Name: 幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学ぶ高脂肪食を用いたゼブラフィッシュ幼虫の摂食と脂質代謝の可視化法。蛍光脂質アナログによるライブイメージングで、食物摂取の定量化と細胞内脂質処理を観察できます。

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著者は、画像を提供してくださったMeng-Chieh Shenさん、原稿に有益なコメントを提供してくださったJennifer Andersonさん、そしてこれらの技術の開発に貢献してくださったFarber研究室のメンバーに感謝します。本研究は、NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.)、RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F.)、および F32DK096786 (J.P.O.) の資金提供を受けました。このコンテンツは著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。G・ハロルド・アンド・レイラ・Y・マザーズ慈善財団は、S.A.F.の研究所とカーネギー科学研究所の寄付に対して、追加の支援を提供しました。

これらのプロトコルは、科学施設内動物管理使用委員会のためのカーネギー研究所（プロトコル番号139）によって承認されています。 1.動物の準備<ol><li> 10時間明：暗サイクル14時間で28℃で大人と幼虫を維持します。シェル無料アルテミア （デカプセル化、非ハッチング、14 DPFで開始）と商用マイクロペレット1日2回大人フィード。 </li><li>これらのプロトコルは、ABの背景の自然産卵により収集6-7 DPFの幼虫の使用に最適化されています。プロトコルは、他の年齢や背景の幼虫のために改変することができます。前6 DPFに外因性の食べ物を提供しないでください。 </li><li> （ミリリットルは、EMは100あたり4 mg / mlでトリカインの4.2ミリリットル）を室温（RT）で胚のメディア（EM）にトリカインで幼虫を麻酔します。 </li></ol>脂質の豊富な卵黄フィードの調製<ol><li>鶏の卵黄を準備し、格納します。 12鶏卵の卵黄と白を分離します。 1.5に卵黄、アリコート1ミリリットルをプールmlチューブ、および1年のCまで-80℃で保存してください（12黄身は〜80アリコートを行います）。白人のプール、店舗、および脂質に乏しい、タンパク質が豊富な飼料として使用します。 </li><li>所望であれば、卵黄飼料に添加される蛍光脂質類似体（複数可）を準備します。 <ol><li>製造元の指示に従って、不透明なガラス管に、アリコート（次の注意溶剤を議論を参照してください）/μlの0.1μgので100％エタノールまたは100％クロロホルムで購入し、粉末状の蛍光脂質類似体をサスペンドパラフィルムで密封し、そして店。有機溶媒の急速な蒸発に長期保存のために〜400μlのより少ない分量のボリュームを使用しないでください。 注：脂質類似体をエタノール中に懸濁されている場合、それはクロロホルムよりN 2下でより速く乾燥するので、脂質類似体の大ボリュームが使用されます。脂質アナログをエタノールに懸濁された場合には、ステップ2.2.4でリポソームフィードに追加する前に乾燥させ、再懸濁する必要はありませんが、全体のエタノール濃度が0を超えてはなりません。リポソーム飼料中1％エタノールの潜在的に交絡生理学的効果を回避します。 </li><li>蛍光脂肪酸類似体の場合：EMで20ミリリットルの5％卵黄乳剤の総容量を準備します。それから、ライブ共焦点イメージングおよび食物摂取アッセイまたはを1μg/ mlの6.4μM4,4-ジフルオロ-4-ボラ- 3A、4a-ジアザ-s-インダセン（BODIPY C 16）の最終濃度で5ミリリットルのアリコートを調製実体顕微鏡イメージングのためのBODIPY C 12。 1.5ミリリットルのプラスチックチューブに蛍光脂質類似体の所望の量を転送します。チューブから脂質を爆破しないように注意しながら、N 2気流下で脂質を乾燥させます。 </li><li>すぐに、チューブの側面ダウンストリームをピペットで5μlの100％エタノール中に再懸濁は、95μlのEMを追加し、よく混ぜます。 注：混合物が均質に表示されます。着色された脂質は、チューブの側面に残るか、液体が塊状の表示された場合、脂質は完全に可溶化し、より多くのエタノールを必要としていません。あちこちにチューブを守ります氷の上メートルの光とストア。 </li><li>蛍光コレステロールアナログの場合：ライブイメージング研究のための5ミリリットル百分の0.5から5卵黄エマルジョン中2.4 / mlのコレステロールの最終濃度を準備します。 1.5mL容のプラスチックチューブにコレステロールの所望の量を転送します。チューブから脂質を爆破しないように注意しながら、N 2気流下で脂質を乾燥させます。 </li><li>すぐに、チューブの側面ダウンストリームをピペッティングし、精製し、H 2 O中にRTの1％脂肪酸フリーBSAの85μlのと混合することによって、RTの100％エタノール15μlの中で再懸濁光からチューブを保護し、氷上で保存します。 </li></ol></li><li>卵黄リポソームフィードを準備します。 <ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブにEMに卵黄の解凍アリコートを追加します。ボルテックス1-2分間希釈した卵黄の混合物;混合物は、均質なエマルションであることが表示されます。 </li><li>タンパク質のコングロマリットを削除し、新しい、新鮮な50mlコニカルチューブに収集するために、細かいメッシュストレーナーを通して混合物を注ぎます。 </li><li>パルスソニカリポソームを作成するために、RTで：;四分の一インチテーパーマイクロチップ（6 W出力強度5倍（上の5×1秒、1秒オフ）が5月10日各セット間の秒の一時停止）と卵の混合物TE。超音波処理器の電源設定は、機器に依存しているため、各楽器やマイクロチップのための最適化を必要とします。 注：継続的に使用するまで均質性を維持するために、RTでリポソーム混合物を揺すります。 </li></ol></li><li>必要に応じて、卵黄リポソームに蛍光脂質類似体を追加します。すぐに超音波処理した後、リポソームに組み込む30秒間高速でリポソーム混合渦に準備脂質をピペット。ホイルでチューブを包むことにより、光から混合物を保護し、室温で揺れ続けます。 </li></ol> 3.摂食パラダイム<ol><li>給餌のために幼虫を準備します。 <ol><li>摂食を妨げることが明らかな形態学的欠陥のための飼料、画面の幼虫を開始する前に。 60ミリメートルX 15ミリメートルのペトリ皿または6または12ウェルのPLAへの転送の幼虫TES、最小限にEMを削減し、準備されたリポソーム溶液5mlで置き換えます。 </li><li>必要に応じて、5ミリリットルEMに無給電制御の幼虫を転送および/または5ミリリットル5％卵白EMおよび並列に扱います。 </li></ol></li><li>ゆっくり蛍光脂質類似体が存在する場合、光から遮蔽するために継続しながら、食物摂取を奨励するために、フィードを通じてインキュベートロッカー内の幼虫（30 rpmで29-31°C）を揺すります。幼虫は、光にさらされる必要がある場合は、着色ガラスインキュベーターカバーで露出を最小限に抑えることができます。 </li><li>給餌期間の終了時に、EMで3回、自由に泳ぐ幼虫をすすぎます。 注：幼虫は、フィード中の任意の時点でリポソームを消費し始めることができます。それは幼虫が同時に供給開始することが重要である場合には、食物摂取のための画面送りの1時間後（3.4を参照）、フィードを完了するために、卵黄エマルジョンへの給電を開始している唯一の幼虫を返します。 </li><li>少数EAない可能性食物摂取のために、この時点で幼虫を選別トン（一般〜0から5パーセント）。彼らが供給されているかどうかを判断するために麻酔またはわずかに氷の上の金属ブロック上で冷却された幼虫の腸を調べます。リポソームを消費した幼虫は暗く腸（ 図1）を持つことになります。 </li><li>すぐに食物摂取のための画像やプロセスの幼虫。代わりに、新鮮なEMにおける場所の幼虫および代謝処理が発生することを可能にするために28℃でインキュベートします。 </li></ol>ライブイメージング用4.取付幼虫<ol><li>マウントメディアを準備します。 <ol><li> 3％メチルセルロースの場合：-20°Cで年間の沸点近くEM、渦、4°Cで2〜3日間完全に溶解するまで室温でロック、店舗の25ミリリットルに0.75グラムのメチルセルロースを追加します。 4℃での凍結および解凍の繰り返しサイクルは、気泡を除去します。幼虫を搭載しながら、氷上で3％のメチルセルロースを保管してください。 </li><li> 1.2％の低マウントアガロースの場合：25 mLのEMにアガロース低溶融、沸騰させることによって溶解し、2ミリリットルのトンへの一定分量の0.3グラムを追加ubes、およびヒートブロック上で26から28℃に維持します。未使用のアリコートを室温で保存するか、または-20℃と使用時に再び煮沸することができます。アガロースは幼虫にさらすか、加熱過剰とすることができる前に処理するのに十分クールであることを確認してください。 </li></ol></li><li>低倍率、中スループットライブイメージングのために、氷の上の金属ブロックに組織上のスライドガラスを配置し、スライドを冷却するのを待ちます。フィッシングラインの火かき棒を使用して、3％メチルセルロースに幼虫を転送する、スライド上に（氷上で4℃に維持されている）、3％メチルセルロースの寛大な量を適用するに接着（0.41ミリメートルの直径釣り糸ガラス毛細管の端）メチルセルロースが希釈されないように（過剰EMドレイン）、必要に応じて幼虫を配置するための婚約を作成します。 </li><li>直立オイル出現を目的とした短期（&lt;20分）、高倍率のライブイメージングのため、希薄に法カバーガラスで幼虫をマウントします。 <ol><li>にシアノアクリレートベースの接着剤（スーパーグルー）を使用しますスライドガラスの一端にAA 22ミリメートル×30ミリメートルカバースリップを添付します。カバーガラスに隣接してスライド上の3％メチルセルロースの細い線を入れて、広い口径パスツールピペットを用いてスライドに幼虫を転送するためにポーカーを使用してください。それはメチルセルロースを希釈しないように余分なEMを削除します。 </li><li>カバースリップの隣に自分の頭でポーカーを使用して、そっとその両側にメチルセルロースで幼虫を配置（アップ肝臓の複数の画像を左、右の画像に胆嚢をアップ側）。 </li><li>優しく第二カバーガラスのコーナーとのスポット瞬間接着剤は、幼虫をブリッジ、取り付けられたカバースリップ上にカバースリップ、スライド上の他の一端を配置します。幼虫は無傷のままであるように、このステップの間、またはイメージングしながら目的で、過剰な圧力をかけないように注意してください。 </li></ol></li><li>直立浸対物レンズとの長期、高倍率のイメージングでは、アガロースで幼虫をマウントします。転送アガロースその後、1.2％の低融点の小アリコートに幼虫を追加します。シャーレにアガロースの小容積の幼虫。 <ol><li>迅速アガロースが固化する前に、ポーカーで幼虫を置きます。