ハイブリッドカット：手に負えない植物組織試料のための改善されたセクショニング方法

ハイブリッドカット組織切片作製法の全体的な目標は、解剖学的および生物学的研究に適した組織サンプルを作成するために、強靭な繊維とシリカ結晶を持つ切片化された難治性植物組織の完全性を改善することです。高レベルの結晶とシリカを含む植物は、切片化中に深刻なパラフィンの破れや問題を引き起こす可能性があります。この方法により、組織の完全性が大幅に向上します。

この技術の主な利点は、クライオスタット内の超低温下での切片化によりパラフィンブロックが硬化し、結晶せん断の問題が大幅に減少することです。この手法の応用は、in situハイブリダイゼーション、FISH、および内部評価などにまで及ぶ可能性があります。この方法を視覚的にデモンストレーションすることは、パラフィンブロックがステージにしっかりと接着されていることを確認する手順が困難な場合があるため、非常に重要です。

まず、5枚の葉の段階で成熟した胡蝶蘭の植物を選択します。葉を中央の肋骨に沿って引き裂いて慎重に取り除きます。鋭利なメスを使用して、一脚系の3番目または4番目の葉の基部から腋芽を慎重に取り除きます。

すぐにサンプルを15ミリリットルの氷冷PFA固定剤を含むガラスシンチレーションバイアルに入れます。固定液中のサンプルに4°Cで15〜20分間真空を適用します。サンプルから小さな気泡が放出されます。

真空の放出後にほとんどのサンプルが沈むまで、この手順を繰り返します。最後に、掃除機を一晩保持し、翌日ゆっくりと解放します。次に、固定サンプルを15ミリリットルのPBSに浸し、氷上に15分間置きます。

30%50%70%85%95%、そして最後に100%15ミリリットルの2対1の容量のエタノールとキシレン代替混合物を室温でサンプルに浸透させます。サンプルを次の各15ミリリットルに順次配置することにより、浸潤を続けます。

エタノールとキシレン代替品の1対1の体積混合物、エタノールとキシレン代替品の1〜2体積の混合物、そして最後に純粋なキシレン代替品。次に、組織を摂氏60度のオーブンでインキュベートします。15ミリリットルのキシレン代替品とパラフィン混合物を摂氏60度でサンプルに浸透させます。

最後に、15ミリメートルの純粋なパラフィンにパラフィンを2回、摂氏60度でそれぞれ12時間浸透させます。このステップを翌日も繰り返します。埋込みは、金型を62°Cまで温め、その後、約13ミリリットルの溶融ワックスを金型ベースに流し込みます。

温めた鉗子を使用して、組織サンプルを型に移し、目的の位置に向けます。金型を冷却プレートに慎重に移動させ、ワックスが固まるまで放置します。次に、カミソリの刃を使用して、パラフィンサンプルブロックを、上部に台形の表面がある適切なサイズのカラムにトリミングします。

800マイクロリットルの光学切断温度化合物(OCT)をクライオスタットステージの中央に追加します。パラフィンブロックをステージに置き、ティッシュブロックを目的の位置にすばやく向けます。パラフィンブロックとステージをクリスタットチャンバーに移します。

OCTをマイナス42°Cで10分間急速冷凍します。次に、クリスタットアダプターとチャンバー温度をそれぞれマイナス20°C、マイナス16°Cに冷却します。ブロックとステージを crystat アダプターに取り付けます。

次に、組織を厚さ10マイクロメートルに切片化します。鉗子を使用して、ティッシュ切片を拾い上げ、ポリ-l-リジンコーティングスライド上の800マイクロリットルのDEPC処理水に浮かぶように配置します。スライドを摂氏42度に設定されたホットプレートに移します。

セクションを平らにし、濾紙を使用して端から水を吸収します。サンプルを42°Cのホットプレートに一晩放置し、組織をスライドにマウントします。サンプルを脱パラフィンするには、まず、取り付けられた組織スライドを染色ラックに入れます。

150ミリリットルのキシレンを染色ジャーに加え、スライドのラックを5分間浸します。次に、サンプルを室温で一度に3分間、各150ミリリットルのエタノール濃度を減少させて再水和します。最後に、試料を二重蒸留水に3分間浸します。

スライドを150ミリリットルのヘマトキシリン溶液に1.5分間入れて、サンプルを染色します。1〜2滴のN塩酸を含む150ミリリットルの二重蒸留水で数秒間すすぎ、次にスライドを二重蒸留水で短時間洗浄します。室温で3分間、150ミリリットルの一連の増加エタノール濃度を使用して、サンプルをもう一度脱水します。

試料を150ミリリットルのキシレンに5分間浸します。最後に、600マイクロリットルのキシレンベースの封入剤を各スライドに静かに加え、サンプルにカバースリップをかぶせてサンプルをマウントします。この方法を用いて、胡蝶蘭の組織切片を作製し、これには、通常、切片化が困難な腋芽が含まれ、これには高レベルの結晶が含まれている

詳細な構造が保持されているため、タンパク質体の可視化が可能になりました。ハイブリッドカットは、発芽した種子のシュート頂端分裂組織を視覚化するための明確な切片化も生成しました。これらの画像は、従来のパラフィンとハイブリッドカット切片技術を使用したイネと小麦の横方向の葉切片の調製を示しています。

これらの作物は通常、高レベルのシリカを含んでいるため、分別が困難です。ハイブリッド切断切片の組織完全性は大幅に改善され、パラフィンサンプルではしばしば歪んでいたり、パラフィンサンプルで見つけにくい主要な構造が、ハイブリッド切断組織全体で保存されました。さらに、引き裂きはパラフィン切片サンプルでのみ観察されました。

さらに、解剖学的構造の強力な保持により、ハイブリッド切断組織は空間的な遺伝子発現パターンの研究に役立ちます。ここでは、胡蝶蘭の腋芽の2番目と3番目の腋芽のハイブリッド切断切片に対して、ActinとCyclin B1:1とのin situハイブリダイゼーションを行いました。解剖学的保存の改善により、第3腋芽の発達中の分裂細胞における標的遺伝子のより高い発現レベルを検出することが可能になりました。

この手順を試みるときは、パラフィンブロックを硬化させるために、摂氏マイナス16度の温度を維持することが重要です。これにより、高品質の組織切片が得られるはずです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、従来のパラフィンまたはクライオ切片法を使用して蘭の切片化を成功させることに何度も失敗した後でした。

この手順に従うと、in situハイブリダイゼーションやFISHなどのすべての実験を実行して、遺伝子の空間的局在と機能の調査を含む追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、難治性の植物サンプルで高品質の組織切片を作成する方法を十分に理解できるはずです。