蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

このプロトコルの全体的な目標は、蛍光相関分光法を使用して、初代免疫細胞の膜における標識タンパク質の拡散速度を測定することです。この方法は、より活性な膜受容体ダイナミクスを持つナチュラルキラー細胞の同定など、免疫学および細胞生物学の分野における重要な問題を特定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、生細胞で使用されるため、分子の動きに自然な状態を正確に反映することです。

この技術の意味は、分子拡散などのさまざまなナチュラルキラー細胞形質が、効率をよりよく予測できる機能に関連している場合、癌の免疫療法にまで及びます。この方法は、免疫細胞の分子運動に関する洞察を提供しますが、あらゆる分野の他の初代細胞や細胞株にも適用できます。ソフトウェアをエキスパートモードで開き、[新しい画像をスキャンする]オプションを選択します。

共焦点レーザー走査型顕微鏡で40倍水対物レンズを選択します。「Acquire」タブで、「Config」ボタンと「Scan」ボタンを押して、「Configuration Control」と「Scan Control」を開きます。「ConfoCor」タブで「Measure」を押し、「Measurement」ウィンドウを開きます。

次に、FCS測定値を保存するフォルダを作成します。新しい画像データベースを開始するには、[ファイル] タブの [新規] をクリックします。ハロゲンランプを点灯します。

レーザーボタンを使用して、蛍光色素を励起するための関連するレーザーをオンにします。次に、[Configuration Control] ウィンドウでイメージ キャプチャの設定を指定します。これには、励起レーザー、励起および発光フィルター、光路、および使用中の検出器が含まれます。

同様に、「Measurement」ウィンドウに移動し、「System Configuration」タブでFCS設定を調整します。FCS録音の検出チャンネルをアクティブにするには、緑のチャンネルをCh 1、赤のチャンネルをCh 2に切り替えます。レーザーが安定する間(最大30分かかる場合があります)、ピンホールを調整します。

まず、ポリ-L-リジンでコーティングされた8ウェルチャンバーカバーガラススライドの1つのウェルに、50マイクロリットルの色素滴を中央に置きます。隣接するウェルは、キャリブレーションがスライドに依存するため、セル測定に使用されます。40X水対物レンズに蒸留水を一滴垂らし、スライドを配置します。

次に、Visを押して可視光源を選択し、蛍光色素滴の中心位置に焦点を合わせます。ソフトウェアの「測定」ウィンドウで、「アクイジション」タブを選択し、「ポジション」で現在の位置を切り替えます。次に、同じウィンドウの[システム構成]タブに戻り、緑色のレーザーのパワーを高または飽和に設定します。

信号の安定性をテストするには、[開始] を押して新しいウィンドウを開き、[時間トレース] と [自動相関] 曲線を表示します。蛍光シグナルが高く安定していること、およびy軸がキロヘルツ範囲の変動を示していることを確認します。値が低いのは、不正確な焦点合わせまたは色素の劣化が原因である可能性があります。

次に、[測定]ウィンドウで、[O調整]ボタンを選択します。次に、正しい検出チャネルを選択し、自動調整Xを押します。結果の曲線の上限が欠落しているか、中央に配置されていない場合は、[粗い]オプションをマークし、[自動調整X]を再度押します。X方向を調整した後、自動調整Yを押してY方向についても同じことを行います。粗い選択を解除し、両方が明確な最大値と安定した値になるまで自動調整を押してXとYを交互に調整します。

細胞が2つの異なる蛍光色素で標識されている場合は、隣接するチャンバーに赤色の蛍光色素溶液を一滴加えます。次に、2番目のチャネルを調整します。赤色レーザーを高出力に設定し、安定性校正手順を繰り返します。

次に、フォーカスを介して自由に拡散する蛍光色素の通過時間を測定します。そして、ステージを使用して、焦点内にある細胞膜の面積を計算します。まず、調整手順を慎重に実行することにより、溶液の液滴に焦点を当てます。

次に、測定ウィンドウの「アクイジション」タブに移動し、アクイジション時間を30秒に設定し、3回繰り返します。レーザー出力を飽和状態近くに設定し、[開始]を押して測定を行います。測定が完了したら、分子またはCPMあたりのカウントを記録します。

次に、新しい測定を行い、レーザー出力を繰り返し削減します。この電力範囲内で、今後のセル測定の予想電力を含めます。次に、CPM値がレーザー出力に比例してスケーリングしていることを確認します。

スケールの残りの部分が線形であれば、最高電力での飽和は許容されます。新たに標識した蛍光抗体を初めて使用する場合は、自由拡散抗体のFCS測定を行い、予想されるCPMを定量化します。また、遊離抗体にはPEG Poly-L-Lysineでコーティングされたウェルを使用することが重要です。

