Name: フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーを用いた膜タンパク質の細胞表面発現定量法。tsA-201細胞で組換えイオンチャネルを発現させ、遺伝子変異による心臓不整脈のメカニズム解明に応用できます。

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私たちは、専門知識を共有し、フローサイトメトリーと細胞ソーティングプラットフォームへのアクセスを許可してくださったSerge Sénéchal氏とJacques Thibodeau博士に感謝します。この作業は、カナダ衛生研究所からの運営助成金130256、カナダ心臓脳卒中財団からの助成金、および「モントリオール心臓病研究所」からのL.P.への支援によって完了しました。

1.二重タグ付きDNA構築<ol><li>部位特異的突然変異誘発（ 図3B）20によってD676とR677の間のCa Vの α2δ1の細胞外リンカー中のHAエピトープ（YPYDVPDYA）を挿入します。フォワードプライマーgccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACCを使用し、プライマーacatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTCを逆にします。 </li><li> SacI及びSalI部位の間にmCherryを（ 図3B）20のN末端に融合タンパク質を発現するように設計された哺乳動物pmCherry-N1発現ベクターにタグ付けされたHAのCa Vの α2δ1のcDNA配列をサブクローニング。 注：適切なチャネルの機能は、標準的な電気生理学的方法24を用いて、対照構築物で試験する必要があります。 </li></ol> 2.リポソーム媒介一過性トランスフェクション（30分、すべての手順は、層流フードの下で実行されています） <ol><li> 1日目：TSA-201細胞（またはHEKT）の半分の百万をプレートに10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン - ストレプトマイシン（PS）培養培地を補充したダルベッコ高グルコース最小必須培地（DMEM-HG）2mLで35mm培養皿。標準的な血球計を用いて細胞を数えます。トリパンブルーを用いて細胞試料の画分から細胞生存率を評価します。プレートに十分な細胞は、トランスフェクションの時点で90％コンフルエンスに到達します。 </li><li> 2日目：PSのない新鮮予め温めた（37℃）培地の2ミリリットルでの変更の培地。 </li><li>各トランスフェクションサンプルについて、2 1.5ミリリットルのチューブを準備します。管1では、低血清培地250μlのDNAの4μgのを希釈。チューブ2には、250μlの血清減少培地でのリポソーム媒介トランスフェクション試薬を10μlを混合します。使用前に穏やかにトランスフェクション試薬を混ぜます。 </li><li>室温で5分間インキュベートします。 </li><li>チューブ1とチューブ2の内容を組み合わせて、穏やかに混合し、室温で少なくとも20分間インキュベートします。 </li><li>リポソームを追加/ DN静かに培養した細胞との複合体が混在する培養皿を揺すります。 </li><li> 24時間、5％CO 2雰囲気下、37℃でインキュベートします。 </li></ol>フローサイトメトリーのための細胞の3染色（3時間） <ol><li>細胞サンプルを準備します<ol><li> 3日目：慎重に培養皿から培地を除去し、予め温めておいた（37℃）0.05％トリプシン1xのEDTA（エチレンジアミン四酢酸）を400μlで細胞を洗浄。 </li><li>トリプシンEDTAの400μlを添加して、細胞がディッシュから剥離することを可能にするために5分間、5％CO 2雰囲気下、37℃で皿をインキュベートします。 </li><li> PSなしで冷たい培地の1ミリリットルを追加することにより、酵素消化を停止し、静かに4-5回ピペッティングすることにより、表面からのすべてのセルを洗い流します。細胞死を減らすために消化および過ピペッティングは避けてください。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブに細胞を収集し、直ちに氷上に置きます。氷冷溶液を使用して、内在化を防止するために、4℃で細胞を維持します表面抗原。蛍光シグナルの光退色を制限するために照明を減らします。 </li><li> 4℃で5分間、400×gで遠心分離管。慎重に吸引し、上清を捨てます。 </li><li>再懸濁単一細胞懸濁液を調製し、リン酸緩衝生理食塩水1×1mlの（PBS）中でペレット。 </li><li>簡単に言えば、非常に穏やかにチューブをボルテックスし、完全培地を除去するための手順3.1.5と3.1.6を繰り返します。 </li><li> 1×PBS600μlの中にペレットを再懸濁し、3×10 6細胞/ mlの最小値に細胞濃度を調整します。 </li><li>細胞外および細胞内染色のための2つの新しい1.5 mlチューブに細胞を分割します。非特異的な染色からの特異的染色を区別するために適切なコントロールを含めます。 注：アイソタイプコントロール抗体は、バックグラウンド染色のレベルを評価するのに役立ちますし、理想的には、各一次抗体の宿主種、アイソタイプおよびフルオロフォアと一致する必要があります。同じでアイソタイプコントロールとコンジュゲート抗体を使用してくださいタンパク質濃度。 </li></ol></li></ol><img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54732/54732table1.jpg" /> 表1： 非透過処理し、透過処理した細胞のためのフローサイトメトリー実験の対照試料各実験は、以下の陰性対照含める必要があります：。