細胞懸濁液5 µLと生存染色溶液5 µLを混合します。次に、分注した試料を計数盤に入れます。光学顕微鏡または自動細胞カウンターを用いて、生存細胞数を数えます。その後、細胞懸濁液中の生存細胞密度を推定します。必要に応じて希釈し、アッセイ培地1 mLあたり550,000個の生存細胞という最終密度にします。まず、9点のアッセイ特異的検量線、QA/QCサンプル、および各水抽出液の多段階希釈を含むプレートレイアウトを作成します。複製した細胞なしコントロールウェルに、アッセイ培地を90 µL加えます。細胞懸濁液を滅菌済みのピペッティングリザーバーに注ぎます。次に、マルチチャンネルピペットを用いて、他のウェルに細胞懸濁液を90 µLずつ分注します。希釈したサンプルを適切なウェルに10 µLずつ加えます。プレートに蓋をします。次に、プレートを 5%CO2 インキュベーターに入れ、37 °C で 16 時間培養します。培養完了後、プレートを室温に戻して平衡化させます。以降のステップは直射日光を避けて行ってください。製造元の指示に従い、6xローディング溶液を調製します。次に、各ウェルにローディング溶液を20 µLずつ加えます。希釈した水抽出物の細胞毒性を評価するため、各ウェルに細胞生存率試薬を10 µLずつ加えます。プレートをアルミ粘着フィルムで密封します。その後、プレートを室温の暗所で2時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、プレートを底面読み取り機能付きのマイクロプレートリーダーにセットします。蛍光強度を測定し、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。本研究では、処理済みの都市下水流出水の24時間複合サンプル4検体、南カリフォルニアの淡水系からの表面水のグラブサンプル6検体、および超純水で構成されるフィールドブランクを分析しました。10個の代表的な水サンプルのうち7個でER活性が検出され、4個でGR活性が検出されました。エストロゲン受容体およびグルココルチコイド受容体アッセイのQA/QC性能ガイドラインはこちらでご確認いただけます。細胞毒性とサンプル精度の試験結果は許容基準の範囲内に十分収まっており、水サンプルの測定値が妥当であることが確認されました。最も高いバイオアッセイ等量濃度は二次処理排水で検出され、一方で三次処理排水のGR活性はバイオアッセイの検出限界以下であることが分かりました。同様に、ほとんどの地表水試料では検出限界を超えるGR活性は見られず、ER活性レベルも二次処理排水より大幅に低い値でした。下水処理場の排水試料の大部分では、ERおよびGRの両方のバイオアッセイにおいて、検出限界を超える用量反応が示されました。これらのサンプルの平均青色/緑色蛍光比を相対濃縮係数に対してプロットした代表的な結果を、ここに示します。適切に実施すれば、この手法は24時間以内に完了できます。実施にあたっては、すべてのQA/QCガイドラインに従うことが重要です。この手法により、管理者は水中の内分泌攪乱化学物質をモニタリングするための代替アプローチを検討することが可能になりました。アジ化ナトリウムを取り扱う際は危険が伴うことに留意してください。適切に機能しているドラフトチャンバー内で作業するなど、十分な予防措置を講じる必要があります。

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環境

この記事では、ゼブラフィッシュの胚を化学的毒性スクリーニングに使用しています。化学的毒性は、表現型の読み出しと相関しています。サンプルプロトコルは、化学的毒性スクリーニングを実施するための方法論的アプローチを示しています。...

胚ベースの化学毒性スクリーニング:ゼブラフィッシュ胚の発生に対する影響の評価

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ここに、エストロゲンの効果を検出するためのゼブラフィッシュ胚Tg(vtg1:mCherry)を使用するための詳細なプロトコルが存在する。このプロトコルは、魚の伝播と胚の治療をカバーし、内分泌破壊化合物(EDC)によって誘導される蛍光シグナルの検出、ドキュメンテーション、および評価を強調しています。...

Tg(Vtg1:mcherry)ゼブラフィッシュ胚を用いて内分泌破壊化合物のエストロゲン効果を試験する

市販のエストロゲン受容体βレポーターアッセイを最適化し、エストロゲン活性に対するヒトおよび非ヒト霊長類食品をスクリーニングしています。我々は、既知のエストロゲンヒト食品大豆が高く登録されているのに対し、他の食品は活性を示さないことを示すことによって、このアッセイを検証した。...

レポーターアッセイによる細胞ベースのエストロゲン受容体β使用したフィトエストロゲンのスクリーニング

甲状腺ホルモン作用指標マウスモデルは、内因性調節機構を用いて局所的な甲状腺ホルモン作用の組織特異的な定量化を可能にするために開発されました。最近、このモデルは、甲状腺ホルモン経済と相互作用する内分泌かく乱化学物質を、 ex vivo および in vivo...

甲状腺ホルモン作用指標マウスによる内分泌かく乱化学効果のin vivo特性評価

学ぶ、水質モニタリングにおける内分泌活性化学物質のスクリーニング方法。受容体ベースの細胞アッセイを用いて、従来の化学分析法より高速に複数の化合物を検出し、水質問題を診断する技術です。

水中の内分泌活性のスクリーニング市販の使い方

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