この手順では、チャンバー付きスライドにポリエチレングリコールにグラフトされた200マイクロリットルのPoly-L-Lysineをコーティングします。溶液を室温で1時間接着させます。ストック溶液は最大2週間冷蔵できます。

また、粉末ストックは冷凍庫に保管する必要があります。後で、液体を取り除き、チャンバーを風乾させます。顕微鏡で、抗体をPBSで1ミリリットルあたり1〜10マイクログラムに希釈します。

遊離蛍光色素について前のセクションで説明したように、遊離抗体の通過時間の測定に進みます。細胞内で測定するには、PBS中の125マイクロリットルの細胞と、抗体標識細胞懸濁液からの1%FCSを加えます。そして、150マイクロリットルの透明なロズウェルパークメモリアルインスティテュートミディアム1640をPLLコーティングされたスライドガラスの空の井戸に入れます。

細胞を暗所で測定温度で少なくとも20分間インキュベートしてから、細胞が接着して平衡化できるようにします。高速XYスキャンでイメージングを開始し、細胞の観察に必要な可能な限り低いレーザー出力を見つけます。次に、膜が明確に定義されている平均的な明るさの丸いセルに画像を配置します。

細胞質に蛍光シグナルがないことが重要です。セルが画像の大部分を覆うまで拡大します。次に、細胞膜の上部に焦点を合わせます。

細胞の中心から始めて、画像の中心が均一な蛍光を発する小さな丸い領域を示すまで上に移動します。焦点を慎重に配置することが重要です。焦点がメンブレンにない場合、検出される蛍光は蛍光標識されたメンブレン受容体から来ません。

したがって、結果は彼らの行動を反映していません。次に、[Measurement]ウィンドウの[Acquisition]タブで、[Crosshair]をアクティブにしてFCS測定の位置を選択します。次に、繰り返し回数を 6 から 10 に設定し、[測定時間] を繰り返しあたり 10 秒に設定します。

次に、[測定]ウィンドウの[システム構成]タブに戻り、FCS測定のレーザー出力を1〜10マイクロワットに下げます。次に、[スタート]を押します。最初の10秒間に強度トレースが30%以上低下した場合、セルは過度に漂白されているため、別のセルを低い電力で測定する必要があります。

信号が失われた場合は、フォーカスをZ方向に調整して測定を再開してください。測定が完了したら、スキャン制御ウィンドウでセルがまだ中央に配置されていることを確認して、メンブレンが測定されたことを確認します。セルが移動した場合は、データを破棄します。

次に、[自動相関]ウィンドウに移動し、ズーム操作、漂白、大きなクラスター、またはその他のアーティファクトを含む個々の繰り返しを手動で削除します。右クリックして「削除」を選択し、アーティファクトを削除します。実際の成果物を選択するには、練習が必要です。

繰り返しの削除は簡単なプロセスですが、削除すべきものと削除すべきでないものを知るために、繰り返しを正しく評価する必要があります。次に、最終ファイルをFCS形式で保存します。アーティファクトの削除後に少なくとも 4 回の繰り返しが残っているセルのみを、さらなる分析のために保持します。

典型的な膜受容体の自己相関曲線は滑らかで、通過時間は10〜400ミリ秒の範囲です。最も急な傾斜部分の始点と終点の両方(拡散を表す)が表されるように、フィット領域を設定します。2次元の自由拡散のモデルを使用してデータを適合させ、曲線の最も深く傾斜した部分に注意を払います。

残差に見られるタウスケールでの1秒前後の小さな変動は許容されます。曲線の適合度が悪いが、セルに明らかな問題 (移動、漂白、クラスターなど) がない場合は、モデルの開始値または上限と下限を変更する必要がある可能性があります。モデルが自己相関曲線にうまく適合したら、変数パラメータの値を抽出します。

分子の数は、内因性発現タンパク質の場合、1平方ミクロンあたり0.5から約200の間で変化します。細胞測定によるCPM値が、自由拡散抗体から記録されたCPM値の33%以上であることを確認してください。このビデオを見れば、蛍光相関分光法を使用してタンパク質の拡散速度を測定する方法について十分に理解できるはずです。

一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば5〜6時間で実行できます。この手順を試みるときは、測定開始の約20分前まで細胞を氷上に置いておくことが重要です。サンプルを2時間以上測定しないでください。

この手順に続いて、拡散速度が特定のタンパク質の発現レベルとどのように相関するかなど、追加の質問に答えるために、イメージングなどの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、分子生物学と免疫学の分野の研究者が生細胞内のタンパク質のダイナミクスを探求する道を開きました。