Name: ハイブリッドカット：手に負えない植物組織試料のための改善されたセクショニング方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶハイブリッドカット法による手に負えない植物組織のセクショニング技術。Phalaenopsisランなど硬質繊維とシリカ結晶を含む試料の組織構造を高精度に可視化し、in situハイブリダイゼーションやFISHなどの研究に応用できます。

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私たちは、Hong Xian Hsing氏、Min Jeng Li氏、Eric C. P. Wu氏からの技術サポートに感謝しています。英語の編集をしてくださったMiranda Loneyに感謝いたします。

1.固定と埋め込み<ol><li>試薬調製<ol><li> 10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS） <ol><li>二重蒸留水（のddH 2 O）800ミリリットルに80グラムのNaCl、2グラムのKCl、14.4グラムのNa 2 HPO 4、および2.4グラムのKH 2 PO 4を添加し、塩酸でpHを7.4に調整します。その後、千μlのジエチルピロカーボネート（DEPC）を追加し、激しく振る、1 Lの総容量にのddH 2 Oを追加します。ストアPBSで一晩20分次の日のために121℃の室温とオートクレーブで。 </li></ol></li><li> 1×PBS <ol><li> 0.01 MのNa 2 HPO 4、0.002 M KH 2 PO 4、0.003 MのKCl、および0.13 MのNaClの最終濃度を得るためのddH 2 Oで1:10の割合で株式10×PBSを希釈します。 </li></ol></li><li>パラホルムアルデヒド（PFA）固定液 注意：パラホルムアルデヒドは有毒です。ヒュームフードの下準備をします。手袋を着用してください。 <ol><li> 250ミリリットルのPFA固定液を調製するには、100を加熱mlの1×PBS 70 - 80°C及びNaOHの1750μlを添加します。その後、パラホルムアルデヒドの10グラムを追加し、溶解するまで十分に混合します。氷の上でソリューションを配置した後、H 2 SO 4でpHを7.2に調整-冷却した後（260 100ミリリットルのために270μl）を。 </li><li> 1×PBSで250ミリリットルにボリュームを調整し、0.25％の最終濃度になるように625μlのグルタルアルデヒドを追加します。固定液の浸透を容易にするために、250μlのトリトンX-100および250μlのトゥイーン20を追加します。 注：PFA固定液は、固定性を失うことなく、1ヶ月間、4℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> DEPC処理水とエタノールの異なる濃度（30％、50％、70％、85％、95％）を調製。 </li></ol></li><li>植物サンプル収集<ol><li>腋芽<ol><li>四つ葉の段階で成熟した胡蝶蘭の植物を使用してください。慎重に手を使用して、中肋次の葉を引き裂くことによって葉を取り除きます。 </li><li> carefする鋭いメスを使用しますully単軸性の茎上の第3または第4葉の基部から腋芽を削除します。 </li></ol></li><li>種子サンプル<ol><li>受粉後4ヶ月で成熟した蘭の種子のさやを収穫。メスで縦方向にシードポッドをカットします。優しくオープニングシードポッドを振ると、濾紙上で乾燥種子をリリース。 </li></ol></li><li>プロトコーム<ol><li> 1/2×ムラシゲ・スクーグ寒天プレート上に成熟した蘭の種をまくと、12時間の明期と25℃の一定温度で組織培養室で育ちます。播種後7週目に緑のプロトコームサンプル。 </li></ol></li><li>プロトコーム様体（のPLB） <ol><li>ステップ1.2.3.1と同様の成長条件の下で、以前10と場所説明したようにT2は寒天プレートを再生するには蘭のPLBを成長させます。 8ミリメートル - 5の高さで10のPLBを収集します。 </li></ol></li><li>葉のサンプル<ol><li>ステップで説明したように成熟した胡蝶蘭の植物から葉組織を収集1.2.1.1。 </li><li>二新たに開発された葉から葉組織（7ミリメートルの長さのx 5ミリメートル幅）の小片をカットする鋭いメスを使用してください。 </li></ol></li><li>ルートサンプル<ol><li>ステップ1.2.1.1で説明したのと同じ植物を使用して、鋭いメスを用いて根端組織の1cmの長さを分析。 </li></ol></li><li>ヤングスパイク<ol><li>花茎の先端部長さ10cmの若いスパイク組織を切断するために鋭いメスを使用してください。 </li></ol></li><li>花芽<ol><li>蘭の花の茎から直径5mmの小さな花のつぼみを切り出します。花芽組織縦方向（厚さ3mm）の一部をカット。 </li></ol></li><li>葉組織と穀物の小穂組織<ol><li>米、小麦、トウモロコシ植物から最初に新たに開発された葉から1センチメートル長葉身組織をカット。 </li><li> 1日の開花前の植物（米、小麦、トウモロコシ）から10小穂を収集します。 </li></ol></li></ol></li><li>固定<ol><li> 15ミリリットルの氷冷PFA固定液を含むガラスシンチレーションバイアルにそれらを転送することにより、すぐに植物試料を修正しました。 </li><li> 4°C涼しい室内で植物試料を真空（〜720ミリメートルHgの）を適用します。 （小さな気泡がサンプルから放出されるべきである）20分 - 15のための真空を保持します。組織のほとんどが真空のリリース後に沈むまで、この手順を繰り返します。一晩真空を保持し、次の日にゆっくり真空を解放します。 </li></ol></li><li>脱水 注：固定から浸透工程を経て、同じバイアルを使用します。前のステップで解決策を切ると、バイアルに新しいソリューション15mlで置き換えるために、ピペットを注ぐか、使用しています。組織の質感に応じて、より長い時間のために、このような蘭の腋芽、種子、プロトコーム、およびPLB、および米、小麦、トウモロコシの小穂のような硬い組織を扱います。このような蘭の花のつぼみ、若いスパイク、葉や根、短い時間のために米、小麦、トウモロコシの葉のようなより軟らかい組織を扱います。 <oL&gt; <li>固定後、氷上で10分間、PBS 1×15ミリリットルのサンプルを浸します。 <ol><li>次のように室温で15 mlのエタノールシリーズのサンプルを脱水：30分間、30％エタノール、30分間、50％エタノール、1時間70％エタノール、硬い組織のための54分および軟らかい組織30分間85％のエタノール、硬い組織について54分および軟らかい組織30分間2回硬い組織についての54分と柔らかい組織について30分間、95％エタノール、100％エタノール。 注：植物サンプルは数ヶ月間、4℃で70％エタノール中で保存することができます。 </li></ol></li></ol></li><li>パラフィン浸透<ol><li>次のように室温で、硬い組織および軟らかい組織30分54分15 mlのエタノールおよびキシレン代替混合物のサンプルをそれぞれ浸透エタノール/キシレン代替物（2：1、v / v）のエタノール/キシレン代替物（1 ：1、v / v）のエタノール/キシレン代替物（1：2、v / v）で、純粋なキシレン代替倍。注意：キシレンは有毒です。ドラフト内でこのステップを実行してください。 </李&gt; <li>一晩硬い組織のために、60℃のオーブン中で15 mLのキシレン代替とパラフィンの混合物を有するバイアルに試料を浸潤し、軟らかい組織60分間以下のようにキシレン代替物/パラフィン（2：1、v / v）で、キシレン代替物/パラフィン（1：1、V / V）、およびキシレン代替物/パラフィン（1：2、v / v）でした。 </li><li>一日二回15ミリリットルの純粋なパラフィンでサンプルを潜入し、オーブンで60℃でインキュベートします。 </li><li>繰り返しステップは、次の日1.5.3。 </li></ol></li><li>組織の埋め込み<ol><li>パラフィンブロックに組織を埋め込む前に、パラフィンタンク内のワックスを溶融するために、事前に組織包埋センター1時間の電源をONにしてください。 </li><li> 62℃での加温トレイの金型（ベース3.3センチメートル長×2センチ幅のサイズを）ウォームアップ、および金型ベースに溶融ワックスの約13ミリリットルを注ぎます。 </li><li>暖められた鉗子で金型内にセクション1.5.4から1つの組織サンプルを転送し、それを所望の位置に向けます。 </li><li>金型を移動ワックスが固化するまで慎重にクールプレート上に、そして去ります。 </li></ol></li></ol> 2.組織セクショニング<ol><li>パラフィン切片法<ol><li>モールド（セクション1.6.2で同じサイズ）の上に埋め込みカセットを配置することにより、ワックスベースを作成し、溶融ワックスを充填し、ワックスが固化した後、金型を削除します。 注：包埋カセットは、サンプルのパラフィンブロックを固定するために、ワックスベースを形成します。 </li><li>適切な形状と大きさにパラフィンブロックをトリム、および平らなへらにいくつかのワックス片を配置します。ワックスが溶融するまでアルコールバーナーを使用して、ワックス片を加熱し、そのブロックを接着するためにセクション2.1.1中のワックスベースに溶融ワックスを配置します。ミクロトームでそれを固定します。 </li><li>ミクロトーム上に新しいブレードを配置し、ミクロトームで切片を容易にするために、5度の角度を調整します。 </li><li>以前に11説明したように、薄いスライス（10ミクロン）への試料のパラフィンブロックをカット。 </li> &lt;/ OL&gt; </li><li>ハイブリッドカット切片法<ol><li>カミソリの刃を使用して、適切なサイズに上部の台形面でカラムにステップ1.6.4からのサンプルパラフィンブロックをトリム。 </li><li>クライオスタットステージの中央にいくつかの最適切削温度化合物（OCT）を追加します。クライオスタットステージにパラフィンブロックを取り付け、その後すぐに目的の位置に組織ブロックを向けます。 </li><li>クライオスタット室にパラフィンブロック/ステージを転送します。 10月は10分間-42℃で急速凍結バーに固化することができます。 10月（ 図2C）の凝固時にブロックを移動しないでください。 </li><li>クライオスタットアダプタと室内の温度はクライオスタットアダプタにパラフィンブロック/ステージを取り付ける前に、-20℃〜-16℃のそれぞれに冷却できるようにします。厚さ10μmの節組織。 </li><li>鉗子で組織切片を選択してください。ポリで800μlのDEPC処理水のセクションをフロート- L -リジンCOAテッドのスライドと42℃のホットプレート上にスライドを転送します。 </li><li>セクションでは、42℃でのDEPC処理水に平坦化することができるようにします。エッジから水を切るためにろ紙を使用してください。 </li><li>一晩42℃のホットプレート上にスライドを配置することによって、スライド上のマウント組織。 </li></ol></li></ol> 3.組織染色<ol><li>脱パラフィン<ol><li>ホットプレートからスライドを収集し、染色ラックに配置します。ヒュームフードで染色ジャーに150ミリリットルのキシレンを添加し、5分間キシレンにラックを浸します。 </li></ol></li><li>水分補給<ol><li> DEPC処理水にエタノール溶液の異なる濃度（100％、95％、70％、50％、30％）を調製し、それぞれ、異なる染色ジャーに溶液150mlを充填します。 </li><li>エタノール濃度は、室温で3分間、各工程を減少させる一連のサンプルを再水和します。 Dを含む別の瓶に1瓶をラック染色スライドを転送ifferentエタノール濃度：100％エタノール、95％エタノール、70％エタノール、50％エタノール、30％エタノール。 </li><li>再水和した後、3分間のddH 2 Oで標本を浸します。 </li></ol></li><li>ヘマトキシリン染色<ol><li> 1.5分間ヘマトキシリン溶液中で組織スライドを浸漬することによって染色組織サンプル。 </li><li>その後数秒間12 N塩酸（HCl）の2滴、とのddH 2 Oで簡単に洗う- 1を含む2 OはのddHで簡単にすすぎます</li></ol></li><li>脱水<ol><li>室温で3分間、エタノール濃度を増加させる一連のサンプルを脱水：30％エタノール、50％エタノール、70％エタノール、95％エタノール、100％エタノール。 5分間のヒュームフードにキシレンで標本をクリアします。 </li></ol></li><li>取り付け<ol><li>スライド上に適切にキシレン系封入剤の600μLをドロップします。慎重に試料の上にカバースリップを配置。良い品質の画像を取得するために形成する気泡を避けてください。 </li><li>スライドを一晩乾燥を放送することを可能にします。翌日、顕微鏡下で試料を観察します。 注：画像は標本の大きさに応じて400倍の倍率25Xで捕捉しました。 </li></ol></li></ol> in situハイブリダイゼーション4 <ol><li>プローブ合成<ol><li>クローン胡蝶蘭のアフロディーテアクチン遺伝子の特定のコード配列プライマーを用いて、5&#39;-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 &#39;と5&#39;AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3&#39;（242 bpのPCRアンプリコンを得るために）、およびサイクリン; 1遺伝子の特定のコード配列プライマーを用いて、5&#39;-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 &#39;そして、5&#39;ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 &#39;（327 bpのPCRアンプリコンを得るために）12が記載されているように。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってベクター（ 例えば、をpGEMT）に特定のコード配列を連結します。 </li><li> （DIG）ジゴキシゲニン生成し、製造元の指示に従って、SP6 / T7 DIG RNAラベリングキットを使用して、センスおよびアンチセンスプローブを標識しました秒。 </li></ol></li><li> in situハイブリダイゼーション<ol><li>ハイブリッドカット法を用いて生成第2および第3腋芽の組織切片（厚さ10μm）を切断し、コーティングされたスライド上にスライスをマウントします。 </li><li>キシレンで脱パラフィン組織切片は、（3.1.1を参照）、エタノールの濃度（3.2.2を参照）減少で再水和し、30分間37℃での2mg / mlのプロテ​​イナーゼKで消化します。 </li><li>プロトコルに従ってin situハイブリダイゼーションを行いますが、以前に59°Cおよびサイクリンのための60°Cのようなアクチンのためのハイブリダイゼーション温度で、 すなわち 、いくつかの変更を加えて11,13を説明; 1 DIG標識RNAプローブNG 40とスライドをハイブリダイズします。 </li><li> 11に記載されるように、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するために、ニトロブルーテトラゾリウム/ 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート（NBT / BCIP）溶液を使用。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

