過分極 ¹³ C代謝磁気共鳴分光法とイメージング

この手順の全体的な目標は、動的核分極を使用して炭素13標識分子を過分極し、in vitroで炭素13磁気共鳴、レトロスコピックイメージングを使用してそれらのエニズム変換を測定することです。この方法は、炭素の共鳴信号を10, 000〜100, 000倍に増加させ、層状化合物をそれらの代謝産物と区別し、イメージングによって体内に局在化させることを可能にします。この方法の主な利点は、たとえばVR技術と比較して、生体内の自然に存在する物質の代謝をリアルタイムで表示できることです。

また、この方法は、がんの代謝とin vitroでの代謝についての洞察を提供することができます。また、動物モデルや人間の患者にも適用できます。この技術の適用は、腫瘍の局在化を超えています。

代謝性腫瘍のサブタイプを見つけて区別し、最先端の技術と並行して治療を監視するために使用できます。手順を開始するには、まずガドテレ酸メグルミンの1ミリモル溶液と濃縮された1炭素13ピルビン酸溶液を準備します。トリチルラジカルOX063を混合物に添加して最終濃度を15ミリモルにし、完全に溶解します。

DNP Polarizerソフトウェアで、[Cool Down]をクリックして、可変温度インサート(VTI)の温度を1.4ケルビン未満に下げます。VTIが冷えたら、カーボン13ラベル付きサンプル溶液の約8マイクロリットルをプラスチックサンプルカップに入れます。カップをサンプル挿入ロッドに取り付けます。

ソフトウェアで、[サンプルの挿入]をクリックします'通常のサンプルを選択'次に「次へ」これにより、サンプルホルダーが上がり、VTIへのインレットバルブが開き、サンプルの挿入が可能になります。プロンプトで、挿入ロッドを使用してサンプルカップをVTIに押し込みます。サンプルカップを取り外し、挿入ロッドを慎重に引き出します。

サンプルがロッドから切り離され、閉鎖手順中にVTIから押し出されなかったことを確認します。「次へ」をクリックしてバルブを閉じ、サンプルカップを液体ヘリウムに下げてから、「完了」をクリックして最適な分極周波数を見つけるには、まずRINMRソフトウェアを起動します。設定画面で「Select Sample」をクリックし、「Do Micro Sweep」でデータを保存するファイルを作成します。

DNP Polarizerソフトウェアに切り替えます。[キャリブレーション]タブを選択し、マイクロ波スイープパラメータを設定してから、マイクロ波スイーププロセスを開始します。マイクロ波掃引が終了したら、測定された信号振幅の最大値で周波数をメモします。

RINMRソフトウェアに戻り、[Solid Build Up]を選択します次に、DNP Polarizerソフトウェアで[偏光]をクリックします最適なマイクロ波周波数と電力を入力します。「次へ」をクリックします「偏光蓄積モニタリングを有効にする」をクリックし、「完了」をクリックして、サンプルを十分な時間分極し、95%以上の偏光を達成します。偏光中は、収集フラスコを過偏光子サンプル排気管に接続し、分光器の近くに置きます。

110度のRFパルスを3秒間隔で照射する13カーボンスキャンシリーズを搭載した1テスラNMR分光計をセットアップします。ピルビン酸分極中に、細胞培養の準備を開始します。細胞培養フラスコから細胞培地を取り出します。

約10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。培養フラスコに5ミリリットルのトリプシンを追加します。培養物を摂氏37度で3〜5分間インキュベートし、次いで、10%のウシ胎児血清を容量で含有する約5ミリリットルのF12K培地でトリプシンを不活性化する。

次に、所望の数の細胞を含む細胞懸濁液の量をプラスチック製の遠心分離チューブに移します。細胞サンプルを1200 Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、パレットを10%FCSを含む十分なF12K媒体に再懸濁して、最終容量800マイクロリットルを達成します。

懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、温水で満たされたプラスチック容器にチューブを入れます。炭素13磁気共鳴分光法によるデータ収集を開始するには、細胞サンプルを調製し、ピルビン酸分極が95%を超えたら、DNP Polarizerソフトウェアの「Run Dissolution」をクリックします。溶解チャンバーの上部バルブを介して溶解剤の適量をロードします。

溶解スティックをアクティブ位置に動かします。「Next」をクリックして確認し、DNP Polarizerソフトウェアの「Finish」をクリックして、溶出プロセスを初期化します。溶解プロセスが終了するまで待ちます。

細胞サンプルの800マイクロリットルに200マイクロリットルの過分極ピルビン酸溶液を追加します。ピペットでよく混ぜてから、約600マイクロリットルの混合物を5mmのNMRチューブに入れます。NMRチューブを分光器にセットし、「Run」をクリックして測定を開始します。

