Name: 実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のためのシンプルで効率的な生産とマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 学ぶマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の簡便な精製法と実験的自己免疫性脳脊髄炎誘導技術。標準的な免疫学研究室の設備で大規模タンパク質生産が可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、カナダの多発性硬化症協会からの助成金によって支援されました。RWJは、Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Awardを受賞しています。

<ol><li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Baxter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+application+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).</li>
<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+%28MOG35-55%29+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T-cell+epitopes+of+MOG+reside+in+its+transmembrane+and+cytoplasmic+domains+in+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).</li>
<li>Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+recognition+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+autoantigen+depends+on+immunization+with+protein+rather+than+short+peptide%2C+while+B+cell+invasion+of+the+CNS+in+autoimmunity+does+not%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not.</a> J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).</li>
<li>Barun, B., Bar-Or, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+sclerosis+with+anti-CD20+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies.</a> Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).</li>
<li>Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+encephalitogenicity+of+recombinant+human+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).</li>
<li>Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+and+human+myelin+oligodendrocyte+glycoproteins+induce+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+different+mechanisms+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice.</a> J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+additives+on+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effect of additives on protein aggregation.</a> Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).</li>
<li>Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+Infiltration+of+the+Spinal+Cord+by+Non-Classically+Activated+B+Cells+is+Associated+with+Chronic+Disease+Course+in+a+Spontaneous+B+Cell-Dependent+Model+of+CNS+Autoimmune+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease.</a> Front Immunol. 6, 470(2015).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
<li>Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+S.Tag+fusion+system+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The S.Tag fusion system for protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).</li>
<li>Amor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epitopes+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+for+the+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL+and+Biozzi+AB%2FH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice.</a> J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).</li>
<li>Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+profiling+of+tobacco+etch+virus+protease+using+a+novel+fluorescence-assisted+whole-cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay.</a> PLoS ONE. 6 (1), e16136(2011).</li>
<li>Litzenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+producing+demyelinating+autoantibodies%3A+development+and+function+in+gene-targeted+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice.</a> J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).</li>
<li>Zhang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+Escherichia+coli-expressed+human+thymosin-alpha1+using+affinity+chromatography+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography.</a> Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).</li>
<li>Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+protein+production+levels+in+Escherichia+coli+with+a+strong+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter.</a> FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).</li>
<li>Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+T+cells+exacerbates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+mouse%2C+but+not+rat%2C+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens.</a> J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).</li>
<li>Blommel, P. G., Fox, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+approach+to+improving+large-scale+production+of+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease.</a> Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここでは、MOG タグタンパク質および方法MOG タグタンパク質から純粋MOG 1-125を生成するための製造のためのプロトコルを記載しています。このプロトコルは、両方の標準的なHisタグベースのタンパク質精製方法、ならびに古いMOGベースのタンパク質15の世代のために以前に記載されたプロトコルに基づいています。それはここで説明されていないが、MOG タグタンパク質の主な用途は、タンパク質抗原での免疫を介してEAEを誘導することです。 EAEは、MOG タグタンパク質と互換性のあるマウスに誘導される様子を説明するプロトコルは、参考文献3に記載されています。我々は以前MOG タグ由来MOG タグまたはMOG 1-125での免疫がないだけで、標準のMOG 35-55ペプチドと比較して大きく、脊髄の炎症および脱髄とCNS自己免疫疾患だけでなく、その病原性のIgH MOG B細胞股関節...