利益相反は宣言されていません。

植物細胞は、植物組織切片中の組織の裂けの問題を引き起こす堅い細胞壁、厳しい繊維、結晶、及び高い水分含量を有します。パラフィン系切片が頻繁に植物組織のために使用されるにもかかわらず、内因性の結晶を多くの場合（ 図1）切片中に植物組織を切ります。そのため、植物細胞内で本質的に高い水分含有量の、クライオスタットベースの切片は、多くの場合、壊れた細胞を引き起こし、組織切片を割りました。 本研究では、ハイブリッド・カットという名前の組み合わせ、パラフィン包埋し、凍結切片プロトコルが開発され、良質の組織切片を得ました。このプロトコルは、パラフィン包埋を導入することにより、高い水分含有量に関連した問題を解決し、（ 図3）を切片中に低温下でパラフィンワックスを硬化させることにより引き裂き影響を低減します。したがって、この修正されたプロトコルのいずれかパラフィン系切断面上有利です。寧または植物組織の完全性を維持するための凍結切片。 この原稿は、ハイブリッドカット法は、結晶（ 図 3-4）の高レベルを含むなど腋芽、種子、およびPLB、などの胡蝶蘭の多くの組織において組織の完全性を保持することを示しています。また、このプロトコルは、このような高シリカ（ 図5-6）が含まれている生殖器官や米、トウモロコシの葉、小麦のように穀物に適しています。おそらく、このプロトコルは、高い繊維を含む植物の木質に適用することができます。 一般的には、固定組織は徹底的にハイブリッドカットのために非常に重要です。私たちは、ホルムアルデヒド-アルコール-酸性酸（FAA）固定液は、しかし、PFAは、RNAの完全性を維持する中で、FAAより良い作品PFAは等軸方向に芽、根、などのいくつかの反抗組織の組織の完全性を維持するよりも優れていることがわかりました。したがって、PFAは、修正することをお勧めしますin situハイブリダイゼーション（ISH）作業のためのサンプル。ここで説明するプロトコルは、RNA ISH実験のために設計されています。したがって、すべての試薬は、DEPC処理してRNアーゼの混入を排除することによって、RNAの分解を避けるために調製しました。ハイブリッドカット部は解剖学的な研究のためであれば、定期的に逆浸透（RO）水とその派生バッファまたは試薬が許容されます。 3mm未満に試料サイズと厚さを減らすこと浸潤のために有用です。また、脱水、浸透のための浸漬時間の増加は、硬い質感組織のために必要です。このプロトコルの制限が不十分な固定、脱水、および試料の浸透により引き起こされる問題に起因する可能性があります。したがって、各ステップの処理時間の調整は、良好な品質のパラフィンブロックを生成するために重要です。通常、硬い組織は、より柔らかい組織よりも長い処理時間を必要とします。 加えて、我々はハイブリッドカットは、組み合わせのwiで正常に働いていたことを示しました第ISHは、選択された転写物（ 図7）の空間分布を提供します。要約すると、このプロトコルは、植物解剖学の研究に有用であり、選択された遺伝子の組織特異的RNAのマップを提供します。加えて、このようなターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識（TUNEL）アッセイ、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、および免疫染色法などの他の分子の研究に適用することができます。結論として、この改良された組織切片プロトコルは有用と植物群落の研究者に役立つの両方です。

