フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

本手法の目的は、蛍光間隔アッセイを用いて膜タンパク質の細胞表面発現を定量化することです。この技術の主な利点は、フローサイトメトリーアッセイにより、1回の実験で大量の生細胞から定量可能なエンドポイントを得られることです。心室性不整脈の病理は、心臓イオンチャネルのトラフィッキング異常を引き起こす遺伝子変異に関連していることが多いため、本技術は心室性不整脈の診断および治療への応用が期待されます。

一般的に、この手法を初めて行う方は、タンパク質の機能に影響を与えず、かつ接合抗体の存在下で強い蛍光信号を生成できる適切な細胞外挿入部位を特定することに苦慮します。本手順の実演は、私の研究室のリサーチアシスタントであるBenoite Bourdinが行います。まず、細胞内C末端にmCherryを用いてDNAコンストラクトを二重にタグ付けします。

また、細胞外に向いたヘマグルチニンエピトープを共発現させ、蛍光抗体を用いてこれを測定することで、膜タンパク質の細胞表面発現量を推定します。次に、標準的な手法を用いてTSA201細胞をプレートで培養し、コンフルエンスが90%に達するまで育成します。各サンプルについて、トランスフェクション試薬を2本のチューブに調製します。

1.5 mLチューブ1本に4 µgのDNAと250 µLの低血清培地を調製し、2本目のチューブに10 µLのリポソーム介在性トランスフェクション試薬と250 µLの低血清培地を調製します。2本のチューブを穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。その後、チューブ1とチューブ2の内容物を穏やかに合わせ、リポソームDNA複合体を室温で20分間インキュベートします。

複合体を培養細胞に加え、培養皿を静かに揺らす。皿を37°C、5%二酸化炭素雰囲気下に24時間戻す。トランスフェクション試薬の添加から24時間後、培養皿から培地を取り除き、あらかじめ温めておいた400 µLのTrypsin-EDTAで細胞を慎重に洗浄する。

次に、Trypsin-EDTAを400 µL加え、細胞をディッシュから剥離させるため5分間インキュベートします。剥離後、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含まない冷やした培地1 mLを細胞に加え、酵素消化を停止させます。培地をプレート上で4〜5回優しくピペッティングし、表面からすべての細胞を洗浄して回収します。

次に、細胞を滅菌済みの1.5 milliliterチューブに回収し、直ちに氷上に置きます。以降の手順では、表面エピトープの内在化を防ぐため、氷冷した溶液を使用し、細胞を4°Cに保持してください。また、蛍光信号の光退色を抑えるため、細胞の光への曝露を最小限にしてください。

次に、チューブを遠心分離して細胞をペレット化します。その後、得られた上清を注意深く吸引して廃棄します。1 mLのPBSを用いてペレットを再懸濁し、単一細胞懸濁液を調製します。

次に、チューブを短時間遠心します。培地を完全に除去するため、細胞を再度ペレット化し、再懸濁してください。続いて、細胞ペレットを600 µLのPBSで再懸濁します。

細胞濃度を測定し、1 mLあたり少なくとも300万細胞に調整します。次に、細胞を新しい1.5 mLチューブに分注します。特異的な染色の非特異的な染色との判別、および細胞外染色と細胞内染色のそれぞれの区別のために、適切なコントロールを必ず含めてください。

アイソタイプコントロール抗体は、バックグラウンド染色のレベルを評価するのに役立ち、一次抗体と同種のアイソタイプおよび蛍光色素である必要があります。コントロールアイソタイプ抗体と蛍光抗体を同じ濃度で使用することが重要です。膜タンパク質の細胞表面発現を推定するには、まず蛍光標識抗体を用いて、細胞外側のHAエピトープのみを標識します。

次に、5 µg/mLのFITC標識モノクローナルanti-HA抗体をチューブに加えます。細胞を短時間ボルテックスした後、ロッカープラットフォームを用いて暗所でインキュベートします。暗所から細胞を取り出し、900 µLのPBSを加えます。

その後、チューブを遠心分離して細胞をペレット化し、上清を吸引します。次に、ペレットを1 mLのPBSに再懸濁し、短時間ボルテックスすることによって細胞を洗浄します。その後、再び遠心分離ステップを繰り返し、細胞を再度ペレット化します。