MSは、ミエリンに向けられた自己免疫応答によって駆動されると考えられているCNSの慢性炎症および神経変性によって特徴付けられるヒト疾患です。時間の経過とともにミエリンおよび軸索の損失は、認知および運動機能1の緩やかな衰退につながります。 「実験的自己免疫性脳脊髄炎」は、CNSミエリンに向け自己免疫疾患の動物モデルのための包括的な用語です。ヒトMSと同様に、EAEは、典型的には、CNSの免疫細胞の浸潤を特徴とし、場合によっては、脱髄2れます。しかし、任意のEAEモデルは、部分的に人間のMSに似ている度合いは、使用される種または株に、基礎となる抗ミエリン自己免疫応答の複雑さによって異なります。 抗ミエリン自己免疫は実験的に、いくつかの方法で誘導することができるが、今日使用される最も一般的な方法は、免疫優性CD4を模倣するアミノ酸の短いペプチドでマウスを免疫化することです<sミエリンタンパク質の&gt; + T細胞エピトープアップ。これは、病原性応答を誘導するための最小要件を示しています。おそらく、これらの中で最も一般的には、C57BL / 6マウス3にEAEを誘導するために使用されるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG 35-55）に由来する21アミノ酸ペプチドです。しかし、いくつかの実験目的のためには、より大きなタンパク質抗原で免疫化することが望ましい、あるいは必要であり、実際にこれにはいくつかの利点が短いペプチドを用いた免疫化の上にあります。タンパク質全体または特定のドメインのいずれかを表す、より大きなタンパク質抗原は、異なる種であっても、複数の近交系マウスでのプレゼンテーションのために正常に処理されるか、またはすることができながら、まず、MHC制限のため、短いペプチドは、通常の株の非常に限られた範囲でのみ有効です4。第二に、より大きなタンパク質抗原は、抗原認識にリンパ球の多くの種類を組み込んだより複雑な免疫応答を誘導するのではなくlimitinすることが可能ですCD4 + T細胞へのG抗原認識。例えば、それらのB細胞受容体（BCR）を介したB細胞は、全体ではなく、処理タンパク質と直接相互作用します。我々と他の人は、MOG 35-55免疫によって活性化されたB細胞は、MOGタンパク質5を認識しないことが示されました。 B細胞は、最近、ヒトMS 6に病原性の役割を果たすことが実証されたので、自己免疫病理にB細胞を組み込むEAEモデルは、ますます重要です。 EAEを誘導するために、より大きなタンパク質抗原を使用することの利点にもかかわらず、そのようなタンパク質のいくつかの市販の供給源が残ります。 MOG 35-55のような短いペプチドは、非常に迅速かつ比較的安価に合成することができるが、実際に、MOGタンパク質を商業オプション購入に限定されず、コスト実質的です。それにもかかわらず、MOGの細胞外ドメイン（MOG 1-125に ）自分自身を生成するために、研究グループのために利用可能ないくつかの発現ベクターがあります。 HoweveR、我々は文献で同定した発現系の全てを、以降、より効率的な発現系7で置換されている古い技術に基づいています。また、大部分はラットまたはヒトMOG 8に基づいています。マウスにおける自己免疫のいくつかの研究では、マウスMOG自己抗原に基づいて抗原が好ましいです。最後に、コマーシャルまたは発現ベクターのいずれかと、我々が同定したすべてのMOG系タンパク質は、MOG 1-125ベースに追加のアミノ酸を含む融合タンパク質です。これらは、同様に私たちは識別できなかった機能を備えているの多くを精製するためのタグと通常は他の配列が含まれます。 これらの制限に対処するために、我々は、MOGタンパク質5の既知の不溶性に対処するためにチオレドキシンを含むタグに融合したマウスMOGの細胞外ドメインに基づく新規な融合タンパク質を生成しました。タグ配列はまた、精製およびTEVプロテアーゼCLE用の6xHis配列を含みます必要に応じて、すべてのタグ配列を完全に除去することが可能avageサイト。これは、我々が純粋なMOG 1-125蛋白質を生成するの知っている唯一の方法です。タンパク質の大量生産を容易にするために、MOG 1-125配列を細菌発現のためにコドン最適化し、MOG タグ融合タンパク質は、PET-32発現系に挿入しました。ここでは、最も免疫学研究所で使用可能な非専門的な装置を使用して、詳細にMOG タグタンパク質を生成し精製するプロトコル、及び純粋MOG 1-125を記述する。