パラフィン系セクショニング方法は、解剖学的研究のために広く使用される技術です。無傷の組織の解剖学的構造の保存は形態学的および生物学的研究のために重要です。パラフィン包埋の細胞及び組織形態学を保持するためのパラフィン包埋切片の技術が有利です。また、パラフィンブロックは、長期間にわたって都合よく保存することができます。しかしながら、パラフィン包埋切片は、細胞内の結晶を含有する植物組織には適していません。細胞内の結晶は、多くの場合、切片中にパラフィンリボンや損傷組織の整合性を引き裂きます。 パラフィン切片とは異なり、凍結切片は比較的高速であり、セクションは、固定、シリアル脱水または培地浸透1を埋め込むことなく得ることができます。凍結切片は、免疫組織化学、in-situでのハイブリダイゼーション、および酵素組織化学などの多くのアプリケーションと互換性があります。凍結切片の他の利点はこの方法は、このような高温や化学処理などの潜在的な変性過程を経由しないということなので、細胞分子は、よく組織切片2内に保存されています。凍結切片は、一般に、パラフィン系、動物組織中の研究のために切片よりも好ましいです。温度を凍結することは、時にはセクションの整合性の品質に影響を与える氷結晶の形成を引き起こすためしかし、凍結切片は、植物の最初の選択肢ではありません。スクロース溶液、ポリエチレングリコール（PEG）、またはグリセロール3などの浸透圧調節は、凍結条件下での結晶の氷の形成を減少させることが報告されているが、改善が最適未満です。 異なる環境に適応するために、異なる植物は、多くの場合、別個の組織の質感および植物細胞は、剛性の細胞壁、タフな繊維、および結晶4,5を形成するために進化してきています。例えば、不溶性シュウ酸カルシウム結晶とシリカ体はではかなり一般的です植物6。ケイ酸体/結晶は、植物構造を維持するのを助ける直立、および穀類植物7-9に病気や害虫を防ぐことが報告されています。 鉢植えの蘭とカット花蘭の市場が繁栄され、それが成長産業である。 胡蝶蘭のアフロディーテ （コチョウラン）は台湾で最も重要な輸出観賞用植物の一つです。重要な努力が胡蝶蘭で開花プロセスの形態学的および生理学的変化を理解するために行われてきました。 胡蝶蘭の花のスパイクは、葉の基部の腋芽から開始されます。クールな周囲温度（約1ヶ月半）の期間の後、腋芽は休眠を破る、拡大、若い花のスパイクに発展するために葉の基部から突出しています。生理学的な、細胞、およびスパイク開始の分子プロセスを理解するために、visuaに強固な解剖学的な技術の開発が不可欠ですタイムリーに平安大町組織またはマーカー。しかし、蘭の組織におけるユビキタス結晶の存在は、特に腋芽に、解剖学的作業を困難にしています。 ここでは、これまで技術的に困難であると見なされてきた手に負えない植物組織のセクションの整合性を改善しようとしました。ここでは、ハイブリッドカットという名前の改良されたプロトコルを示します。これは、クライオスタットを用いて実行されるパラフィン系切片法です。パラフィン包埋は、植物組織における高い水分含有量を解決します。パラフィンブロックを低温で硬化切片、問題を引き裂く結晶が減少し、大幅な組織の完全性を改善します。このプロトコルは、かなり扱いにくい植物試料のための組織の整合性を向上させます。

<table><tbody><tr><td>エンベッディングセンターモデル EC780-1</td><td>CSA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミクロトームモデル RM2255</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クライオスタットモデル CM 1950</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクシオスコープ A1 顕微鏡&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>村重 &ビタミンを含むSkoog培地</td><td>Duchefa Biochemia</td><td>M0222.0050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリー表面除染剤</td><td>Apex</td><td>10-228</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート(DEPC)</td><td>Bio Basic Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>D801154</tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>株式会社MDBio(MDBio)</td><td>101-7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム、結晶 (KCl)</td><td>J.T. Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>リン酸一塩基性カリウム (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>昭和</td><td>19430160</td><td></td></tr><tr><td>硫酸(H2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>ポリオキシエチレン20モノラウリン酸ソルビタン(Tween 20)</td><td>J.T. Baker</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>オクチルフェノールエトキシレート(トリトンX100)</td><td>J.T.ベーカー</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシンチレーションバイアル</td><td>ネワスター</td><td>DG60805-00020</td><td></td></tr><tr><td>デシケーター真空</td><td>バイオレットバイオサイエンス</td><td>TS-402030</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーベーンポンプ RZ2.5</td><td>バキューブランド 36149406</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>J.T.ベーカー</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>サブX&nbsp;</td><td>ライカ Surgipath</td><td>3803670</td><td>キシレン代替品</td></tr><tr><td>パラプラスト プラス&nbsp;</td><td>ライカ サージパス</td><td>39602004</td><td>組織包埋パラフィン</td></tr><tr><td>スーパーフロスト マイクロスライドガラス</td><td>松波</td><td>S7441</td><td></td></tr><tr><td>FSC 22 クリア&nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>3801480</td><td>最適切削温度コンパウンド (OCT)&nbsp;</td></tr><tr><td>キシレン、精製</td><td>ライカサージパス</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td>メル<td>ク</td><td>HX305311</td><td></td></tr><tr><td>塩酸(HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマウント</td><td>ライカサージパス</td><td>3801731</td><td>封入培地</td></tr><tr><td>pGEM T-easyベクター</td><td>プロメガ</td><td>A1360</td><td></td></tr>プロ<tr><td>テイナーゼK</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td>3115879001</tr><tr><td>SP6/T7 DIG RNAラベリングキット</td><td>ロシュ</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP原液</td><td>ロシュ</td><td>11681451001</td><td></td></tr></tbody></table>