アガロースは2-3分間乾燥し、乾燥からそれを防ぐために、新鮮なEMと完全にアガロースをカバーすることができます。 </li></ol></li><li>長期的には、反転を目的とした高倍率のイメージングは​​、アガロースでガラスボトムディッシュに幼虫をマウントします。 <ol><li>氷の上の金属ブロックを冷却します。過冷却と幼虫の凍結を防止するために組織によって分離された金属ブロック上に皿を置きます。皿に幼虫を移し、組織で吸上により、EMを削除します。 </li><li>幼虫の上に28°C低融点アガロース（1.2％）の低下を置き、すぐにポーカー（ダウン最高の画像を左側肝臓、ダウン胆嚢像に右側）と位置付けます。寒ブロックから皿を外し、2-3分間乾燥させ、そしてアガロースをカバーするために、新鮮なEMの十分なボリュームを追加（〜2〜5ミリリットル）。 </li></ol></li></ol> 5.食物摂取検定<ol><li> 6.4μMBODIPY C 16を含む卵黄リポソームフィードの終わりには、EMを取り外し、プラスチック1.5または2ミリリットルチューブに10洗浄幼虫の最小値をプールし、凍結スナップ。サンプルは、数ヶ月間、光から保護し、-80℃で保存してもよいです。 注：可能な場合は、複数の複製を収集します。バックグラウンド脂質蛍光（同クラッチから理想的に幼虫が使用されている）のために正規化するために、この段階で未吸血幼虫を収集することが重要です。 </li><li>修正されたブライ・ダイアーの脂質抽出3,21を実行します 。 <ol><li> （代替的に精製されたH 2 Oを使用することができる）、氷上でサンプルに100μlの均質化緩衝液（20mMのトリス-Cl、1 mMのEDTA）を加えます。マイクロチップ超音波処理装置（：1秒間オフに1秒5秒の合計）と氷上でホモジナイズします。その幼虫を確認し、完全に均質化されています。ない場合は、繰り返します。 13 mlの使い捨てガラス培養チューブに移す（他のガラス管を使用してもよいです）。 注：クロロホルムは危険です。後続のすべての脂質の元を実行します化学フード内で室温で牽引段階。 </li><li> 2（クロロホルム：メタノール）を使用均質化緩衝液の各100μlのために、1の375μlを添加します。ボルテックス30-60秒、10分間インキュベート、使用100μlの均質化緩衝液、渦30秒あたりのクロロホルム125μlを添加します。 </li><li> （光から保護2000のx グラム 、5分、RT）を用い、100μlの均質化緩衝液、ボルテックス30秒、および遠心あたり200 mMトリスpH7.5の125μlのを追加します。慎重に遠心分離機からサンプルを削除します。上部相は水性である幼虫破片のインターフェースを、下部有機相（脂質を含有する）：これらは2相に分離されます。 </li><li>きれいなガラスピペットを用いて底部、有機相を回収し、清潔な13 mLのガラス管にそれを転送します。 注：界面における水相と幼虫破片を避けるように注意してください。汚染が発生した場合には、遠心分離工程および再収集を繰り返します。上部の水相を捨てます。削除して、これを破棄するために役立つかもしれません有機相を収集する前に相。サンプルは、最大1ヶ月間-80℃で保存することができます。 </li><li>光から保護しながら、真空下での有機相（0.12気圧）を乾燥させます。それは、脂質溶解性を低下させるように、液体が蒸発した後の試料を乾燥し続けないでください。 1（クロロホルム：メタノール）2に脂質を再懸濁し、氷上で保存します。クロロホルムの最適量：メタノール溶液を使用する検出方法に依存します。低起動し、必要に応じて希釈するために続けています。一般的なガイドラインは、10プールされた幼虫のために10μLを使用することです。 </li></ol></li><li>チャネリングTLCプレート上に等間隔でサンプル全体のボリュームを発見し、日常的に生体分子イメージングのために使用されるレーザスキャナ（ 例えば 、蛍光プレートリーダー）でプレートをスキャンします。 510から665ナノメートルから500〜650 nmおよび発光極大からの励起極大を有する物質のリストに含まれる蛍光脂質類縁体は、520 nmで488 nmのレーザー発光コレクションでの使用。 <ol><li>イメージングソフトウェアで各スポットの全蛍光を定量化します。 注意：自然対になった、未吸血幼虫サンプルの蛍光を差し引くことにより、バックグラウンド脂質蛍光を発生するための正しいです。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここに記載された技術は、研究者は、脂質の豊富な飼料と幼虫のゼブラフィッシュを扱うライブ幼虫に食餌脂質処理を可視化し、幼虫の食物摂取量を定量化することができます。成功を確実にするために、特別な注意は、いくつかの重要なステップに与えられるべきです。コマーシャル鶏の卵は異なります。潜在的な変動を最小限に抑えるために、我々は、オメガ3脂肪酸について濃縮されていないケージフリー鶏から有機卵のすべてのアッセイを行います。下側の供給速度は、より若い6食物摂取（ すなわち 、顎または腸奇形、適切に泳ぐことができないことを）妨げる発達変異を有する内因性卵黄エネルギー供給、不健康な魚、または魚を残りとDPF魚で観察することができます。それらの内因性卵黄店が排出されると卵黄の枯渇は、消化器系のより良い可視化を可能にするまで、幼虫は外因性の食べ物を必要としないため、ファーバー研究室では、一般的に6〜7日後に受精（DPF）で供給した研究を行います。給餌RTでも大幅に食べる幼虫の数を減らすことができます。食物摂取とその後の実験で未吸血幼虫が意図せずに含めるための幼虫のスクリーニングに失敗すると、結果を混乱させることがあります。加えて、最大蛍光、し...

