ろ過水のサンプルおよび環境DNAの抽出のためのフィルターカートリッジの使用

本プロトコルの目的は、フィルターカートリッジを用いて水サンプルをろ過し、ハウジングを切断してフィルターを取り出すことなく環境DNAを抽出することで、さまざまな水生生物のメタバーコーディングeDNAを解析することです。この手法は、生物多様性のモニタリングやコミュニティ生態学など、生態学分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、フィルターカートリッジによってより大量の水サンプルの処理が可能であること、およびろ過とDNA抽出を無菌的に行えることです。

本手順を開始するために、アスピレーターポンプの入力コネクタに高真空チューブを取り付けます。チューブのもう一方の端をマニホールドに接続してください。マニホールドにある3つの赤いT型バルブがオフの位置にあることを確認してください。

次に、清潔な手袋を着用します。真空用ゴムチューブの上端にメスルアーフィッティングを挿入します。その後、下端に真空コネクタを挿入します。

フィルターカートリッジの出口ポートに、ルアーメスコネクタを慎重に取り付けます。次に、真空コネクタをシリコンストッパーに取り付けます。用意したプラスチックバッグに、採取した水を1 L注ぎます。

オスルアーロックコネクタを用いてスクリューキャップを密閉します。次に、組み立てたフィルターカートリッジのインレットポートをオスルアーロックコネクタに注意深く接続します。すべての接続部が確実に固定されていることを確認してください。

次に、プラスチック袋をメッシュパネルの2本の突起に掛けます。マニホールドの入口ポートにシリコンストッパーを挿入します。その後、アスピレーターの電源を入れます。

ろ過を行うため、赤色のTバルブを開きます。フィルターカートリッジが乾くまでマニホールドを作動させます。その後、赤色のTバルブを閉じます。

目的の量の水をろ過するまで、この全工程を繰り返します。採取したすべての水のろ過が完了したら、フィルターカートリッジをプラスチック袋と真空容器から慎重に取り出します。カートリッジの両端を適切なルアーキャップで密閉してください。

次に、耐溶剤性ペンを使用して、カートリッジとインレットルアーキャップにラベルを貼ります。DNA抽出を行うまで20 °Cで保存してください。4 Lを超えるサンプルについては、テキストプロトコルに詳述されている通り、10 Lのブックボトルを準備してください。

ろ過する水試料を加えます。次に、10 mLピペットチップをブックボトルのバルブにしっかりと挿入します。フィルターカートリッジの入口ポートをピペットチップにしっかりと挿入します。

次に、マニホールドの入口ポートにシリコンストッパーを挿入します。アスピレーターのスイッチを入れます。その後、ろ過を行うために赤いTバルブを開きます。

フィルターカートリッジが乾燥するまでマニホールドを運転します。ろ過が完了したら、赤色のTバルブを閉じます。プラスチック袋と真空コネクターから、カートリッジを注意深く取り出します。

次に、カートリッジの両端を適切なルアーキャップで密閉します。耐溶剤性ペンを使用して、カートリッジと入口側のルアーキャップにラベルを貼ります。DNA抽出を行うまで 20 °C で保存してください。

インキュベーターを56 °Cに予熱します。次に、2.0 mLチューブのヒンジキャップを切り取り、廃棄します。フィルターカートリッジからインレットルアーキャップを取り外します。

次に、インレットポートを2.0 milliliterチューブに挿入します。自己封止フィルムを使用して、カートリッジと回収チューブの接続部をしっかりと密封します。続いて、結合したユニットを15 milliliterコニカルチューブ用の遠心機アダプターに挿入します。

フィルター内の残液を除去するため、カートリッジを5000 ×gで1分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、フィルターカートリッジから回収チューブを取り外し、チューブを廃棄します。その後、注入口のキャップを再度締めます。

次に、20 µLのprotein A-Case溶液、220 µLのリン酸緩衝生理食塩水、および200 µLのbuffer ALを混合します。インレットキャップを取り外し、ピペットを使用して混合液をカートリッジに加えます。その際、ピペットをインレットポートに完全に挿入してください。インレットポートにキャップを再度取り付けます。その後、フィルターカートリッジをロータリーシェーカーに設置します。

ロータリーシェーカーを予熱済みのインキュベーターに入れ、回転数を20 rpm、時間を20分に設定します。インキュベーションの間に、耐溶剤性ペンを用いて新しい2.0 mLチューブにラベルを貼ります。その後、それを50 mLコニカルチューブに入れます。

インキュベーションが完了した後、インレットキャップを取り外します。次に、インレットポートを新しい2.0 milliliterチューブに挿入します。コニカルチューブをスクリューキャップで密閉します。

5000 ×gで1分間遠心分離し、抽出したDNAを回収します。次に、滅菌済みのピンセットを用いて、2.0 mLチューブ内のカートリッジを取り除きます。チューブにキャップをし、テキストプロトコルに記載されている手順に従って抽出したDNAを精製します。

この手順では、2種類の異なるフィルターを用い、同一のマニホールドで4つの異なる容量の海水をろ過し、その後eDNAを抽出します。フィルターカートリッジでは、ガラス繊維フィルターよりも平均して50%多くの種が検出されました。この手法を習得し、適切に実施すれば、2時間で完了させることができます。

このビデオを視聴することで、フィルターカートリッジを用いた水サンプルのろ過方法、およびハウジングを切断してフィルターを取り出すことなくeDNAを抽出する方法について、さまざまな水生生物のeDNAメタバーコーディングにおける手順を十分に理解することができます。