ハイブリッドカット：手に負えない植物組織試料のための改善されたセクショニング方法

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

植物の部分の整合性を維持することは、セルラー、組織、あるいは臓器レベルでの詳細な解剖学的構造を研究するために不可欠です。しかし、いくつかの植物細胞は、硬い細胞壁、強靭な繊維および結晶を有します （シュウ酸カルシウム、シリカ、 等 ）、及び高い含水量は、多くの場合、植物組織切片中の組織の完全性を破壊すること。 本研究では、単純なハイブリッドカット組織切片法を確立します。このプロトコルは、パラフィン系切片法を修正し、異なる植物からの組織切片の完全性を改善します。植物組織は、-16℃の低温槽に切片の前にパラフィンに包埋しました。パラフィンブロック、減少引き裂きや引っかき傷、および大幅に改善組織の完全性は、低温で硬化セクショニング。このプロトコルは、成功したシュウ酸カルシウムが豊富な胡蝶蘭の組織ならびに生殖orgaがなどの反抗組織に適用し、NS、米、トウモロコシ、小麦の葉。また、ハイブリッドカットからの組織切片の高品質は、目的の遺伝子の空間的発現パターンを提供するために、in situハイブリダイゼーション（ISH） にと組み合わせて使用することができます。結論として、このプロトコルは、高結晶またはシリカ含有量を含む応性植物組織に特に有用です。良質の組織切片は、形態学的および他の生物学的研究を有効にします。