腸は食物脂質の処理を調節する機構は、肝臓は、複合脂質の合成およびリポタンパク質代謝を制御し、これらの器官は、食物摂取量を制御するために、中枢神経系でどのように機能するか完全には理解されています。これは、肥満、心臓血管疾患、糖尿病、および非アルコール性脂肪肝疾患の現在の流行に照らして、この生物学を解明するために、生物医学的関心です。細胞培養およびマウスにおける研究食物中の脂肪と病気の間の機械的な関係の理解の大部分を提供している、およびゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、この作業を補完する理想的なモデルとして浮上しています。 ゼブラフィッシュは、急速に発展、高等脊椎動物1,2と同様の胃腸（GI）器官、脂質代謝、およびリポタンパク質の輸送があり、遺伝的に扱いやすいです。幼虫のゼブラフィッシュの光学的透明性は、in vivo試験で particulaを容易にGI系の研究のためのRの利点その細胞外環境（ すなわち 、胆汁、微生物、内分泌シグナリングは）ex vivoでのモデル化することは事実上不可能であるように。とゼブラフィッシュ幼生のイメージングを生きるために、遺伝的扱いやすさとconducivenessを組み合わせた研究によれば、体食物の操作（高脂肪3,4、 -コレステロール5、および-炭水化物ダイエット6,7）、および心血管疾患8の様々なモデル、糖尿病9,10、脂肪肝11-13、および肥満14-16、代謝洞察のホストを提供するために浮上しています。 代謝研究に幼虫のゼブラフィッシュの移行の重要な側面は、ゼブラフィッシュとゼブラフィッシュの独自の強みを活用した新規アッセイの開発に他のモデル動物で開発された技術の最適化です。このプロトコルは、技術がLIPI幼虫のゼブラフィッシュを養うために開発され、最適化された提示しますDが豊富な食事は、細胞内の解像度に全身から食餌脂質処理を可視化し、食物摂取量を測定します。それが脂肪やコレステロールの高レベルが含まれているとして、鶏の卵黄を〜（脂質が構成する脂質の豊富な食事を構成するために〜5％がコレステロールであるそのうちの鶏の卵黄の58％を、選ばれた、60％はトリグリセリドであり、35％がリン脂質であります）。ゼブラフィッシュダイエットと摂食連隊は、ラボ17全体で標準化されていないとして、鶏の卵黄は、典型的な市販のゼブラフィッシュマイクロペレット食品（〜15％の脂質）、それは特定の脂肪酸種の既知の割合で標準化された飼料であるという利点よりも多くの脂肪を提供します。また、卵黄に設けられた蛍光脂質類似食物脂質18の輸送および蓄積を可視化、脂質滴を含む画像の細胞成分複合脂質に両方としてバイタル色素3および共有結合の取り込みを介して作用することにより、薄層クロマトグラフィー（TLC）を介して代謝を調査19 </sup&gt;高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（SAF未発表データ）、および総食物摂取量20についての定量的アッセイを提供します。

