イヌ好中球細胞外トラップリリースの定量化のためのシンプルな蛍光アッセイ

この実験の全体的な目的は、静止期の好中球を単離し、アゴニストに応答したDNA放出量を測定することです。この手法は、好中球細胞外トラップの誘導や細胞死を引き起こす様々なアゴニストに対して好中球がどのような反応を示すかなど、免疫学および獣医学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、好中球細胞外トラップ形成の様々なアゴニストおよび阻害剤を迅速にスクリーニングできることです。

まず、健康なドッグドナーの頭静脈に21ゲージのバタフライ針を挿入し、3 mLシリンジを取り付けて3 mLの血液サンプルを3回採取し、直ちにキャップのないEDTA含有採血管に転送します。不適切な採血は好中球の回収率低下につながるため、穿刺を非外傷的に行い、血流を良好に保つよう注意してください。各チューブに充填した後、チューブを転倒混和させ、血液と抗凝固剤を十分に混ぜ合わせます。

血液を50 mLのコニカルチューブにまとめます。等量の滅菌済み室温3% Dextran 500を加え、緩やかに転倒混和させた後、チューブを垂直に立てた状態で室温に18〜20分間放置します。その後、下層の赤色層による混入が起きない範囲で、上層の淡黄色層を新しいチューブに移します。

上層を遠心分離します。上清を捨て、ペレットを10 mLの滅菌済み室温PBSで手動で再懸濁します。次に、50 mLコニカルチューブに、室温のポリスクロースナトリウムジアトリゾエート細胞分離溶液を10 mL加えます。

分離溶液の上に細胞を慎重に重層させます。遠心分離により細胞を分離します。上層の血漿、血小板、単核細胞、および密度勾配層の3つの層を廃棄します。

残存している赤血球を10 mLの室温の水で溶血させます。30秒後、浸透圧を回復させるために10 mLの滅菌済み室温1.8%塩化ナトリウムを加えます。緩やかな転倒混和により細胞を混ぜ合わせます。

次に、遠心分離によって細胞を回収します。白いペレットを10 millilitersの滅菌PBSで緩やかに再懸濁してください。細胞数をカウントした後、再度遠心分離を行い、室温の滅菌PBSを用いて細胞濃度を5 × 10⁶ cells/mLに調整して再懸濁します。

必要に応じて、少量の細胞をガラススライド上で風乾させ、メーカーの指示に従って迅速固定・染色キットで染色します。好中球の単離が成功していれば、光学顕微鏡下で観察した際に、有核細胞の少なくとも95%が顆粒球であり、赤血球の混入が最小限であるはずです。好中球の単離後、直ちに細胞懸濁液を滅菌済みの70 µmフィルターに通し、培養液を含む96ウェルプレートの試験ウェルに5×10⁴個の細胞を加え、39 °C、4% CO₂条件下で30分間インキュベートします。

細胞が付着したら、フェノールレッドを含まず不活化FCSを添加したRPMIに溶解した目的のアゴニストを、試験ウェルおよびPBSのみを含む2つのブランクウェルに、最終容量が100-200 microlitersになるように加えます。次に、適切な細胞不透過性核酸染料を細胞に添加し、プレートをインキュベーターに戻します。適切なインキュベーション期間後、マイクロプレートリーダーで蛍光を測定します。

血小板活性化因子を用いてイヌ好中球を1時間刺激すると、刺激していない対照細胞と比較して、蛍光強度が平均4倍に増加します。一方、PMAはより緩徐に作用するアゴニストであり、活性化後2時間までは好中球の蛍光増加は見られませんが、最終的には時間経過とともに同様の倍率増加を示します。核酸染料の蛍光は、他のメカニズムによる細胞死が発生した場合や、試薬がDNAで汚染されている場合にも認められるため、好中球細胞外トラップ（NET）形成に特異的なものではありません。

例えば、この代表的な実験では、市販のLPS調製物が好中球不在下で非常に高い蛍光を示しましたが、これはおそらく細菌DNAの混入によるものと考えられます。この手法に習熟すれば、適切に実施した場合、約6時間で完了させることができます。本手順を行う際は、好中球を慎重に扱うことが重要である点に留意してください。

細胞をボルテックスせず、上清は捨てるのではなくピペットで吸い出して除去します。この手順に続き、免疫蛍光顕微鏡法などの他の手法を用いて、放出されたDNAがNETosisと相関していることを確認できます。この手法の開発により、血液学分野の研究者が、放出されたDNAと凝固の相互作用や、患者血漿を含む新規NETアゴニストの影響を探索することが可能になりました。

このビデオを視聴することで、イヌ好中球を単離し、アゴニストに対する応答を測定する方法について十分な理解を得ることができます。