（1）非トランスフェクト細胞（抗体なし、アイソタイプを持つ又は共役抗体とを）。 （2）構成的蛍光細胞内蛍光色素なしのプラスミドにサブクローニング目的のタンパク質をトランスフェクトした細胞（pCMV-のCa Vα2δ1-HA）または二重にタグ付けされた建設（pmCherry-のCa Vの α2δ1とおよびアイソタイプまたはで、抗体なしでインキュベートしました結合抗体）。単色コントロールは蛍光色素、発光重なりを補償するために使用されます。同じコントロールは、非透過性のために実行し、実験の各シリーズに条件を透過処理しています。 <ol start="2"><li>無傷の細胞表面染色生細胞<ol><li>アリコート1.5ミリリットルチューブで1×10 6細胞/100μlの。 </li><li>ミリリットルを5μg/でFITC結合モノクローナル抗HA抗体を追加し、45分間、4℃の暗所でロッカープラットフォーム（200回転）上で細胞をインキュベートする前に渦。 注：抗体の最適な濃度は、予備滴定実験で決定した（ 図4）。 </li><li>暗いから細胞を除去し、1×PBS /チューブの900μlを添加します。 4℃で5分間、400×gで遠心分離します。 </li><li>上清を吸引し、4℃で5分間、400×gで1×PBS、ボルテックスと遠心機の1ミリリットル中にペレットを再懸濁。 </li><li>未結合抗体を除去するために二回の洗浄（ステップ3.2.4）を繰り返します。非共役一次抗体が使用される場合、適切な二次抗体とインキュベートします。 </li><li>最終洗浄後、1×PBS500μlの細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーチューブを流れるmlの5中の単一細胞懸濁液を移します。セルをキープサンプルを実行するまで4℃で暗所での。 </li><li>フローサイトメーターでサンプルを実行します。最良の結果を得るために、できるだけ早くと遅くとも24時間後より、フローサイトメーターで細胞を分析します。 </li></ol></li><li>細胞内染色：固定、透過処理、および染色<ol><li> 4℃で5分間、400×gで小分けし、1×10 6細胞/ 1.5 mlチューブと遠心分離機で100μlの。 </li><li>在庫から直接固定-透過処理溶液100μlに上清および再懸濁細胞を捨てます。 </li><li> 20分間4℃で暗所でインキュベートします。 </li><li> （蒸留H 2 Oで10倍の透過性、洗浄緩衝液を希釈）新たに調製した1×透過性洗浄緩衝液100μlを追加します。 4℃で5分間、400×gでテーブル遠心機を用いて渦土砂細胞。 </li><li>吸引し、上清を捨てます。 </li><li>繰り返しは、3.3.4と3.3.5を繰り返します。 </li><li> 5でFITC結合モノクローナル抗HA抗体を追加/ mlの100 1X透過性洗浄バッファーμLと、4℃で30分間、暗所で細胞をインキュベートする前に、ボルテックスしました。 注：細胞内染色は、細胞表面染色のために使用されるものと同様の手順に従って行われます。サポニン媒介細胞透過は、したがって、細胞内染色中のサポニン一定の存在下で細胞を維持するために1×パーマ/洗浄緩衝液で1×PBSを交換することが重要である、しかしすぐに可逆過程です。 </li><li>暗いから細胞を除去し、100μlの透過性、洗浄バッファーを追加します。 4℃で5分間、400×gで遠心分離します。 </li><li>吸引し、慎重に上清を、4℃で5分間400×gで100μlの透過性、洗浄緩衝液、ボルテックスと遠心機でペレットを再懸濁。 </li><li>未結合抗体を除去するために洗浄（ステップ3.3.9）1より多くの時間を繰り返します。 </li><li>最終洗浄後、1×PBS500μlの細胞を再懸濁し、罪を転送管サイトメトリー5mLの流れにGLE細胞懸濁液。フローサイトメーター内に試料を注入するまで4℃で暗所で細胞を保管してください。 </li><li>フローサイトメーターでサンプルを実行します。できるだけ早くしかし、遅くとも1週間よりも染色後のフローサイトメーター上で固定したサンプルを実行します。同じ日に非透過処理し、透過処理した細胞を実行します。 </li></ol></li></ol> 4.フローサイトメトリー<ol><li>セルソーターデイリーセットアップフローサイトメーター<ol><li>フローサイトメトリーソフトウェアをオンにします。機器設定のビーズを使用することによって（ すなわちレーザーと光学系は仕様に実行され、レーザーおよびフローセルが正しく整列されている）、最適な機器性能を保証するために、セルソーターフローサイトメーターを、実験キャリブレーションとセットアップの前に。 </li><li> 20 psiのシース圧で100μmのノズルを使用してください。 注：ノズルがベンチフローサイトメーター上で変更する必要はありません。 </li><li>機械製造に応じてサイトメーターの流量を設定しますER仕様。極めて高い流量は、蛍光の変化の検出感度を低下させます。 </li><li>黄緑色レーザー（mCherryをを励起する561 nm）を（フルオレセインIsothiocayanateまたはFITCを励起するために488 nm）の青を選択します。 530/30 nmを用いてそれぞれ20分の610 nmのバンドパスフィルターを用いてFITCとmCherryを蛍光レベルを収集します。 </li><li>リニアスケールを用いて、非染色細胞のための側方散乱（SSC）ドットプロット対前方散乱（FCS）を取得。ドットプロットの左下の象限に細胞を可視化するために、各検出器の増幅を調整します。 </li></ol></li><li>無傷の非透過性細胞のサンプル・レディング<ol><li>このように無傷の細胞に蛍光シグナルを制限し、細胞破片および細胞凝集体を除く、分析される細胞の周りに自由形式の輪郭を描くことで、ライブ非透過性細胞のためのP1gateを設定します。 