<table><tbody><tr><td>トリカイン(エチル3-アミノ安息香酸メタンスルロフネート塩)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>ゼブラフィッシュの幼虫用麻酔</td></tr><tr><td>鶏の卵</td><td>N/A</td><td>N/A</td> 有機のケージ<td>フリー卵、omege-3脂肪酸に濃縮されていない</td></tr><tr><td>超音波プロセッサ3000 sonicator</td><td>Misonix、Inc.</td><td>S-3000</td><td>卵黄リポソームを作るために</td></tr><tr><td>Sonabox 音響エンクロージャ</td>ー <td>株式会社ミソニックス</td><td>432B</td><td>卵黄リポソームを作るには</td></tr><tr><td>1/8" テーパード マイクロチップ</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>卵黄リポソームを作るには</td></tr><tr><td>琥珀色のバイアル (4 ml、ガラス)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>脂質貯蔵; バイアル、オープントップ キャップ、キャップ セプタム</td></tr>を含む <tr><td>インキュ シェイカー ミニ&nbsp;</td><td>ベンチマーク</td><td>1222U12</td>飼料<td>用インキュベートシェーカーBODIPY</td></tr><tr><td>FL C16&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D3821</td><td>蛍光脂質アナログ;(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-ヘキサデカン酸)</td></tr><tr><td>ボディピーFL C12&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D3822</td><td>蛍光脂質アナログ;(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-ドデカン酸)</td></tr><tr><td>ボディピーFL C5&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D3834</td><td>蛍光脂質アナログ;(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-ペンタン酸)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>蛍光脂質アナログ;(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸)</td></tr><tr><td>TopFluorコレステロール&nbsp;</td><td>アバンティポーラーリピッド株式会社</td><td>810255</td><td>蛍光脂質アナログ; 23-(ジピロメテンボロン二フッ化物)-24-ノルコレステロール</td></tr><tr><td>脂肪酸フリー BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>TopFluor コレステロール可溶化用</td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>生きた幼虫イメージング用封入剤; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>低融点アガロー</td>ス <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP165-25</td><td>生きた幼虫用封入剤イメージング;22 x 30</td></tr><tr><td>VWR顕微鏡スライド&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>16004-422</td><td>ライブイメージング用幼虫の装着</td></tr><tr><td>カバースリップ&nbsp;</td><td>カバーガラス</td><td>12-544A</td><td>ライブイメージング用幼虫取付</td></tr><tr><td>スーパーグルー</td><td>ロックタイト</td><td>LOC01-30379</td><td>ライブイメージング用取付幼虫</td></tr><tr><td>FluoroDish(ガラス底皿)</td><td>ワールド・プレシジョンズ(株)&nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>ライブイメージング用埋込幼虫 35mmディッシュ、23mmガラス、0.17mmガラス厚&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>SP-2, SP-5</td><td>高倍率ライブイメージング用顕微鏡</td></tr><tr><td>ステレオスコープ</td><td>ニコン</td><td>SM21500</td><td>低倍率ライブイメージング用</td></tr><tr><td>顕微鏡 ガラス製培養チューブ&nbsp;</td><td>キンブル</td><td>73500-13100</td><td>脂質抽出;(13 x 100 mm; 13 ml)</td></tr><tr><td>サバントSpeedVacプラス&nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>脂質抽出</td></tr><tr><td>チャネリング TLC プレート</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>食物摂取アッセイ;LK5D シリカゲル 150 A、20 x 20 cm、厚さ 250 um。販売終了</td></tr><tr><td>チャネリングTLCプレート</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>食物摂取アッセイ;Whatman Scientific TLCプレートの直接交換</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 可変モードイメージャー</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>食品摂取アッセイ用蛍光プレートリーダー</td></tr><tr><td>ImageQuantソフトウェア</td><td>GE Healthcare</td><td>29000605</td><td>食品摂取アッセイの分析</td></tr><tr><td>5 3/4'ワイドボア、ホウケイ酸ディスポーザブルパスツールピペット&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>キンブル</td><td>63A53WT</td><td>転送幼虫</td></tr></tbody></table>

