実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のためのシンプルで効率的な生産とマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の精製

このプロトコルの全体的な目標は、ミエリンオリゴデンドロサイトの糖タンパク質またはMOGの細胞外ドメインに基づいてタンパク質を生成することであり、これは実験的自己免疫性脳脊髄炎またはEAEを誘導するために使用できます。このプロトコルにより、EAEを誘導する抗原として使用するために、どの研究室でもMOGタンパク質を作製することが可能になります。このプロトコールの主な利点は、特殊なタンパク質処理装置に頼らず、代わりにほとんどすべての免疫学研究室に見られる標準的な装置を使用できることです。

さて、このプロトコルはマウスバージョンに基づいてMOGタグタンパク質に最適化されており、精製用のヘステートを組み込んだ他のMOGタンパク質発現システムでも機能するはずです。5ミリリットルの滅菌ブロスにBL 21 MOGタググリセロールストックを接種し、摂氏37度、200RPMで一晩インキュベートします。500ミリリットルの滅菌LBを含む500ミリリットルのフラスコに、1ミリリットルあたり100ミリグラムのアンピシリンをそれぞれ追加します。.一晩培養した1ミリリットルをLBブロスの2つのフラスコのそれぞれに移します。

摂氏37度、200 RPMで5時間、または光学密度0.6までインキュベートします。目的の細胞密度に達したら、各培養フラスコに0.5ミリリットルの1モルIPTGを添加します。フラスコをインキュベートし、摂氏37度、200RPMで4時間設定し、次に室温で75RPMで一晩設定します。

高速遠心分離に対応した250ミリリットルのボトルに培養物を均等に分配し、この時点からボトルを氷上に保ちます。細菌細胞を22, 000倍gで摂氏4度で15分間ペレット化します。すべての細菌ペレットを再懸濁し、合計30ミリリットルのライセートバッファーに混ぜ合わせます。

このボリュームを、高速センタリフィケーションが可能な下部約50ミリリットルのチューブに移します。このチューブを摂氏30度の水浴に30分間入れます。インキュベーション時間中に、チューブを2回振って細胞を再懸濁します。

インキュベーション後、チューブを氷上に輸送し、溶液を20キロヘルツ、振幅70%で超音波処理し、3秒間オンで3秒間パルスし、5パルスで超音波処理し、溶液を合計6ラウンド5パルスで超音波処理し、ラウンド間で溶液を氷で冷却します。次に、溶液を24, 000倍gで15分間摂氏4度で遠心分離し、次いでペレットを30ミリリットルの緩衝液Aに再懸濁し、溶液を摂氏4度で3時間インキュベートする。インキュベーション後、前と同じように氷上で溶液を超音波処理し、次に溶液に17.2グラムのグアニジンHClを加えます。

サンプルを氷上で1時間インキュベートし、MOGタグタンパク質を可溶化します。ニッケルレジンを帯電させて平衡化するには、まずレジンが入った各チューブに40ミリリットルの水を加えてレジンを洗浄します。チューブをロッカーに水平に置き、摂氏4度で5分間攪拌します。

終了したら、チューブを4500 gで摂氏4度で8分間遠心分離します。ペレットの邪魔にならないように、ピペッティングで上清を捨ててください。次に、各チューブに40ミリリットルのチャージバッファーを追加します。

チューブをロッカーに移し、摂氏4度で15分間攪拌してから、前と同じように再び遠心分離を行います。上清を捨て、40ミリリットルのバッファーBをチューブに加えます。チューブをロッカーに移し、摂氏4度で5分間攪拌してから、チューブを再び樹脂で遠心分離します。

MOGタグタンパク質を精製するには、可溶化したタンパク質の全量をニッケル樹脂を含む最初のチューブに移します。混合後、チューブを4°Cのロッカーに水平に1時間置きます。チューブを4500倍gで4°Cで8分間セントラルフュージングした後、この上清をニッケル樹脂の2本目のチューブに移し、前回と同様にインキュベートします。

その間に、ニッケル樹脂を40ミリリットルのエボリューションバッファーの最初のチューブに再懸濁し、チューブを摂氏4度のロッカーに水平に5分間置いてから、以前と同様に遠心分離します。言及されたMOGタグタンパク質を含む上清を、精製MOGタグタンパク質を標識した250ミリリットルのボトルに移します。このボトルは摂氏4度に保ちます。