注：ライブ/デッド排除色素は生細胞にゲートの配置を容易にするために使用することができます。レコードに10,000事象を設定します。停止ゲートP1インチ必要であれば、イベントの大きな数値に設定してください。 </li><li>非染色細胞のベースライン自家蛍光を検出するために、FITC 2パラメータ等高線図対mCherryをを取得します。負の値を示し、集団25の間の解像度を向上させるために、双対数スケールを使用してください。ログ蛍光強度プロットの最初の10台の下部内に未染色陰性細胞を設定するには、各検出器の電圧を調整します。 </li><li> 4.1.5および4.1.6に設立された設定を使用して、すべての無傷の非透過処理のサンプルを取得し、蛍光検出器でFSC、SSCおよび信号を収集します。 </li><li>エクスポートおよび*保存.fcsファイルを解析ソフトウェアフローサイトメトリーを用いた分析のために使用されます。 </li></ol></li><li>透過処理した細胞のサンプル・レディング<ol><li>透過処理試料中の生細胞を選択し、4.1.5と4.1.6に示すように、FSCとSSCの電圧を調整するために、P1のゲートを移動します。 </li><li>すべての透過処理のサンプルを取得し、FSC、SSC aを集めます蛍光検出器でND信号。 </li><li>エクスポートおよび*保存.fcsファイルを解析ソフトウェアフローサイトメトリーを用いた分析のために使用されます。 </li></ol></li><li>データ分析<ol><li> 4.2.4と4.3.3に保存された解析ソフトウェアと輸入* .fcsファイル、フローサイトメトリーを起動します。 </li><li>ワークスペースウィンドウにリストされた最初のサンプルをクリックします。チューブID番号にちなんで名付けられた新しいウィンドウが自動的に開きます。 FSC対SSCのプロットでゲーティングプロセスを開始します。生細胞の周りに楕円形のアイコンを使用してゲート（P1）を描画し、任意の残骸、死細胞、または生きている細胞とは異なる前方散乱および側方散乱を持つ凝集体を排除</li><li> FITC（X軸）生細胞の蛍光強度対mCherryを（y軸）の2つのパラメータの等高線図を描画するために、x軸上に第一のクリック及びFITCチャネルを選択し、Yをクリック - 軸とPE-mCherryをチャンネルを選択します。のエッジで象限マーカーを配置する「クワッド」アイコンをクリックしてください各蛍光チャネルにおけるutofluorescent細胞。 注：FITCとmCherryを陽性細胞の周りに設定されゲートがP2ゲートです。蛍光陰性細胞集団は、P3のゲートと呼ばれます。この記事で使用する代表的なゲーティング方法については、 図5を参照してください。 </li><li> P2とP3のゲートを選択して、元のワークスペースウィンドウで、「追加の統計」アイコンをクリックしてください。 「カウント」（陽性細胞の数）をクリックして、オプションのリストの中で（各蛍光色素の平均蛍光強度）を「平均」または「中央値」（各蛍光色素の蛍光強度中央値）の統計情報をクリックしてください。再び「追加の統計」アイコンをクリックします。すべてのこれらの値は自動的に元のワークスペースウィンドウに転送されます。 注：「平均」蛍光強度が正規分布に従う場合にのみ使用されます。他のすべてのケースでは、「中央値」タブをクリックします。 MFIは、このように蛍光Intensitを意味するために参照することができますYまたは蛍光強度中央値。 注：次のステップは、サイトメーターによってプローブすべてのサンプルにゲート」パラメータと統計を適用することです。 </li><li>ワークスペース]ウィンドウで、すべてのサンプルをマークされた行の上にゲートと統計パラメータをドラッグアンドドロップするには、マウスを使用しています。 </li><li> 2次元の等高線プロット（FITC対mCherryを）と非透過処理し、透過処理した細胞のヒストグラム（セルは蛍光強度カウント対）（ - B 図6A）のバッチレポートを生成します。 </li><li>ステップ4.4.4において生成された統計から、染色された細胞についての各蛍光色素の平均蛍光強度（MFI）を計算します。この値から、表面と目的のタンパク質の総発現を定量化するために染色されていない細胞から得られたMFI値を減算します。 </li><li>各蛍光団（mCherryをとFITC）（ - D 図6C）のためΔMFI値を報告します。 CAの測定ΔMFIを正規化<suB&gt; Vは、WT構築物を用いてFITCとmCherryをするために取得したΔMFI値に突然変異体を構築α2δ1。 注：蛍光強度の絶対値は、従って、抗体及びそれぞれの実験室作業者の技術力のバッチに依存急激WT構築物を用いて、変異体構築物の蛍光強度を標準化する必要性を変えることができます。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このフローサイトメトリーベースのアッセイを首尾よく蛍光標識された孔形成および電位依存性カルシウムチャネル14,22,26の、関連するサブユニットの相対的な合計と細胞表面レベルの測定に適用しました。これは、遺伝子変異の影響を調べる際に最良に使用され、このように標識された蛍光タグ付けされた野生型構築物の固有の蛍光強度は、蛍光標識されたタグなし構築物の蛍光強度よりも大きく100倍、少なくとも10であることが必要とされています。この特定の例では、本明細書に記載のmCherryを、カルシウムのVα2δ1-HA構築物は、対雑音比より大きい信号と以前に公開のCa V 1.2-HAおよびCa V 2.3-HA構築物を測定したものよりも大きなダイナミックレンジが得られました。このため、多くの考えられる理由があります。これは、Ca V＆の細胞外ドメイン中のHAエピトープのローカル環境と推測することができます＃945;2δ1タンパク質は、FITC結合抗HA抗体の信号対雑音比を最大にします。 また...