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

ゼブラフィッシュは、食事の脂質処理と代謝性疾患のモデルとして浮上しています。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼生に脂質が豊富な食事を与える方法を説明しています。これは、卵黄を胚培地で超音波処理することによって作成された鶏卵黄リポソームのエマルジョンで構成されています。卵黄の消費について幼虫をスクリーニングするための詳細な指示が提供されており、摂食に失敗した幼虫が実験結果を混乱させないようにします。鶏卵黄リポソームには、脂肪酸やコレステロールなどの蛍光脂質類似体を添加することができ、食事性脂質処理の全身的および細胞内的な可視化が可能になります。幼虫をマウントするためのいくつかの方法が説明されており、高倍率と低倍率で直立対物レンズと倒立対物レンズの両方を使用した短期および長期のライブイメージングに役立ちます。さらに、蛍光脂質類似体を与えられた幼虫の脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィープレート上の脂質を見つけ、蛍光を定量化することにより、幼虫の食物摂取量を定量化するアッセイも提示されます。最後に、手順の重要な側面、重要な制御、特定の実験上の問題に対処するためのプロトコルの変更オプション、および潜在的な制限について説明します。これらの技術は、焦点を絞った仮説主導の調査だけでなく、食事性脂質代謝や食物摂取の制御を研究するためのさまざまなスクリーニングやライブイメージング技術にも適用できます。

29-31℃でロッカーに供給すると、健康な幼虫（≥95％）の大半は、1時間以内に食べるようになります。卵黄エマルジョンを消費すると、幼虫の腸は、カラーで暗くなります。非常に暗い腸2時間（ 図1）で観察することができます。幼虫が未吸血されているか、または供給するために失敗した場合、腸は透明なまま。幼虫供給卵白展示色で暗くしない膨張した腸管腔。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54735/54735fig1.jpg" /> 図1：食物摂取のための幼虫のスクリーニング野生型6 DPFの幼虫は2時間EMに5％の卵黄を供給または食物を与えられていないコントロールを得るために、EMで平行して処理しました。ステレオスコープの10Xで撮像時に卵黄を消費した給餌幼虫が暗い腸を持っていながら未吸血幼虫は明確な腸を持っています。スケールバーは、0.1ミリメートルを表しています。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをク...

ゼブラフィッシュは、食事の脂質処理と代謝性疾患の貴重なモデルとして浮上しています。脂質が豊富な幼虫の飼料のプロトコル、食事性蛍光脂質類似体のライブイメージング、および食物摂取量の定量化について説明します。これらの手法は、さまざまなスクリーニング、イメージング、および仮説主導の調査手法に適用できます。