ハイブリッドカットは、組織切片の完全性を向上させます 生殖花の構造の解剖学を理解することは蘭花開始の基本的なメカニズムを調査するために重要です。しかし、 胡蝶蘭における細胞内のシュウ酸カルシウム結晶の蓄積は、このような研究に困難な作業になります。切削プロセス（ 図1）中に結晶によって引き起こさ裂けに関連する問題を回避するために、我々はハイブリッドカットというシステムを開発しました。このプロトコルは、従来のパラフィン包埋し、凍結切片技術を兼ね備えています。彼らは組織の剛性と高い結晶含有量のために悪名高いですので、我々は最初の胡蝶蘭の腋芽にハイブリッドカットをテストしました。腋芽組織を4％PFA（プロトコル、ステップ1.3を参照）で修正されました。シリアルエタノール脱水し、パラフィンワックス私の後nfiltration、腋芽をパラフィンブロックに包埋しました。ブロックは、（ 図2A）セクショニング前に適当な大きさにトリミングしました。 、OCTの少量次いでクライオスタット段階（ 図2B）の中心に適用しました。パラフィンブロックは、その後、10月を介してステージに貼り付けました。ステージは、（ 図2C）をセクショニングする前に、OCTの完全な凝固を可能にするために10分間クライオスタット中でインキュベートした後、凍結切片を-16で行いました °C室（ 図2D）。 比較として、 胡蝶蘭の腋芽を含むパラフィンブロックは、通常のミクロトーム切片を行いました。 図1Aに示すように、パラフィンリボンの深刻な引き裂きをミクロトーム切片後に観察されました。組織の完全性と細胞構造は、また、（ 図1B）妥協しました。ハイブリッドカット、一方で、保持構造的完全性（ 図3B）で製造無傷組織切片（ 図3A）。 P.の様々な組織にハイブリッドカットの応用アフロディーテ さらにハイブリッドカットの従順をテストするために、我々は胡蝶蘭の異なる組織をテストしました。原因硬化種皮の良い組織の完全性と種子のセクションを得ることがしばしば困難です。このプロトコルを使用して、種子の詳細な構造は、（ 図4A）切片後に保存しました。 図4A、プロテインボディー、共通ストレージ製品14に示すように、明確に識別することができます。ハイブリッドカットも正常に働いており、1ヶ月齢のプロトコームのシュート頂端分裂組織（種子から発芽した構造）（ 図4B）の詳細な構造を示し、プロトコーム様体（のPLB、 図4C）。細胞内の結晶はPLBのセクションで観察された。 胡蝶蘭が厚いとジューシーな葉を持っており、彼らはベンケイソウ型有機酸代謝（CAM）光合成15を -typeを行います。葉身の横断面は、木部と師部（ 図4D）を含む大きな葉肉細胞と維管束を示しました。いくつかの気孔開口部は昼間（ 図4D）の間に背軸葉の表面上に観察されました。実際には、CAM植物は炭素利得を最大化するが、同時に乾燥条件15,16の下で夜に、そのstomatesを開くことによって、水の損失を最小限にするために進化しました。 Pの根端分裂組織アフロディーテは、 図4Eに示されています。根端細胞は非常によく（ 図4E）を切片後に保存された結晶、かなりの数が含まれているように見えました。若い花のスパイクの縦のセクションでは、インフォーマント！を提供しました若い花のprimordials（ 図4F）のアーキテクチャに関するイオン。また、萼片、花弁、唇弁、および花粉塊は明らかに、この5ミリメートルの花のつぼみ（ 図4G）に分化を完了した若い花芽の縦断面から同定することができました。結晶は若い花芽の萼片に蓄積されたことに注意してください。要するに、このプロトコルは、組織の完全性を維持するために、一貫して動作し、解剖学的および可能な細胞の研究を可能にする、完全な形態を生成します。 ハイブリッドカットは穀物における組織の完全性を保持します また、ハイブリッドカット高シリカ含有量17,18が含まれているような米、小麦、トウモロコシなどの穀物でテスト。 図5に示すように、米、小麦、トウモロコシの葉の横断面の組織の完全性が大幅にハイによって改善されましたブリッドカット方法を。木部、師部、葉肉細胞、stomates、および水の損失を回避するために、葉身のローリング制御bulliform細胞が明らかにイネの葉の切片から同定されました。クランツの解剖学、葉肉細胞、およびトウモロコシの葉19,20の維管束が明確に同定されました。トウモロコシの葉の向軸と背軸両側のstomatesの高密度（ 図5）を見つけるために興味深いでした。トウモロコシにおける0.7の向軸と背軸気孔の割合は、以前に21に報告されています。また、このプロトコルはまた、米、小麦、トウモロコシ（ 図6）からの小穂の詳細な細胞形態を提供するために、正常に働いていました。小穂は、豊富なシリカ9を含むことが知られています。通常、それは組織切片を行うことが困難になります。 in situハイブリダイゼーション その場ハイブリダイゼーション（ISH）は、組織レベル11での遺伝子発現パターンを局在化するために開発されました、 22-25。また、ISHは、細胞を提供することができ、多細胞生物におけるmRNA分布のいくつかのケースでは、サブセルラー、解像度26。 ISHの間に、RNAおよび組織の完全性は、選択された転写物についての信頼性の高い空間情報を取得することが不可欠です。我々はハイブリッドカットプロトコルを使用してISHをテストしたアクチン遺伝子 （PATC157348）プライマー5&#39;-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3を用いてクローニング&#39;と5&#39;- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3」された242 bpのPCRアンプリコンを得るために、 サイクリンB1：。。特定の1（PATC146999）遺伝子コード配列プライマーを用いて、5&#39;-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 &#39;と5&#39;- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3&#39; 327 bpのPCRアンプリコンを取得します。 ISH、 アクチンおよびサイクリンB1の後：1の遺伝子発現 若い成熟した腋芽でモニターしました 強いシグナルが3 回目の腋芽に検出して（ 図7）。両方の遺伝子は、 第2および第3の腋芽の分裂組織細胞で発現させました。これらの結果は、ハイブリッドカットが良い解剖学的構造を保持し、空間的な遺伝子発現パターンを提供することを実証しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig1.jpg" /> 図1： 従来のパラフィン切片は、組織の重度のティアリングが発生 胡蝶蘭の腋芽を含むパラフィンブロックは、通常のミクロトーム切片を行いました。パラフィンリボンの重度の引き裂きは、伝統的なミクロトーム切片後に観察された（A） </stronグラム&gt;。組織の完全性と細胞構造はまた、（B）損なわれました。矢印は、組織切片の深刻な引き裂きを示しています。アローヘッドは、水晶体を示しています。スケールバーは100μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig2.jpg" /> 図2： ハイブリッドカットセクショニング法腋芽組織は、PFAで固定し、組織をパラフィンワックスを浸透させ、脱水し、パラフィンブロックに包埋しました。パラフィンブロックを適切な大きさ（A）にトリミングしました。最適切削温度化合物（OCT）は、クライオスタット段階（B）の中心に適用しました。パラフィンブロックをクライオスタットステージに10月に取り付けました。低温下では、パラフィンブロック<html> 10月（C）を介してクライオスタットステージに貼り付けました。組織切片を、-16℃の（D）にクライオスタットチャンバ内で切断しました。スケールバーは0.5センチメートル（A）、および1センチメートル（BD）を表す。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig3.jpg" /> 図 3： ハイブリッドカットは、セクションの整合性が向上しました 胡蝶蘭の腋芽を含むパラフィンブロックは、優れた組織の完全性（B）を持つセクションを（A）を切片ハイブリッドカットを施し、ハイブリッドカット法を作製しました。矢じりは、腋芽組織に埋め込まれた内因性の結晶体を示しています。スケールバーは100μm。目標確認= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig4.jpg" /> 図4： 胡蝶 蘭 の様々な組織切片にハイブリッドカットの適用さまざまな蘭。 組織は、成熟期（A）中のラン種、プロトコームの縦断面図（B）、プロトコーム様体（PLB）の縦断面図（C）の横断面の長手方向断面として、ハイブリッドカット法を用いて切断しました葉身（D）、根（E）の縦断面図、若い花のスパイク（F）、および若い花芽（G）の縦断面の縦断面図。組織切片をヘマトキシリンにより染色しました。 SC、種皮。 PB、タンパク体; M、分裂組織; MP、母PLB。 DP、娘PLB。広告、向軸葉の表面; Abを、背軸葉の表面;セント、気孔; MC、葉肉細胞; VB、維管束。 RC、ルートキャップ。 FB、花芽。 SE、がく片。 PE、花びら。ラ、唇弁。ポー、花粉塊。 Roを、小嘴。カルシウム、カルス。矢印は結晶を示しています。スケールバーは20μmで（AE）及び200μmの（FG）を表す。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig5.jpg" /> 図5：ハイブリッドカットは、いくつかの穀物で葉組織の整合性を保持し 、従来のパラフィン法（左側のパネル）と、この研究（右側のパネル）で開発されたハイブリッドカット技術を使用して、葉組織の比較。画像は米、小麦、トウモロコシの葉の横断面を示しています。 MC、葉肉細胞; Phは、師部;セント、気孔; BC、BU<html> lliformセル。矢印は、組織切片の引き裂きを示しています。矢頭は、シリカ体を示しています。青い破線の円は、C4トウモロコシにおけるクランツの解剖学を示しています。スケールは20μmでバー。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig6.jpg" /> 図6： ハイブリッドカットは、いくつかの穀物に小穂の組織の完全性を保持し 、従来のパラフィンおよびハイブリッドカットの方法の間の小穂のセクションの組織の整合性の比較。矢印は、組織切片の引き裂きを示しています。矢頭は、シリカ体を示しています。スケールバーは20μm（米）、および200ミクロン（小麦、トウモロコシ）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 1 &quot;&gt;：&quot;キープtogether.within-ページ= FO &quot;ENT <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig7.jpg" /> 図7： アクチン および サイクリン の in situハイブリダイゼーション ; 2 番目の腋芽と3 番目の腋芽の胡蝶 蘭 の腋窩芽で 1 発現パターンの組織切片は、ハイブリッドカット法を用いて調製しました。 アクチンおよびサイクリンの40 ngの合計; 1 DIG標識プローブは、ハイブリダイゼーションのために使用しました。センスプローブを陰性対照として使用しました。矢印は腋芽の生殖分裂組織を示しています。スケールは100μmのバー。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、抵抗力のある植物組織に有用な単純なハイブリッドカット組織切片法を説明しています。良質な組織切片は、解剖学的研究や、in situハイブリダイゼーション(ISH)を含むその他の生物学的研究を可能にします。