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli- pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot lab</td><td></td><td>これらの細菌は、MOGtagタンパク質を作るために必要です。これらの細菌のグリセロールストックは、ご要望に応じてご利用いただけます。</td></tr><tr><td>LBブロスミラー</td><td>バイオショップ</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr>アン<tr><td>ピシリン</td><td>バイオベーシック</td><td>AB0028</td>粉末<td>を50%エタノール/ 50%H2Oに100mg / mlで再コンシスチュレートします。 -20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>粉末を1MでH2Oに再結合し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>鶏卵リゾチーム</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>H2O で 50 mg/mL で再構成し、-80°C で保存します。</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Σ</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>寿命技術</td><td>20012-027</td><td>市販のリン酸塩緩衝生理食塩水は必要なく、標準的な実験室で作られたリン酸塩緩衝生理食塩水で十分です。</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Bioshop</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>グアニジン-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>品質は98%以上の純度でなければなりません。</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>バイオショップ</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>ニッケル (II) 硫酸塩</td><td>バイオショップ</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>His バインド樹脂</td><td>EMD ミリポア</td><td>69670-3</td><td>20% エタノール 80% H2</>O で 4 >C</td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>市販のアルコール</td><td>P016EAAN</td><td>必要に応じて水で希釈します。</td></tr><tr><td>氷河酢酸</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム三水和物</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン標準</td><td>バイオ・ラッド</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>バイオ・ラッド タンパク質アッセイ 色素試薬濃縮</td>物 <td>バイオ・ラッド</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩二水和物</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>バイオショップ</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW スネークスキン透析チューブ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td>M3148-25ml</td><td>この試薬は、ヒュームフードの外で取り扱わないでください。</td></tr><tr><td>AcTEVプロテアーゼ</td><td>lifetechnologies12575-015</td><td></td>独自の<td>TEVプロテアーゼを生成するには、(https://www.addgene.org/8827/)を使用して達成し、参照17</td></tr>ポリエチレン<tr><td>グリコール3350</td>バイオ<td>ショップ</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr>ポリエチレン<tr><td>グリコール8000</td>バイオ<td>ショップ</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr>ナン<tr><td>クMaxiSorp平底96ウェルプレート</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>フィッシャー科学</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Eonマイクロプレート分光計</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>この装置は、Gen5データ分析ソフトウェアを使用しています。</td></tr><tr><td>Gen5 データ解析ソフトウェア</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質脱塩カラム</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>プレキャスト 12% ポリアクリルアミドゲル</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>迅速染色試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>ゲルドック EZ イメージャー</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>白色光 サンプルトレイ</td><td>bio-rad</td><td>1708272&nbsp;</td><td>gel dock EZイメージャーと一緒に使用して、クマシーブルーの染色に使用します</td></tr><tr><td>プロテインラダー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のためのシンプルで効率的な生産とマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の精製

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)の慢性炎症性疾患で、ミエリンを標的とする自己免疫反応の結果として発生すると考えられています。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、CNS自己免疫疾患の最も一般的な動物モデルであり、通常、ミエリンタンパク質の免疫優性CD4+ T細胞エピトープを表す短いペプチドによる免疫化によって誘発されます。しかし、B細胞は未加工のタンパク質を直接認識し、短いペプチドで免疫しても、天然のタンパク質を認識するB細胞は活性化されません。MSにおけるB細胞枯渇療法の最近の臨床試験では、ヒトの疾患を引き起こすB細胞の役割が示唆されているため、自己抗原のB細胞認識を組み込んだ動物モデルが緊急に必要とされています。そのために、マウス版ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)の細胞外ドメインを、精製用のHisタグと溶解性を向上させるチオレドキシンタンパク質(MOGタグ)のN末端融合体を含む新しい融合タンパク質を作製しました。タバコエッチングウイルス(TEV)プロテアーゼ切断部位を組み込んで、すべてのタグ配列の除去を可能にし、純粋なMOG1-125細胞外ドメインのみを残しました。ここでは、標準的な実験装置のみを使用して、純粋なMOGタグまたはMOG1-125を大量に製造する簡単なプロトコルについて説明します。このプロトコルは、一貫して200 mgを超えるMOGタグタンパク質を生成します。MOGタグまたはMOG1-125のいずれかによる免疫は、ネイティブマウスMOGを認識する病原性B細胞を含む自己免疫応答を生成します。

精製が完了すると、サンプルがステップ1.4、2.1、3.4に回収し、ステップ6.4からの最終生成物は、タンパク質ゲル（ 図3A）上で実行する必要があります。 MOG タグは、最初のT O / Nのサンプルで31.86 kDaのバンドとして表示されますが、ないT 0、および最終的に純粋な生成物にのみバンドでなければならない必要があります。 MOG タグタンパク質が正しく折り畳まれているかどうかをテストするために、MOG タグタンパク質は、FACSによってMOGタンパク質特異的B細胞を標識するために使用することができます。 1で標識マウスリンパ球：Hisタグおよび蛍光標識された第三の抗IgG1抗体に対して向けられた二次抗体と共にMOG タグ 1000希釈、MOG特異的B細胞（ 図3B）を同定することができます。あるいは、MOG タグが直...