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

この実験プロトコルの目的は、ゼブラフィッシュの幼魚に脂質を豊富に含む餌を与え、そこに蛍光脂質アナログを添加することで、幼魚における脂質取り込みの動態を可視化し、食事による脂質摂取量を定量化することです。この手法は、食事性脂質がどのように代謝され、食物摂取がどのように調節されるかといった、代謝および胃腸生物学の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、蛍光脂質アナログを食事性リポソームによって効率的に投与できることです。ゼブラフィッシュ幼魚の光学的な透明性により、顕微鏡を用いて細胞内の脂質処理を明らかにすることが可能です。まず、粉末状の蛍光脂質アナログ 1 mgを 100% chloroform 2 mLに懸濁させ、最終濃度を 0.5 µg/µLにします。このアナログを、溶媒に適しておりテフロンガスケットを備えたねじ蓋付きの茶色ガラス管に分注します。これらのストックをフリーザーで保存します。0.5 µg/µLの蛍光脂質アナログストックを10.4 µL取りて1.5 mLチューブに入れ、窒素気流下で乾燥させます。この際、脂質をチューブ外に吹き飛ばさないよう注意してください。乾燥させた脂質を、チューブの壁面に沿って5 µLの100% ethanolをピペッティングして直ちに再懸濁します。次に、胚培養液を95 µL加え、混合物が均一になるまでピペッティングして十分に混ぜ合わせます。チューブを遮光し、使用時まで氷上に保存します。蛍光コレステロールリポソーム溶液を調製するには、卵黄エマルションに加えた際の最終濃度が2.5 µg/mLになるように、十分な量の蛍光コレステロールアナログストック溶液を1.5 mLチューブに加えます。前述と同様に、窒素気流下でコレステロールストックを乾燥させます。直ちに、チューブの壁面に沿ってピペッティングし、室温の100%エタノール15 µLで蛍光コレステロールアナログを再懸濁します。その後、1%脂肪酸フリーBSAおよび水85 µLと混合します。餌の中での脂質の均一な分布と、すべての幼魚への均等な供給を確実にするため、卵黄エマルションに加える前に、蛍光脂質アナログをエタノールおよび胚培地で完全に溶解させることが不可欠です。チューブをアルミホイルで遮光し、氷上で保存してください。給餌溶液を調製するには、50 mLコニカルチューブに19 mLの胚培地を加え、そこに1 mLの卵黄分注液を加えます。混合物を1〜2分間ボルテックスし、均一なエマルションにします。混合物を微細なストレーナーでろ過してタンパク質凝集物を除去し、新しい50 mLコニカルチューブに回収します。次に、1/4インチのテーパーマイクロチップを用い、6 Wで1秒間オン、1秒間オフのパルス超音波処理を5回行います。超音波処理プログラムをさらに4回繰り返します。これによりリポソームが形成されます。均一性を維持するため、使用時まで絶えずロッキングしながら保持してください。超音波処理の直後に、5 mLのリポソーム混合液に適量の蛍光脂質アナログを添加します。蛍光脂質アナログをリポソームに組み込むため、高速で30秒間ボルテックスします。チューブをアルミホイルで包んで遮光し、再びロッカに戻します。50匹の幼虫を飼育皿に入れ、胚培養液を除去し、5 millilitersの餌を加えます。摂餌を促進するため、インキュベートされたロッカール上での緩やかな揺動を行い、蛍光脂質アナログを使用している場合は遮光してください。給餌期間の終了後、幼生を5 mLの胚培地で3回洗浄します。幼生を固定するため、メタルブロックを氷上に置き、過剰な冷却を防ぐためにティッシュを被せ、その上に胚培地を入れたディッシュを置いて幼生を冷却します。解剖顕微鏡下で10倍で幼虫を観察し、リポソーム飼料を摂取した個体を特定します。リポソームを摂取した幼虫は、腸管が暗色になります。腸管が暗色になっているかを確認し、幼虫が摂食したかどうかを判断することが極めて重要です。通常、幼虫の1〜5%は餌を食べず、これらを特定して除外しないと実験結果に影響を及ぼす可能性があります。倒立対物レンズを用いて長時間・高倍率のイメージングを行う場合は、まず金属ブロックを用いて幼虫を氷上で冷却します。幼虫をガラスボトムディッシュに移し、ティッシュで吸い取って胚培地を除去します。42 °Cに調整した1.2%低融点アガロースを幼虫の上に一滴滴下し、すぐにポーカーで位置を調整します。ディッシュをコールドブロックから取り出し、アガロースを2〜3分間静置します。最後に、アガロースを覆い、乾燥を防ぐのに十分な量の新鮮な胚培養液を加えます。検体のイメージング準備が整いました。リポソーム投与の終了後、洗浄済みの幼虫を最低10匹、1.5 milliliterチューブに集めます。胚培養液を除去し、幼虫を急速凍結させます。対照群として、未給餌の幼虫10匹を用いて別のチューブで同様の操作を繰り返します。サンプルを氷上で保持したまま、各チューブに100 µLのホモジナイズ緩衝液を加え、マイクロチップソニケーターでホモジナイズします。その後、組織を13 mLの培養チューブに移します。各ホモジナイズ緩衝液スラリーに、クロロフォーム：メタノール（1:2）を375 µL加えます。30〜60秒間ボルテックスし、室温で10分間インキュベートします。さらにクロロフォームを125 µL加え、30秒間ボルテックスします。次に、200 millimolar TRIS pH 7.5を125 µL加え、30秒間ボルテックスした後、遮光条件下で2000 ×gで5分間遠心分離します。分離相を乱さないよう注意して、サンプルを遠心機から取り出します。清潔なガラスピペットを使用して、下層の有機相を回収し、清潔な13 mLガラスチューブに移します。上層の水相および中層の幼虫デブリ相が混入しないよう慎重に避け、これらを廃棄します。遮光下で0.12気圧の真空状態で有機相を乾燥させ、液体が蒸発した時点で停止するように注意してください。単一のサンプルを10 µLのクロロホルム：メタノール（2:1）に再懸濁し、サンプル全量をチャネリングされた薄層クロマトグラフィープレートにスポットします。残りのサンプルについても同様に、等間隔でスポットして繰り返します。最後に、蛍光プレートリーダーでプレートをスキャンします。実験条件下でロッカーを用いて給餌した幼魚を観察すると、卵黄乳剤を摂取した魚に典型的な、腸管の暗色化が認められます。未給餌の幼虫は通常、腸が透明であるため、給餌期間中に飼育用処方を摂取しなかった個体を容易に区別できます。蛍光性脂質アナログを投与した幼虫では、この食事性脂質の輸送と蓄積を可視化できます。本例では、8時間の給餌後、消化管全体に蛍光信号が認められます。さまざまな脂質アナログは、それぞれ異なる代謝を経て複合脂質となるため、固有の細胞構造に取り込まれ、可視化されます。ここでは、Fluorescent-C16およびC12アナログが脂質滴を標識します。Fluorescent-C5は、肝管および膵管、脂質滴、細胞膜、および動脈ネットワークを標識します。Fluorescent-C2 analogは、肝管、膵管、および細胞膜を標識します。野生型とApolipoprotein A4B1を過剰発現させた転換個体との摂餌量の比較を調べるため、幼虫の摂餌アッセイを実施したところ、4時間の摂餌において転換個体は野生型よりも摂食量が少ないことが示されました。なお、ペアを組ませた未摂食のコントロール幼虫を用いて、繁殖による個体差の正規化を行いました。給餌後の野生型およびApo A4を過剰発現させた形質転換幼虫の蛍光量を定量化したところ、野生型と比較して形質転換幼虫の摂取量が有意に減少していることが示されました。習熟すれば、卵黄蛍光脂質アナログ餌は約15分で調製可能です。餌の摂取量は、10〜12個のプールしたサンプルを用いて、約4時間で定量することができます。この手順を行う際は、顎の奇形、腸の発達不全、あるいは運動性の低下など、摂食に影響を及ぼす可能性のある発育不全がないか、幼魚をスクリーニングすることが重要です。特定のタンパク質や細胞シグナル伝達経路が摂食や脂質代謝をどのように制御しているかといった追加の疑問を解決するために、薬剤処理やゲノム編集などの手法を本実験プロトコルに組み込むことができます。本手法の開発により、胃腸生理学および細胞生物学の分野の研究者が、ゼブラフィッシュの幼魚における食事性脂質の輸送および蓄積を可視化することが可能となりました。このビデオを視聴することで、脂質を豊富に含むゼブラフィッシュ幼魚用飼料の調製方法、幼魚の摂食スクリーニング、短期的および長期的イメージングのための幼魚の固定方法、および摂食量の定量化について深く理解できるはずです。超音波処理装置の使用には危険が伴うため、注意してください。この手順を行う際は、耳栓などの聴覚保護具を着用してください。