この論文は、既存のフローサイトメトリー技術を使用して組換え細胞中で発現するイオンチャネルなどの膜タンパク質の相対的な細胞表面発現を報告するために信頼性のあるアッセイを提供します。イオンチャネルは、細胞膜を横切るイオンの流れをゲート制御することによって電気信号を制御する責任があるポア形成膜タンパク質です。これらは、活性化メカニズム、自然、そしてそれらがローカライズされている細孔を通って通過するイオン種の選択によって分類されています。細胞および組織レベルでは、イオンチャネルを介して、巨視的なイオンフラックスは、生物物理学的（ゲーティングと浸透）、生化学的（リン酸化）、および生合成（合成、グリコシル化、輸送、及び分解）の特性1の産物です。これらのプロセスの各々は、イオンチャネルの種類ごとに固有であり、イオンチャネルの生理学的役割を果たすように最適化されます。その結果、貫通これらの微調整プロセスのいずれかの変化遺伝性またはしばしば「チャネロパチー」という遺伝的改変は、細胞ホメオスタシスに有害であることができます。細胞表面でのイオンチャネルの「右」量を送達することは、細胞恒常性に重要であることを強調することが重要です。小さくても増加する（機能獲得型）とイオンチャネル活性のわずかな減少は、（機能喪失）生涯にわたって深刻な病状を引き起こす可能性があります。成熟したイオンチャネルの細胞表面の配信の欠陥は、嚢胞性線維症（CFTRイオンチャネル）2、QT延長症候群形態（心臓カリウムチャネル）3の不整脈として、多数のchannelopathiesにおける重要な決定因子です。 Channelopathiesは、心臓突然死4に関連しています。すべての心臓channelopathiesの現在の世界的な有病率は、少なくとも1であると考えられている：2,000-1：個々の5あたり3000と突然不整脈心臓死CAの約半分を担当していますSES 6。心臓の電位依存性ナトリウム - 、カリウムで機能不全、およびカルシウム選択性イオンチャネルは、このプロセスにおいて重要な役割を果たすことが知られています。 L型Ca V 1.2電圧依存性カルシウムチャネルは、同期心筋収縮を開始するために必要とされます。心臓のL型Ca V 1.2チャネルは、主孔形成のCa Vの α1サブユニットとのCa V SSとのCa Vα2δ1補助サブユニット7-12で構成されるマルチサブユニットタンパク質複合体です。これらのサブユニットは、心臓13の正常な電気的機能をサポートするために不可欠であるとの間の補助サブユニットの完全な補完は、原形質膜での機能のCa V 1.2チャネルおよび動的な相互作用を生成するのに必要とされることに注意してください。カルシウムV SSは、非共有結合ナノモル疎水性相互作用14を介してのCa V 1.2チャネルの細胞表面発現を促進します。 Ca Vα2δ1サブユニットのwiの共発現カルシウムのV th の SS結合のCa Vα1がピーク電流の式（5から10倍）を刺激し、より負の電圧でチャネルの活性化を促進します。孔形成サブユニットのCa V 1.2の機能獲得型変異はL型Ca V 1.2チャネルを形成する3つの主要なサブユニットにおける点突然変異のホストに対し、QT延長症候群15と呼ばれる心室性不整脈の形と関連しています短いQT延長症候群のフォーム16,17の不整脈を患っている被験者において同定されています。イオンチャネルは、生化学的観点（タンパク質化学）から調査またはこれらの相補的なアプローチを使用して、しばしば電気ツール（電流生成機）を用いてすることができる膜タンパク質です。電気生理学は、特定の全細胞パッチクランプで、イオンチャネル15の機能を解明するための適切なアプローチであるが、それらの生物物理学的変化からタンパク質輸送における改変を解決することはできませんプロパティ。タンパク質化学は、しかし、多くの場合、小さい可溶性タンパク質に比べて大きな膜タンパク質の比較的低い発現に使用が制限されています。蛍光読み取りを使用して堅牢なハイスループット法は、具体的には、イオンチャネルの細胞表面発現の変化を引き起こすタンパク質生合成の欠陥に対処するために開発される必要があります。 フローサイトメトリー細胞計数、ソート、バイオマーカー検出、およびタンパク質工学18に用いられる生物物理学的技術です。生細胞または粒子の試料溶液をフローサイトメータに注入されると、細胞は、マシンの検出システム（ 図1）でプローブすることができる単一のストリームに順序付けされます。 1956年19で生産楽器サイトメーター最初の流れはパラメータを1つだけ検出されたが、近代的なフローサイトメーターは、30以上の蛍光パラメータ20,21の検出を可能にする複数のレーザと蛍光検出器を持っています。フィルタやミラー（発光系）は、その強度に比例して光を変換する電子ネットワーク（フォトダイオードおよび検出器）への細胞の光散乱や蛍光光を向けます。デジタルデータは、専用のソフトウェアを用いて分析され、一次出力はドットプロット21として表示されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54732/54732fig1.jpg" /> 図1：ソーティングフローサイトメトリーの生物物理学的原理単セルは、1つまたは複数のレーザインタロゲーションポイント間にそれらを移動させるシース流体の流れ内の高圧下でノズルを介して押し出されます。光ビームが通過する細胞によって偏向され、順方向（前方散乱、FCS）に集められた光は、セルの大きさに比例した信号に光を変換するフォトダイオードに送信されます。光もレーザー経路に対して90°の角度で収集され、検出器（とも呼ばれる光電子増倍管（PMT））に送信されます。励起された蛍光色素が細胞内に存在する場合、この光は、細胞内の粒度を反映した側方散乱信号（SSC）の検出を可能にダイクロイックミラー、および蛍光発光を介してルーティングされます。 3つの検出器（緑、黄、赤）は、異なる蛍光色素の同時検出を可能にする、異なる波長帯域フィルタで表現されています。異なる信号が外部のコンピュータによってデジタル化し、細胞の特性を定量化するために分析されるデータに変換されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54732/54732fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> フローサイトメーターの高スループット能力は、組換え野生型およびトラフィッキング欠損電位依存性L型Ca V 1.2チャネルおよび生細胞内の関連するサブユニットの相対的な膜発現を定量するために利用されました。 