私たちは、マウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を含む融合タンパク質を大量に生成し精製するための基本的な実験装置のみを使用した簡単なプロトコルを記述します。このタンパク質は、T細胞とB細胞の両方によって引き起こされる実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するために使用できます。

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

本プロトコルの目的は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を誘発するために使用される、髄鞘形成細胞糖タンパク質（MOG）の細胞外ドメインに基づくタンパク質を生成することです。本プロトコルにより、あらゆる研究室でEAE誘発用の抗原としてMOGタンパク質を製造することが可能になります。本プロトコルの主な利点は、特殊なタンパク質ハンドリング装置を必要とせず、ほぼすべての免疫学研究室に備わっている標準的な装置で実施できる点にあります。このプロトコルはマウス由来のMOGタグタンパク質用に最適化されていますが、精製用のヒスタグを組み込んだ他のMOGタンパク質発現システムでも適用可能です。滅菌済みブイヨン5 mLにBL 21 MOGタググリセロールストックを接種し、37 °C、200 RPMで一晩培養します。滅菌LB 500 mL containing 500 mLを入れた2本の500 mLフラスコそれぞれに、100 mg/mLアンピシリンを500 µL加えます。一晩培養した培養液を1 mLずつ、2本のLBブイヨンフラスコにそれぞれ移します。37°C、200 RPMで5時間、または光学密度が0.6に達するまでインキュベートします。目的の細胞密度に達したら、各培養フラスコに1 M IPTGを0.5 mL加えます。フラスコを37°C、200 RPMで4時間インキュベートした後、室温、75 RPMで一晩インキュベートします。培養物を高速遠心分離対応の250 milliliterボトルに均等に分注し、以降はボトルを氷上で保持します。4 °Cで22, 000 ×g、15分間遠心分離し、細菌細胞をペレット化します。すべての細菌ペレットを、合計30 millilitersのライセートバッファーで再懸濁し、合わせてまとめます。この容量を、高速遠心分離可能な底面が丸い 50 milliliter チューブに移します。このチューブを 30 degree Celsius のウォーターバスで 30 分間インキュベートします。インキュベーション中に、チューブを2回振り、細胞を再懸濁させてください。インキュベーション後、チューブを氷上に移動し、溶液を20 kilohertz、振幅70%で、3秒間のオンと3秒間のオフを1セットとして5パルス分、ソニケーションします。この5パルスの処理を計6回繰り返し、各ラウンドの間は氷上で溶液を冷却させます。次に、溶液を4 °Cで24, 000 ×gで15分間遠心分離し、ペレットを30 millilitersのバッファーAに再懸濁して、4 °Cで3時間インキュベートします。インキュベーション後、前述と同様に氷上で溶液をソニケーションし、その後、溶液に17.2 gramsのグアニジンHClを加えます。MOGタグタンパク質を可溶化させるため、サンプルを氷上で1時間インキュベートします。ニッケル樹脂をチャージおよび平衡化させるため、まず樹脂を含む各チューブに40 millilitersの水を加えて樹脂を洗浄します。チューブをロッカーの上に水平に置き、4 °Cで5分間攪拌します。完了後、チューブを4°Cで4500 ×g、8分間遠心分離します。ペレットを乱さないよう、ピペッティングで上清を除去します。その後、各チューブに40 mLのチャージバッファーを加えます。チューブをロッキングミキサーに移し、4 °Cで15分間攪拌した後、前と同様に再度遠心分離を行います。上清を捨て、チューブに40 mLの緩衝液Bを加えます。チューブをロッキングミキサーに移し、4 °Cで5分間攪拌した後、樹脂を含むチューブをもう一度遠心分離します。MOGタグタンパク質を精製するため、可溶化したタンパク質の全量を、ニッケル樹脂が入った1本目のチューブに移します。混合後、チューブを水平に寝かせた状態で、4°Cのロッカーに1時間置きます。4°Cで4500 ×gで8分間遠心分離した後、この上清を2本目のニッケル樹脂チューブに移し、同様にインキュベートします。