溶出ステップごとに、得られた上清をこのボトルにプールします。最初のチューブに存在するニッケルに40ミリリットルのストリップバッファーを追加し、ロッカーに摂氏4度で5分間水平に置きます。チューブを遠心分離し、上清を捨て、前と同じように上昇したニッケルを再充電します。

終了したら、最初のチューブで行ったように、2番目のチューブで前進します。可溶化したタンパク質を荷電ニッケル樹脂に合計4ラウンド吸収し、溶出すると、タンパク質の大部分が回収されます。ヘビ皮膚透析チューブを約30センチカットします。

ヘビの皮の端を3回折り、折りたたまれた端を止血剤で固定することにより、一方の端をロック止血器で固定します。ヘビの皮を希釈したMOGタグタンパク質で満たします。次に、スネークスキンの気泡をオープンエンドから押し出して、気泡を取り除きます。

最後に、2番目のロック止血器を使用してチューブのもう一方の端を密封します。次に、大きなバケツに1リットルの1 x アセテート緩衝液に4モルのグアニジンを入れます。MOGタグタンパク質を含む透析チューブの最大2つのセクションをバケツに入れます。

テープを使用して、止血器をバケツの側面に固定し、マグネティックスターバーが底で妨げられずに回転するスペースを確保します。バケツをマグネットスカートプレートの上の摂氏4度の部屋に置き、ゆっくりと回転させてオンにします。透析には最低3日かかり、緩衝液中のグアニジンの量を徐々に減らします。

チューブが無傷で始まり、端がしっかりと閉じていることを定期的に確認してください。4〜5時間後、1リットルの1 x acetateバッファーを透析バケットに加えます。このプロセスを4〜5時間ごとに合計3回繰り返して、バケツに合計4リットル

バケツ内のバッファーの半分を捨てた後、1リットルの1×アセテートバッファーを補充し、チューブと攪拌棒をセットします。最後に、バケツ内の4リットルの全容量を4リットルの新鮮な1 xアセテートバッファーと交換し、4〜5時間攪拌します。最良の結果を得るには、タンパク質が集中する日にこの手順を実行します。

MOGタグタンパク質を濃縮するには、ペンにアルミホイルを敷き、アルミホイルをPEG3350とPEG1000で1対1の比率で覆います。PEG 3350は、濃縮中のタンパク質凝集を防ぐのに役立ち、効果的な凍結保存剤です。スネークスキンチューブを含むMOGタグタンパク質をアルミホイルの上に置き、PEG8000で覆います。

これを室温で放置し、体積が推定最終体積以下になるまで定期的に体積をチェックします。濃縮プロセス中にペンが水で飽和しすぎた場合は、アルミホイルとPEGを使用して新しいパンを設定します。精製プロトコル全体で採取したタンパク質のサンプル、またはSDSページゲルで分析して純度を確認します。

31.86キロダルトンの高度に精製されたMOGタグを示す代表的なゲルが表示されます。MOGタグタンパク質が正しく折り畳まれていることを確認するために、野生型C57ブラック6マウスまたはMOGタンパク質に特異的な免疫グロブリン重鎖を発現するIgH MOGマウスのいずれかのリンパ節由来のCD19陽性、CD4陰性、9つのB細胞へのMOGタグタンパク質の結合をフローサイトメトリーを用いて評価した。このプロトコルは、開始から終了まで最低10日かかります。

単離手順全体を通じて、タンパク質を追跡し、保持する必要があるものと廃棄する必要があるものを覚えておくことが重要です。ニッケル樹脂の充電に使用される硫酸ニッケル六水和物を使用する場合は、非常に危険であり、吸入や皮膚や目との接触を防ぐための予防策を講じる必要があることを忘れないでください。このビデオを見れば、MOGタグタンパク質を自分で生成し精製する方法を十分に理解できるはずです。

精製されたMOGタグタンパク質は、完全なフロイントのアジュバントで乳化し、EAEを誘導するための免疫化として使用できます。MOGタグによって誘導されるEAEは、CD4細胞、CDAT細胞、B細胞などの複数の細胞型の中枢神経系自己免疫への関与を研究するために使用できます。MHCが制限されている短いペプチドとは異なり、タンパク質抗原はマウスの任意の系統で使用できます。