結合していない抗体を完全に除去するため、この洗浄ステップを計3回繰り返します。最終洗浄後、細胞を500 µLのPBSに再懸濁し、単細胞懸濁液を5 mLのフローサイトメトリー用チューブに移します。サンプルを測定するまで、細胞は4 °Cの暗所で保存してください。

全タンパク質の細胞内発現量を推定するため、次に透過処理した細胞を標識します。これは細胞外標識と同様のプロトコルで行いますが、サポニンベースの細胞透過化バッファーを追加します。細胞をペレット化し、上清を除去した後、調製済みのストック溶液から直接、100 microlitersの固定透過化溶液に細胞を再懸濁します。

細胞を4°Cの暗所で20分間インキュベートします。次に、調製したばかりの透過化洗浄バッファーを100 µL加え、細胞を軽くボルテックスします。続いて、細胞をペレット化し、透過化洗浄バッファーを用いてさらに2回洗浄します。

次に、5 µg/mLに調整したFITC標識モノクローナルanti-HA抗体と、100 µLの透過化洗浄バッファーを添加します。細胞を短時間ボルテックスし、4 °Cの暗所で30分間インキュベートします。その後、100 µLの透過化洗浄バッファーを添加します。

細胞を遠心してペレットにし、前述のバッファー100 µLで3回洗浄します。最後の洗浄後、細胞を500 µLのPBSに再懸濁し、単一細胞懸濁液を5 mLのフローサイトメトリー用チューブに移します。非透過化細胞および透過化細胞を、同日にフローサイトメーターで解析します。

まず、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを起動し、フローサイトメトリーで作成されたfcsファイルをインポートします。最初のサンプルをクリックし、サイドスキャッター対フォワードスキャッターのプロットでゲーティング処理を開始します。次に、楕円アイコンを使用して生存細胞の周囲にP1ゲートを描き、デブリ、死細胞、または凝集塊を除去します。

次に、mCherryとFITCの蛍光強度によるチューブパラメータのコンタープロットを作成します。FITCおよびmCherry陽性細胞の周囲にP2ゲートを、蛍光陰性細胞集団の周囲にP3ゲートを設定します。続いて、P2およびP3ゲートを選択し、元のワークスペースウィンドウにある統計追加アイコンをクリックします。

「count」をクリックし、次に「mean」をクリックします。最後に、ゲートのパラメータと統計を、サイトメーターで解析したすべてのサンプルに適用します。このプロトコルは、TSA201細胞におけるCaV Alpha 2 Delta 1の総発現および細胞表面発現に対するN-グリコシル化の役割を特性評価するために使用されました。

細胞表面のタンパク質発現を評価するため、N-グリコシル化部位を4箇所、16箇所、または全く破壊していない非透過化細胞においてHAを測定した。FITCレベルは、野生型および4箇所のN-グリコシル化部位を破壊した細胞で高く、16箇所の部位を破壊した細胞ではバックグラウンドレベルに留まった。透過化細胞では、すべての条件でFITC蛍光が増加し、すべてのトランスフェクションされたHAタグ付きCaV Alpha 2 Delta 1タンパク質が抗HA FITC抗体によって染色・検出されたことが示された。

さらに、透過処理済み細胞と非透過処理細胞でmCherryの蛍光レベルが同等であったことから、透過処理によってmCherry信号の相対値が変化しないことが示されました。細胞透過処理後に行ったアッセイでは、16箇所の部位を破壊した細胞の総タンパク質発現量も有意に減少していることが示されました。これは、透過処理済み細胞のFITC蛍光から推測した場合でも、非透過処理細胞および透過処理済み細胞で測定した構成的なmCherry蛍光から推測した場合でも同様の結果でした。この手順に加えて、イオンチャネルの発現と機能との相関を調べるために、追加の生理学的記録を行うことが可能です。

本手法は、組換え細胞または天然細胞で発現させた膜タンパク質の輸送における、遺伝子変異、翻訳後修飾、microRNA、小型GTPase、およびシャペロンの役割の影響を研究する医学分野の研究者にとっても有用な道を開くものです。このビデオを視聴することで、組換え細胞におけるDNAトランスフェクションの実施方法、NTACおよび透過処理済み細胞の染色方法、ならびにサンプルを用いたデータ解析の方法について十分に理解できるはずです。生細胞を扱う際は、トランスフェクション時にラミナーフロー内で作業することや、化学薬品を扱う際に手袋を着用することなどの注意事項を忘れないでください。