その間に、1本目のチューブ内のニッケル樹脂を40 millilitersの溶出バッファーで再懸濁し、チューブを水平にして4°Cのロッカーで5分間静置した後、前述と同様に遠心分離します。精製MOGタグ付きタンパク質とラベルを貼った250 milliliterボトルに、目的のMOGタグ付きタンパク質を含む上清を移します。このボトルを4°Cで保存します。各溶出ステップで、得られた上清をこのボトルにまとめて回収します。最初のチューブにあるニッケルに40 millilitersのストリップバッファーを加え、4°Cで5分間ロッカーを用いて水平に攪拌します。チューブを遠心分離し、上清を廃棄した後、前述の手順でニッケルレジンを再充填します。完了後、1本目のチューブと同様に2本目のチューブで操作を進めます。可溶化タンパク質を充電ニッケルレジンに吸着させ、溶出させる操作を計4回繰り返すことで、ほとんどのタンパク質を回収できます。スネークスキン透析チューブを約30 cm切り出します。スネークスキン（人工血管）の端を3回折り畳み、止血鉗子でクランプして固定します。その後、希釈したMOGタグタンパク質をスネークスキンに充填します。次に、開いている端から空気を押し出し、スネークスキン内の気泡を取り除きます。最後に、2本目のロッキング止血鉗子を使用してチューブのもう一方の端を密封します。次に、大きなバケツに1 x 酢酸緩衝液と4 M グアニジンの混合液を1リットル満たします。MOGタグタンパク質を含む透析チューブを最大2本まで、そのバケツに入れます。テープを使用して、磁気攪拌子が底で妨げなく回転できるように、止血鉗子をバケットの側面に固定します。バケットを4 °Cの室内のマグネチックスターラープレート上に置き、低速回転で稼働させます。バッファー中のグアニジンの量を徐々に減少させるため、透析には最低3日間かかります。チューブに損傷がないこと、および両端がしっかりと閉じられていることを定期的に確認してください。4〜5時間後、透析バケットに1 x acetate bufferを1 L加えます。この操作を4〜5時間ごとに繰り返し、合計3回行い、バケット内の液量も合計で4 Lとなるようにします。バケット内のバッファーの半分を廃棄した後、1x 酢酸バッファーを1リットル補充し、チューブとスターバーをセットします。最後に、バケット内の4リットル分すべてを新鮮な1x 酢酸バッファー4リットルに交換し、4〜5時間撹拌します。最良の結果を得るために、このステップはタンパク質濃縮を行う当日に実施してください。MOGタグタンパク質を濃縮するために、ペンの内側にアルミホイルを敷き、そのアルミホイルをPEG 3350とPEG 1000を1:1の比率で混ぜたもので覆います。PEG 3350は、濃縮時のタンパク質の凝集を防ぐのに役立ち、効果的な凍結保存剤となります。MOGタグタンパク質が入ったスネークスキンチューブをアルミホイルの上に置き、PEG 8000で覆います。これを室温で静置し、液量が推定最終容量と同等またはそれ以下になるまで定期的に確認します。濃縮過程でペンが水で過飽和になった場合は、アルミ箔とPEGを用いて新しいパンを準備してください。精製プロトコルの各段階でタンパク質のサンプルを採取するか、SDS-PAGEゲルに供して純度を確認します。31.86 kilodaltonsの位置に高度に精製されたMOGタグを示す代表的なゲルの画像が表示されています。MOGタグタンパク質が正しく折りたたまれているかを確認するため、野生型C57 black sixマウスまたはMOGタンパク質特異的な免疫グロブリン重鎖を発現するIgH MOGマウスのリンパ節由来の、CD19陽性かつCD4陰性のB細胞に対するMOGタグタンパク質の結合をフローサイトメトリーを用いて評価しました。本プロトコルの全行程には、最低10日間を要します。分離手順全体を通して、タンパク質を追跡し、何を保持し、何を廃棄すべきかを常に把握しておくことが重要です。ニッケル樹脂のチャージに使用する硫酸ニッケル六水和物は極めて危険であり、吸入や皮膚、目への接触を防ぐために十分な注意を払うことを忘れないでください。このビデオを視聴することで、MOGタグタンパク質の作製および精製方法について十分に理解できたはずです。精製後、MOGタグタンパク質をコンプリートフロイントアジュバントで乳化させ、EAEを誘導するための免疫に使用することができます。MOGタグによって誘導されたEAEは、中枢神経系の自己免疫におけるCD4細胞やCDAT細胞、B細胞などの複数の細胞種の関与を研究するために利用可能です。MHC制限がある短鎖ペプチドとは異なり、タンパク質抗原はいかなるマウス系統においても使用することができます。