cDNAを共同構築しますタンパク質のための鼎は、二重に同時に不透過性の蛍光標識抗体および構成的に蛍光性である細胞内の蛍光団によって検出することができる細胞外非蛍光エピトープを運ぶためにタグ付けされました。 C末端の後に挿入されたタンパク質の細胞外ループに挿入され、細胞外エピトープ、および細胞内の蛍光団、両方は、タンパク質と翻訳されます。この一連の実験では、カルシウムのVα2δ1タンパク質は、内因性の細胞内の蛍光団として抗HAおよびmCherryをを抱合外ヘマグルチニン（HA）エピトープ不透過性のFITC（フルオレセインイソチオシアネート）によって検出された（YPYDVPDYA）を発現するように操作されました。 mCherryを、カルシウムのVα2δ1HAタグ化タンパク質の相対的な細胞表面発現のレベルを決定するために、融合タンパク質を発現する組換え細胞は、トランスフェクション後に回収し、そしてFITC結合マウスモノクローナル抗HAエピトープタグ不格好なやつで染色しましたY（ 図2）。 FITCは、したがって、生物学的機能を妨害する可能性が低い酵素レポーターよりもかなり小さく、有機蛍光化合物です。 TSA-201cellsで過剰発現mCherry-のCa Vα2δ1-HAは、2次元プロット22上のFITC蛍光とmCherryを蛍光における有意な3-ログ増加をもたらします。 HAエピトープは、タンパク質の細胞外部分に位置していることを考えると、無傷細胞の存在下で得られたFITC用の蛍光強度は、HAタグ化タンパク質の細胞表面発現の相対的な指標を反映します。構築物中のHAエピトープのアクセシビリティが体系的細胞透過後のFITCシグナルを測定することによって検証されます。 FITCの相対蛍光強度は、透過性細胞で推定するので、この測定値はまた、正規化された全タンパク質の発現を確証するのに役立つFO相対蛍光値と定性的に同等ですR mCherryを透過処理し、非透過性の条件22,23の下で測定しました。固有の蛍光スペクトルを透過処理した後、より高い値にシフトしていることが、対照構築物と比較して報告されている唯一の値は、蛍光強度の変化があることに注意することが重要です。テスト構築物について蛍光強度の相対的変化は、各蛍光団（mCherryをまたはFITC）のためΔMean蛍光強度（ΔMFI）の値を用いて推定しています。実験は、フルオロフォア結合抗体の固有の蛍光の実験変動を制限するために、同一条件下で発現コントロール構築物の蛍光強度を試験構築物の相対的な蛍光強度を測定するように設計されています。二つの膜タンパク質は、正常にこのアッセイを用いて検討した：L型電位依存性カルシウムチャネルのCa V 1.2 14,22との異なるシリーズでの孔形成サブユニット実験では、α2δ1サブユニット22,23外補助のCa V。以下のプロトコルは、制御条件下でイオンチャネルの翻訳後修飾に影響を与える変異後の心臓L型Ca V 1.2チャネルのカルシウムのVα2δ1サブユニットの細胞表面発現を測定しました。標準化された実験条件下で、FITCの細胞表面蛍光はmCherryを、カルシウムVα2δ1-HAタンパク質（参考文献22の図5）をコードするcDNAの発現に準線形的に増加します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54732/54732fig2.jpg" /> 図2：実験プロトコルフローサイトメトリーでの合計と、膜の標識の概略図スキームがFLにより、組換えイオンチャネルの相対的な合計と細胞表面発現を定量化するために必要な主な手順のいくつかを概説します。OWサイトメトリー。細胞を、（2）TSA-201細胞（1）で二重タグ付き構築mCherryを、カルシウムのVα2δ1-HAでトランスフェクトし、透過処理の前または後に染色されます。マルチパラメータデータを多変量解析するためのフローサイトメーター（3）で取得している（4）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54732/54732fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>Q5 部位特異的突然変異導入キット</td><td>New England Biolabs</td><td>E0554S</td><td>QuickChange部位特異的突然変異導入キット(Agilent, #200523)で代用することができます。</td></tr><tr><td>チューブ 1.5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72-690-001</td><td></td></tr><tr><td>チューブ 15 ml&nbsp;</td><td>ザルシュテット</td><td>&nbsp;62-554-002</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て目盛り付きトランスファーピペット&nbsp;</td><td>VWR</td><td>の160001-192&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 mm培養皿</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td>HEKT細胞の標準培養用。</td></tr><tr><td>35 mm培養ディッシュ</td><td>ファルコン</td><td>353001</td><td>HEKT細胞の標準培養用。</td></tr><tr><td>血清ピペット 1 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1251.001</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット 5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット 25 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1285.001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's high-glucose medium</td><td>Life Technologies</td><td>12100-046</td><td>37 で温かく度;使用前のCウォーターバス。