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

ハイブリッドカット組織切片作成法の全体的な目的は、強靭な繊維やシリカ結晶を含む難切削性の植物組織における切片の完全性を向上させ、解剖学的および生物学的研究に適した組織サンプルを作成することです。結晶やシリカを高含有する植物は、切片作成中に深刻なパラフィン破れや問題が生じることがあります。本手法は、組織の完全性を大幅に改善します。本手法の最大の利点は、クライオスタットを用いた極低温下での切片作成によってパラフィンブロックが硬くなるため、結晶の剪断問題が大幅に軽減されることです。この手法は、in situ ハイブリダイゼーションやFISH、内部評価などに適用可能です。パラフィンブロックをステージにしっかりと密着させる手順は困難を伴う場合があるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠となります。まず、葉が5枚の段階にある成熟したコチョウラン（phalaenopsis orchid）の個体を選択します。中肋に沿って丁寧に引き裂くようにして葉を取り除きます。鋭利なメスを用い、単一茎（monopodial system）の3枚目または4枚目の葉の基部から、側芽を慎重に摘出します。サンプルを、15 millilitersの氷冷PFA固定液が入ったガラス製シンチレーションバイアルに直ちに投入します。固定液中のサンプルに、4 °Cで15～20分間真空をかけます。これにより、サンプルから小さな気泡が放出されます。真空を解除した後にほとんどのサンプルが沈降するまで、この手順を繰り返します。最後に、一晩真空状態を保持し、翌日にゆっくりと解除します。次に、固定したサンプルを15 millilitersのPBSに浸し、氷上で15分間静置します。15 mLのエタノールを用いて、濃度を段階的に上げてサンプルを脱水します（30%、50%、70%、85%、95%、そして最後に100%）。室温で、エタノールとキシレン代替剤を体積比2:1で混合した溶液15 mLを用いてサンプルに浸透させます。続いて、以下の各溶液15 mLにサンプルを順次浸漬し、浸透処理を継続します。エタノールとキシレン代替剤を1:1（容量比）で混合した液、エタノールとキシレン代替剤を1:2（容量比）で混合した液、そして最後に純粋なキシレン代替剤を順に使用します。その後、組織を60 °Cのオーブンでインキュベートします。60 °Cに保持した15 mLのキシレン代替剤およびパラフィン混合液でサンプルを浸透させます。最後に、60 °Cで12時間ずつ2回、15 mmの純パラフィンで浸透させます。翌日、この手順を繰り返します。包埋を開始するには、まず金属モールドを62 °Cに温め、次に約13 mLの溶融ワックスをモールドの底部に注ぎます。温めたピンセットを用いて、組織サンプルを型に移し、任意の方向へ向きを調整します。型を慎重に冷却プレートの上に移動させ、ワックスが凝固するまで静置します。次に、カミソリを用いてパラフィン包埋ブロックを適切にサイズ調整し、上面が台形となる柱状に切り出します。800 µLの光学切片作製用包埋剤（OCT）をクライオスタットのステージ中央に添加します。パラフィンブロックをステージ上に置き、組織ブロックを目的の方向に素早く向けます。パラフィンブロックとステージをクライオスタットのチャンバーに移動させます。OCTを-42°Cで10分間急速凍結させます。次に、クライオスタットアダプターとチャンバーの温度を、それぞれ-20°Cおよび-16°Cに冷却します。ブロックとステージをクライオスタットアダプターに取り付けます。次に、組織を10 µmの厚さに切片化します。ピンセットを使用して組織切片を回収し、ポリ-L-リシンコートスライド上の800 µLのDEPC処理水に浮かべて配置します。スライドを42 °Cに設定したホットプレートに移します。切片を平坦にし、ろ紙を用いて端から水分を吸収させます。組織をスライドに密着させるため、サンプルをホットプレート上の 42 °C で一晩放置します。サンプルの脱パラフィンを行うには、まず組織をマウントしたスライドを染色ラックに入れます。染色瓶にキシレンを150 milliliters加え、スライドラックを5分間浸します。次に、室温で濃度を下げたエタノール溶液（各150 milliliters）に順次3分間ずつ浸し、サンプルを親水化させます。最後に、検体を2回蒸留水に3分間浸します。スライドを150 millilitersのヘマトキシリン溶液に1.5分間浸し、サンプルを染色します。1〜2滴のN塩酸を含む150 millilitersの二回蒸留水で数秒間すすぎ、その後、二回蒸留水でスライドを短時間洗浄します。室温で、濃度を上げた一連の150 millilitersのエタノール溶液を用いて、それぞれ3分間、サンプルを再度脱水します。検体を150 millilitersのキシレンに5分間浸します。最後に、各スライドにキシレンベースのマウンティング剤を600 microlitersずつ慎重に滴下し、検体の上にカバーガラスを被せて封入します。この方法を用いることで、結晶を多く含み切片作成が困難とされる腋芽を含む、コチョウランの組織切片を作製することができました。詳細な構造が保持され、タンパク質体の可視化が可能となりました。また、ハイブリッド切片法により、発芽種子の茎頂分裂組織を可視化するための明瞭な切片が得られました。これらの画像は、従来のパラフィン法とハイブリッド切片法を用いて作製した、イネおよびコムギの葉の横断切片の調製過程を示しています。これらの作物は通常、高濃度のシリカを含んでいるため、切片作成が困難です。ハイブリッドカット切片では組織の完全性が大幅に改善され、パラフィン標本では歪みやすく、あるいは見つけにくいことが多い主要構造が、ハイブリッドカット組織では完全に保持されていました。さらに、組織の裂けはパラフィン切片サンプルにおいてのみ観察されました。さらに、解剖学的構造が強力に保持されるため、ハイブリッドカット組織は空間的な遺伝子発現パターンの研究に有用です。本研究では、コチョウランの第2および第3腋芽のハイブリッドカット切片を用いて、ActinおよびCyclin B1:1によるin situ hybridizationを行いました。解剖学的保存状態が向上したことで、第3腋芽の発達中の分裂組織細胞において、標的遺伝子のより高い発現レベルを検出することができました。この手順を行う際は、パラフィンブロックを硬化させるために−16 °Cの温度を維持することが重要です。これにより、高品質な組織切片が得られます。私たちは、従来のパラフィン法や凍結切片法ではランの切片作成に何度も失敗した経験から、この手法を考案しました。本手順に従うことで、遺伝子の空間的な局在や機能の解析を含む、さらなる疑問を解決するためのin situ hybridizationやFISHなどのあらゆる実験を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、難切削性の植物サンプルにおいて高品質な組織切片を作成する方法について、十分な理解を深めることができるでしょう。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