simple-efficient-production-purification-mouse-myelin-oligodendrocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、マウスモデルで実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するための抗原アジュバントエマルジョンを生成する効率的な均質化技術を示しています。このエマルジョンは、水相に自己抗原であるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)を含み、不活化病原菌を含む連続的な油相に囲まれています。エマルジョンは、抗原の持続的な放出を確保し、免疫応答を持続させます。...

自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原アジュバントエマルジョンの調製

このビデオは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質と不活性化結核菌の組み合わせを注入することにより、マウスモデルで実験的な自己免疫性脳脊髄炎を誘発する方法を示しています。このモデルにより、研究者は疾患のメカニズムを研究し、治療的介入をテストすることができます。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

このビデオは、ミエリン由来のペプチドにアジュバントを注入して自己反応性T細胞を活性化し、脳に移動することにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発する方法を示しています。百日咳毒素は、血液脳関門の透過性を高めるために投与され、これらのT細胞や他の免疫細胞が脳に入ることを可能にします。これらの免疫細胞は脱髄を引き起こし、神経伝達の障害とEAEの発症につながります。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の生成

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を使用して多発性硬化症のマウスモデルを確立しています。マウスにニューロンペプチドとアジュバントを含むエマルジョンを注入すると、自己反応性T細胞を活性化する免疫応答が引き起こされます。これに続いて、百日咳毒素(PTX)を注射して血液脳関門の透過性を高め、自己反応性T細胞が脳に浸潤できるようにします。この浸潤は、最終的にミエリン損傷をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、多発性硬化症の脱髄状態を模倣しています。...

出典: Jain, RW, et al.実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のためのマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質の簡単で効率的な生産と精製J. Vis.

組換えミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の単離と精製

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症の確立された動物モデルである。 C57BL / 6マウスは、中枢神経系における自己反応性免疫細胞によって引き起こさ昇順弛緩性麻痺をもたらす、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）ペプチド35-55（MOG 35-55）で免疫する。疾患の誘導およびモニタリングのためのプロトコルを説明する。...

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG<sub&gt; 35〜55</sub&gt;）C57BL / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘発

体外培養の細胞の迅速かつ特定の分離を可能にするプライマリ マウス オリゴデンドロ...

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

本プロトコルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を使用し、臨床スコアリングシステムを使用して疾患プロセスをモニタリングするマウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を記載しています。実験的自己免疫性脳脊髄炎関連症状は、マウス大腿骨マイクロコンピューター断層撮影分析とオープンフィールドテストを使用して分析され、疾患プロセスを包括的に評価します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と多様な評価指標

多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するために、マウスを自己抗原および完全なフロイントアジュバントを含む油中水型エマルジョンで免疫する。これらのエマルジョンの調製にはいくつかのプロトコルがありますが、ここでは、エマルジョン調製のための迅速で単純で標準化された均質化プロトコルを示します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原/アジュバントエマルジョンを調製するための迅速、簡便、標準化されたホモジナイズ法

これまでのところ、すべての主要な中枢神経系常在細胞タイプを同じマウスから同時に単離するためのプロトコルは、満たされていない需要です。プロトコルはneuroinflammationの間に複雑な細胞ネットワークを調査し、同時に必須のマウス数を減らすために素朴で、実験的な自己免疫の脳脊髄炎のマウスで適当なプロシージャを示す。...

成体自己免疫性脳脊髄炎マウスからの主要な中枢神経系常在細胞型の同時単離

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)の動物モデルであり、ヒトの疾患と強力な体液性自己免疫応答を共有しています。ここでは、EAE免疫マウスの血清中の自己抗体を定量するためのシンプルで柔軟なELISAプロトコルを報告します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するマウスにおける自己反応性抗体の定量化

学ぶマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の簡便な精製法と実験的自己免疫性脳脊髄炎誘導技術。標準的な免疫学研究室の設備で大規模タンパク質生産が可能です。

実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のためのシンプルで効率的な生産とマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の精製

さらに動画を探す