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定済み、熱不活化、米国原産</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>リポソームトランスフェクション用。リン酸カルシウムトランスフェクションで代用できます。</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>ウォーム 37 >使用前のCウォーターバス。</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(1x)0.05%、フェノールレッド</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mlマイクロチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;リン酸緩衝生理食塩水 1x</td><td>フィッシャー</td><td>BP661-10</td><td>「自家製」にすることができます。</td></tr><tr><td>抗HA FITC標識抗体</td><td>Sigma</td><td>H7411</td><td></td></tr><tr><td>IgG1&minus;FITCアイソタイプコントロール抗体</td><td>Sigma</td><td>F6397</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Fixation/Permeabilization.透過処理/洗浄液、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Fisher</td><td>49105161</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Fisher</td><td>15250061</td><td>細胞の生存率にアクセスします。</td></tr><tr><td>冷蔵マイクロ遠心分離機、5430R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>A14H172200</tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2インキュベーター</td><td>フィッシャー</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>ラボラトリー プラットフォーム ロッカー</td><td>フィッシャー</td><td>545034</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>VWR</td><td>89032-216</td><td></td></tr><tr><td>BD ファクサリア III&nbsp;</td><td>BD Biosciences 648282</td><td></td><td>フローサイトメーター。</td></tr><tr><td>FlowJo Software v10</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo v10 ドングル</td><td>データ分析用。</td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

陽イオン選択性チャネルの遺伝性またはde novo変異は、心臓突然死につながる可能性があります。これらのマルチスパン膜貫通タンパク質の原形質膜輸送の変化は、チャネルゲーティングの変更の有無にかかわらず、このプロセスに大きく寄与すると仮定されることがよくあります。そのため、心電位イオンチャネルの相対的な細胞表面発現の変化を大規模に定量化する方法を開発することが重要になってきています。本明細書では、2色蛍光サイトメトリーアッセイを用いて、tsA−201細胞における心臓L型カルシウムチャネルCaV1.2および膜関連サブユニットの相対的な合計および細胞表面発現を決定するための詳細なプロトコルが提供される。他の顕微鏡法やイムノブロッティングベースの定性法と比較して、フローサイトメトリー実験は、1回のフローで同様の細胞特性を持つ生細胞(104 から 106 細胞まで)の大きなサンプルで定量化可能なエンドポイントを提供する、高速で再現性のある大容量アッセイです。コンストラクトは、細胞内C末端でmCherryを恒常的に発現し(したがって、全タンパク質発現の迅速な評価を可能にする)、抗HA蛍光標識抗体を使用して膜タンパク質の細胞表面発現を推定するために、細胞外に面するヘマグルチニン(HA)エピトープを発現するように設計されました。偽陰性を避けるために、透過処理細胞でも実験を行い、HAエピトープのアクセシビリティと適切な発現を確認しました。詳細な手順では、(1)タグ付きDNA(デオキシリボ核酸)コンストラクトの設計、(2)tsA-201細胞におけるコンストラクトの脂質媒介トランスフェクション、(3)非透過性および透過性細胞の培養、回収、染色、(4)蛍光シグナルの取得および分析を提供します。さらに、フローサイトメトリーの基本原理を説明し、蛍光色素の選択、HA抗体の滴定、コントロール実験などの実験デザインについて徹底的に説明します。この特定のアプローチにより、イオンチャネルの総発現と細胞表面発現の客観的な相対定量が可能になり、イオンポンプや原形質膜トランスポーターの研究に拡張できます。

この記事では、サイトメトリーアッセイ2色フローによってTSA-201cellsに発現された組換えイオンチャネルの合計と細胞表面を定量化するための信頼性の高いプロトコルを記述します。一例として、相対的な細胞表面および総タンパク質の発現は、CA のVα2δ1subunitために定量化しました。サイトメトリーアッセイ2色のフローを実行するためには、カルシウムのVα2δ1は、二重に抗HA FITC結合抗体および構成の蛍光細胞内mCherryを蛍光団によって検出することができる細胞外非蛍光エピトープHAを表現するためにタグ付けされました。 FITCおよびmCherryをするための励起および発光スペクトルは、FITCが488nmレーザーで88％の効率で励起されるが、効率は561 nmのレーザーで0％まで減少することを示します。 561 nmレーザーが、488nmレーザーを持つ唯一の7.6％（ 図3）で励起されたときmCherryを、その最大蛍光の63.9パーセントを示しています。励起および発光SPECTRA...