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

本研究では、標準的な胚マイクロインジェクション装置および実体顕微鏡を用いた、ゼブラフィッシュ幼魚への新しいマイクロガバージュ（経管投与）法を提示します。マイクロガバージュが、多様な物質をゼブラフィッシュ幼魚の腸管腔内へ特異的に、かつ制御された量で投与するための安全で効率的な手法であることを実証します。...

ゼブラフィッシュ幼生のMicrogavage

このビデオでは、ゼブラフィッシュの幼生の回避とチグモタキシスアッセイについて説明しています。このビデオでは、視覚嫌悪刺激に反応したゼブラフィッシュの幼生の行動を調べています。...

ゼブラフィッシュの回避とチグモタキシスアッセイ:嫌悪的な視覚刺激に応答した幼虫の行動を調べるためのハイスループット法

我々の研究室では、7日齢のゼブラフィッシュの幼虫で、いくつかの異なる挙動の検出に有用な新規なハイスループット自動化されたイメージングシステムを開発しました。幼虫は、環境毒素又は薬剤に曝露された後にシステムが動作の微妙な変化を検出するために用いることができる。...

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

ここでは、ゼブラフィッシュとヨシノゴチの幼虫ミノーの自発活動と photomotor 応答 (PMR) 自動追跡ソフトウェアを使用して検討するプロトコルを提案します。共通の毒性生物検定株式これらの行動の分析は化学生物活性を調べる診断ツールを提供します。このプロトコルは、カフェイン、モデル neurostimulant...

稚魚の行動応答プロファイルを調べるための実験プロトコル: 神経興奮剤カフェインへの応用

このプロトコルの目的は、高スループット方法でゼブラフィッシュ稚魚の腸を介して蛍光に分類された食物の通過時間を測定することです。...

ゼブラフィッシュ稚魚を用いた消化管通過時間の高スループット測定

ゼブラフィッシュ (動脈分布)...

ゼブラフィッシュ幼虫における食品媒介感染症のための車両として原虫ゾウリムシを使用してください。

ここでは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する方法を実証し、肝臓の成長と発達に対する遺伝的および薬理学的操作の効果を評価する方法を提供する。...

ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化

ここでは、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)関連の肝細胞癌(HCC)ゼブラフィッシュモデルを生成して、肝臓の微小環境と免疫細胞の景観に対するコレステロール余剰の影響を研究する方法を紹介します。...

ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析

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電気的活動の変化を受けた個々の生きたゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイムおよび反復測定

ここでは、長期的イメージング、二光子イメージングと組織損傷のテクニック、およびタイムラプス共焦点イメージングのためのゼブラフィッシュ胚を装着するための方法を説明します。...

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

学ぶ高脂肪食を用いたゼブラフィッシュ幼虫の摂食と脂質代謝の可視化法。蛍光脂質アナログによるライブイメージングで、食物摂取の定量化と細胞内脂質処理を観察できます。

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

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