本方法は、生検および脳スライスのような小さな、困難な管理するために、組織片、の切片再現可能なクライオスタットを可能にします。我々は日常的に400ミクロン厚の脳スライス5〜10ミクロンの連続切片を生成するために組織の取り扱いと標準クライオスタットを容易にするためにシンプルなアルミの凍結の段階を利用する。...

免疫組織化学のためのスライス標本の薄いセクショニング

植物の転写産物の正確な位置のためのin situハイブリダイゼーション

このプロトコルは、走査型電子顕微鏡 (SEM) を用いたナノスケールの分解能でイメージングのための組織の特定のセルを対象します。多数の生物学的素材の樹脂包埋切片に SEM...

大ボリューム内の特定の細胞内標的を見つけるため連続切片的階層構造イメージング

ここでは、パラフィン切片を改善するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、切断と従来の方法に必要な転送処理を避けるために簡単な恒温室を使用して浮動小数点を兼ね備えています。その結果、そのままパラフィン切片数と効率が大幅に向上。...

切削とフローティング区分のための組織のパラフィン包埋法

ヒトの女性の前部からSRμCT実験用に均一な大きさの皮質骨標本を調達するために、地質学的(スコア)サンプリングプロトコルを用いた。この方法は、最小限の破壊的で効率的な結果、不規則なサンプル形状からのイメージングアーティファクトを最小限に抑え、マイクロアーキテクチャの可視化と分析を改善する円筒形の標本を生み出します。...

高スループットコルティカル骨サンプルの採取と分析のための断面化、スコアリング、画像処理ガイド

ここに示されているのが、植物組織のレーザー捕捉マイクロ解剖(LCM)のプロトコルです。LCMは、汚染のない方法で組織の領域を単離するための顕微鏡的な技術です。手順は、組織固定、パラフィン埋め込み、切片、LCMおよびRNA抽出を含む。RNAは、下流組織特異的な、一時的に分解されたトランスクリプトムの分析に使用される。...

植物における空間的および時間的組織特異的な遺伝子発現解析のためのレーザー捕捉マイクロ解離RNAシーケンシング

この技術は、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒およびタンパク質体の観察と分析のための全種サイズの樹脂セクションの迅速かつ簡単な調製を可能にする。...

全種サイズ樹脂断面の簡易ドライ断面化方法とその応用

自動組織解剖によるデジタル注釈は、腫瘍含有量の低い症例で腫瘍を濃縮するための革新的なアプローチを提供し、パラフィン組織と凍結組織の両方のタイプに適応可能です。説明したワークフローは、精度、再現性、スループットを向上させ、研究と臨床の両方の場面に適用することができます。...

低腫瘍含量組織における腫瘍濃縮のための自動解剖プロトコル

このプロトコールは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料の腫瘍含量パーセントを増加させる方法を提示する。...

腫瘍マクロ解剖による腫瘍含量の増加

このプロトコルは、菌根菌で発芽した植物組織および種子における真菌コロニー形成を研究するために、走査型および透過型電子顕微鏡、光学顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡などのさまざまな顕微鏡技術を適用して、マイコ従属栄養植物サンプルを収集、固定、および維持するための詳細な手順を提供することを目的としています。...

菌従属栄養植物組織における真菌のコロニー形成と種子の共生発芽を解釈するための顕微鏡技術

C3 と C4 の葉の断面の解剖学的違いを評価することは、光合成効率を理解するのに役立ちます。この論文では、フリーハンドおよび半薄葉の断面の準備と検査、および作物種 Triticum aestivum および Zea...

フリーハンドおよびセミシン切片を用いたC3およびC4光合成分化のためのTriticum aestivumおよびZea maysの構造形質の評価

学ぶハイブリッドカット法による手に負えない植物組織のセクショニング技術。Phalaenopsisランなど硬質繊維とシリカ結晶を含む試料の組織構造を高精度に可視化し、in situハイブリダイゼーションやFISHなどの研究に応用できます。

ハイブリッドカット：手に負えない植物組織試料のための改善されたセクショニング方法

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