継承された不整脈は、しばしば、一つ以上のイオンチャネルの表面の配信を変更する突然変異によって引き起こされます。ここでは、TSA-201細胞で発現された組換えイオンチャネルの相対的な合計および細胞表面タンパク質発現の定量化を提供するために、フローサイトメトリーアッセイを適合させます。

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

本手法の目的は、蛍光間隔アッセイを用いて膜タンパク質の細胞表面発現を定量化することです。この技術の主な利点は、フローサイトメトリーアッセイにより、1回の実験で大量の生細胞から定量可能なエンドポイントを得られることです。心室性不整脈の病理は、心臓イオンチャネルのトラフィッキング異常を引き起こす遺伝子変異に関連していることが多いため、本技術は心室性不整脈の診断および治療への応用が期待されます。一般的に、この手法を初めて行う方は、タンパク質の機能に影響を与えず、かつ接合抗体の存在下で強い蛍光信号を生成できる適切な細胞外挿入部位を特定することに苦慮します。本手順の実演は、私の研究室のリサーチアシスタントであるBenoite Bourdinが行います。まず、細胞内C末端にmCherryを用いてDNAコンストラクトを二重にタグ付けします。また、細胞外に向いたヘマグルチニンエピトープを共発現させ、蛍光抗体を用いてこれを測定することで、膜タンパク質の細胞表面発現量を推定します。次に、標準的な手法を用いてTSA201細胞をプレートで培養し、コンフルエンスが90%に達するまで育成します。各サンプルについて、トランスフェクション試薬を2本のチューブに調製します。1.5 mLチューブ1本に4 µgのDNAと250 µLの低血清培地を調製し、2本目のチューブに10 µLのリポソーム介在性トランスフェクション試薬と250 µLの低血清培地を調製します。2本のチューブを穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。その後、チューブ1とチューブ2の内容物を穏やかに合わせ、リポソームDNA複合体を室温で20分間インキュベートします。複合体を培養細胞に加え、培養皿を静かに揺らす。皿を37°C、5%二酸化炭素雰囲気下に24時間戻す。トランスフェクション試薬の添加から24時間後、培養皿から培地を取り除き、あらかじめ温めておいた400 µLのTrypsin-EDTAで細胞を慎重に洗浄する。次に、Trypsin-EDTAを400 µL加え、細胞をディッシュから剥離させるため5分間インキュベートします。剥離後、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含まない冷やした培地1 mLを細胞に加え、酵素消化を停止させます。培地をプレート上で4〜5回優しくピペッティングし、表面からすべての細胞を洗浄して回収します。次に、細胞を滅菌済みの1.5 milliliterチューブに回収し、直ちに氷上に置きます。以降の手順では、表面エピトープの内在化を防ぐため、氷冷した溶液を使用し、細胞を4°Cに保持してください。また、蛍光信号の光退色を抑えるため、細胞の光への曝露を最小限にしてください。次に、チューブを遠心分離して細胞をペレット化します。その後、得られた上清を注意深く吸引して廃棄します。1 mLのPBSを用いてペレットを再懸濁し、単一細胞懸濁液を調製します。次に、チューブを短時間遠心します。培地を完全に除去するため、細胞を再度ペレット化し、再懸濁してください。続いて、細胞ペレットを600 µLのPBSで再懸濁します。細胞濃度を測定し、1 mLあたり少なくとも300万細胞に調整します。次に、細胞を新しい1.5 mLチューブに分注します。特異的な染色の非特異的な染色との判別、および細胞外染色と細胞内染色のそれぞれの区別のために、適切なコントロールを必ず含めてください。アイソタイプコントロール抗体は、バックグラウンド染色のレベルを評価するのに役立ち、一次抗体と同種のアイソタイプおよび蛍光色素である必要があります。コントロールアイソタイプ抗体と蛍光抗体を同じ濃度で使用することが重要です。膜タンパク質の細胞表面発現を推定するには、まず蛍光標識抗体を用いて、細胞外側のHAエピトープのみを標識します。次に、5 µg/mLのFITC標識モノクローナルanti-HA抗体をチューブに加えます。細胞を短時間ボルテックスした後、ロッカープラットフォームを用いて暗所でインキュベートします。暗所から細胞を取り出し、900 µLのPBSを加えます。その後、チューブを遠心分離して細胞をペレット化し、上清を吸引します。次に、ペレットを1 mLのPBSに再懸濁し、短時間ボルテックスすることによって細胞を洗浄します。その後、再び遠心分離ステップを繰り返し、細胞を再度ペレット化します。結合していない抗体を完全に除去するため、この洗浄ステップを計3回繰り返します。