次に、付属のサンプルカップに付いている溶解スティックをクリーニング位置に移動し、DNP Polarizerソフトウェアの[完了]をクリックします。Carbon 13磁気共鳴イメージングを開始するには、過分極プロセスを開始した後、細胞番号が10以上の800マイクロリットルの再懸濁細胞サンプルを3ミリリットルのシリンジに移します。シリンジを長いカテーテルに接続し、シリンジをMRIスキャンベッドに置きます。

カテーテルがMRIスキャナーの外部に到達するのに十分な長さであることを確認してください。シリンジの隣に、10%ガドテレ酸メグルミンを含む10モルの炭素13尿素を含むキャリブレーションファントムを配置します。カーボン13チューンRFレシーバーコイルをシリンジに置きます。

スキャンベッドをスキャナーに挿入して、対象物がMRIスキャナーのアイソセンターにあるようにします。接続フラスコを過偏光子サンプル排気管に接続し、カテーテルの端の近くに置きます。標準の 3 平面ローカリゼーションシーケンスを実行し、必要に応じてシリンジの位置を調整します。

次に、シリンジの局在をカバーするプロトンT2強調解剖学的配列をセットアップして実行します。得られた解剖学的画像から、Carbon 13ファントムを含む関心領域の5つの連続スライスを選択します。carbon 13 分光キャリブレーション取得を設定し、パルスシーケンスライブラリから 2D ブロックシーガートキャリブレーションシーケンスを選択します。

パルスシーケンスをスキャナーにダウンロードし、分光プレスキャンを実行します。スペクトル振幅プロットで、carbon 13キャリブレーションファントムピークをスキャナー周波数の中心に設定します。レシーバーのゲインを最大に設定し、[スキャン]をクリックしてキャリブレーションシーケンスを実行します。

報告された送信ゲインと中心周波数を記録します。次に、選択した解剖学的スライスのカーボン 13 ケミカルシフトイメージング取得を設定します。2Dエコー平面分光イメージングシーケンスを選択し、パルスシーケンスをスキャナーにダウンロードします。

分光プリスキャンを実行し、キャリブレーション値に基づいて中心周波数と送信ゲインを調整して、MRI分光計のセットアップを完了します。ピルビン酸が95%の偏光に達したら、DNP Polarizerソフトウェアの「Run Dissolution」をクリックし、溶出剤をロードします。溶解スティックをアクティブ位置に動かします。

「次へ」をクリックし、次に「完了」溶解した過分極サンプルが収集フラスコに到達したら、約1ミリリットルの過分極溶液をシリンジに引き込み、200マイクロリットルが細胞サンプルに到達するようにカテーテルに注入します。「スキャン」をクリックして、実験データの取得を開始します。データ収集が終了したら、付属のサンプルカップに付いている溶解スティックを洗浄位置に移動し、DNP NMRソフトウェアの[完了]をクリックします。

ピルビン酸から乳酸への代謝交換速度は、過分極乳酸とピルビン酸の炭素13 NMR分光法信号強度を周波数と時間に関して監視することにより、前立腺癌PC3細胞で研究されました。乳酸動態値は、単純比モデルと2サイト交換微分モデルによって評価され、細胞数に正規化されました。どちらのモデルでも、細胞数の増加に伴って乳酸産生が減少する傾向が観察されました。

これは、細胞濃度が高く、サンプルの粘度が高いことに起因します。細胞数の2倍から10倍から7倍未満のサンプルは、乳酸のシグナル対ノイズ比が非常に小さいため、標準偏差値が大きいため、有益なデータを得るためには、サンプルに少なくともその数の細胞が含まれている必要があることを示しています。空間的局在化は、特定の周波数領域について炭素13画像を取得することができる優れたスペクトル分解能を備えたMRIによって達成されました。

空間分布は、生データから決定されました。カーボン13画像は、以前に取得したプロトン画像と共レジストレーションすることもできます。この実験をマスターし、適切に実行すれば、60分以内に行うことができます。

このビデオを見れば、動的核分極法を用いて目的の分子の過分極を行う方法や、簡単なNMR分光法や細胞イメージング実験を行う方法について、十分に理解できるはずです。この手順を試みるときは、非常に速くすることが重要です。過分極したサンプルが偏光子を離れた後、得られたNMRシグナルは2分以内にすべて失われることを忘れないでください。

結論として、溶解DNPはさまざまなアプリケーションに使用できます。これには、糖尿病などの疾患の研究や、さまざまな種類のがんの代謝変化の調査だけでなく、組織のpHの測定も含まれます。