最終洗浄後、細胞を500 µLのPBSに再懸濁し、単細胞懸濁液を5 mLのフローサイトメトリー用チューブに移します。サンプルを測定するまで、細胞は4 °Cの暗所で保存してください。全タンパク質の細胞内発現量を推定するため、次に透過処理した細胞を標識します。これは細胞外標識と同様のプロトコルで行いますが、サポニンベースの細胞透過化バッファーを追加します。細胞をペレット化し、上清を除去した後、調製済みのストック溶液から直接、100 microlitersの固定透過化溶液に細胞を再懸濁します。細胞を4°Cの暗所で20分間インキュベートします。次に、調製したばかりの透過化洗浄バッファーを100 µL加え、細胞を軽くボルテックスします。続いて、細胞をペレット化し、透過化洗浄バッファーを用いてさらに2回洗浄します。次に、5 µg/mLに調整したFITC標識モノクローナルanti-HA抗体と、100 µLの透過化洗浄バッファーを添加します。細胞を短時間ボルテックスし、4 °Cの暗所で30分間インキュベートします。その後、100 µLの透過化洗浄バッファーを添加します。細胞を遠心してペレットにし、前述のバッファー100 µLで3回洗浄します。最後の洗浄後、細胞を500 µLのPBSに再懸濁し、単一細胞懸濁液を5 mLのフローサイトメトリー用チューブに移します。非透過化細胞および透過化細胞を、同日にフローサイトメーターで解析します。まず、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを起動し、フローサイトメトリーで作成されたfcsファイルをインポートします。最初のサンプルをクリックし、サイドスキャッター対フォワードスキャッターのプロットでゲーティング処理を開始します。次に、楕円アイコンを使用して生存細胞の周囲にP1ゲートを描き、デブリ、死細胞、または凝集塊を除去します。次に、mCherryとFITCの蛍光強度によるチューブパラメータのコンタープロットを作成します。FITCおよびmCherry陽性細胞の周囲にP2ゲートを、蛍光陰性細胞集団の周囲にP3ゲートを設定します。続いて、P2およびP3ゲートを選択し、元のワークスペースウィンドウにある統計追加アイコンをクリックします。「count」をクリックし、次に「mean」をクリックします。最後に、ゲートのパラメータと統計を、サイトメーターで解析したすべてのサンプルに適用します。このプロトコルは、TSA201細胞におけるCaV Alpha 2 Delta 1の総発現および細胞表面発現に対するN-グリコシル化の役割を特性評価するために使用されました。細胞表面のタンパク質発現を評価するため、N-グリコシル化部位を4箇所、16箇所、または全く破壊していない非透過化細胞においてHAを測定した。FITCレベルは、野生型および4箇所のN-グリコシル化部位を破壊した細胞で高く、16箇所の部位を破壊した細胞ではバックグラウンドレベルに留まった。透過化細胞では、すべての条件でFITC蛍光が増加し、すべてのトランスフェクションされたHAタグ付きCaV Alpha 2 Delta 1タンパク質が抗HA FITC抗体によって染色・検出されたことが示された。さらに、透過処理済み細胞と非透過処理細胞でmCherryの蛍光レベルが同等であったことから、透過処理によってmCherry信号の相対値が変化しないことが示されました。細胞透過処理後に行ったアッセイでは、16箇所の部位を破壊した細胞の総タンパク質発現量も有意に減少していることが示されました。これは、透過処理済み細胞のFITC蛍光から推測した場合でも、非透過処理細胞および透過処理済み細胞で測定した構成的なmCherry蛍光から推測した場合でも同様の結果でした。この手順に加えて、イオンチャネルの発現と機能との相関を調べるために、追加の生理学的記録を行うことが可能です。本手法は、組換え細胞または天然細胞で発現させた膜タンパク質の輸送における、遺伝子変異、翻訳後修飾、microRNA、小型GTPase、およびシャペロンの役割の影響を研究する医学分野の研究者にとっても有用な道を開くものです。このビデオを視聴することで、組換え細胞におけるDNAトランスフェクションの実施方法、NTACおよび透過処理済み細胞の染色方法、ならびにサンプルを用いたデータ解析の方法について十分に理解できるはずです。生細胞を扱う際は、トランスフェクション時にラミナーフロー内で作業することや、化学薬品を扱う際に手袋を着用することなどの注意事項を忘れないでください。

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生物学

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フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

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