Name: 蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 学ぶ蛍光相関分光法による初代免疫細胞のプラズマ膜タンパク質拡散測定。生細胞での膜受容体動態解析により免疫細胞機能とがん免疫療法への応用可能性を評価する手法です。

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我々はツァイスConfocor 3機器のメンテナンスのため、およびセル測定に関する役立つヒント博士Vladanaブコエビッチ、分子医学センター、カロリンスカ研究所に感謝します。この研究はVetenskapsrådet（承認番号2012- 1629年）、マグナスBergvallsのstiftelseから、とStiftelsenクレスGroschinskysのminnesfondからの助成金によって賄われていました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

FCSのためのこのプロトコルは、免疫細胞（マウス、ヒト、または他の種）のすべてのタイプの表面分子の分子動力学の評価のために使用することができます。生細胞における単一分子の解像度にダウンFCS対策時空間分子動力学を。分子密度、ならびに目的のタンパク質の拡散速度とクラスタリングのダイナミクスは、自己相関曲線から抽出することができます。 蛍光標識は、成功したFCS実験のために極めて重要な重要です。細胞膜上で目的のタンパク質は、従来の抗体を用いて標識され、抗体はしばしば、ナイーブ免疫細胞における表面タンパク質の使用のために最も便利です。非標識抗体は、直接、高分子明るさと光安定性の蛍光色素に結合させなければなりません。抗体結合のための蛍光体の選択は、測定の質のために重要です。フローサイトメトリーのための標準的なラベル例えばフルオレセインおよびフィコエリトリン系染料として、急速な漂白に推奨されていません。抗体に直接結合するフォト安定染料は、現在、いくつかの企業によって提供されています。製造業者は、通常、得られたコンジュゲート抗体のコンジュゲーション及び精製のために十分なプロトコルを提供し、こ...

多くの免疫細胞の機能は、分子拡散し、膜内の相互作用に依存しています。生体膜は複雑であり、免疫細胞の機能に重要であり得る多くの因子が細胞膜1内のタンパク質の並進拡散の速度に影響を与えることができます。我々は最近、自然免疫系に属するナチュラルキラー（NK）細胞、リンパ球、NK細胞活性化2の状態に応じて、細胞膜の2つの研究のタンパク質の差拡散を示すことが示されました。 蛍光相関分光法（FCS）は、生体膜内の分子の拡散速度を定量化することが可能な技術です。これは、固定されたボリューム内の蛍光標識された分子の平均拡散速度、共焦点顕微鏡の一般的に焦点を報告します。これは、中分子運動の際に発生する蛍光の変動の測定に基づいています定常状態でのシステム。 FCSは、溶液中及び脂質膜の中に両方の蛍光色素とタンパク質の拡散を研究するために広く使用されています。拡散速度に影響を与える他の出力パラメータは、また、間接的にこの方法で研究することができる（ 例えば、タンパク質または細胞膜上の分子の相互作用の立体構造変化）3、4。 FCSは、単一分子検出のための可能性を可能にする、その高い感度のために他の技術に比べて際立っています。これは、ほとんどのタンパク質5の内因性発現レベルに典型的なミリモルの範囲にナノモル、中の分子の濃度に適しています。他のほとんどの技術が唯一のタンパク質発現レベルについての相対的な情報を提供しながら、さらに、FCSは、研究ボリューム内のタンパク質の絶対数の近似値を与えることができます。膜内の分子拡散速度を測定する他の方法は、フルオが含まれます（FRAP）を光退色後のrescence回復、単一粒子追跡（SPT）は、複数のピンホールFCS、および画像相関方法。 FRAPと画像相関法は、一般の分子10の絶対数についての情報を与えていないアンサンブル技術です。 SPTと比較すると、FCSのスループットは、母集団の平均を特徴付けるの点で高くなっています。レーザー焦点内に存在する分子の平均拡散速度がなく、1つの分子の速度よりも、測定されているので分析も負担が小さいです。特殊な顕微鏡は11用意されていない限り、標準的なSPTの標識は、単一分子の同定を可能にするために非常に低くなければならないためにも、SPTは、濃度に関する情報を与えることはできません。一方、FCSは、研究中の分子がモバイルであることが必要です。それは単に非常にゆっくりと移動し、任意の推定される不動の分画または分子を検出しません。その分子の拡散速度取得時間の10分の1程度が正しくFCS測定3、12で表現されることはありませんよりも長い焦点内に存在します。したがって、FCSによって記録された拡散係数がto-不動-近く、非常に遅い画分も同様に考慮されFRAPとSPT、のような技術から報告拡散速度よりも速くなる傾向があります。 SPTはまた、FCSの意志よりも分子集団内での拡散速度の変動のより詳細な説明を行います。 FCSは興奮ボリューム内の経時的な蛍光強度の変動を定量化します。膜測定の場合には、これは、膜の照明領域に変換されます。本稿では、そのような変動はブラウン拡散を示す分子によって誘導されるため、および励起体積の外に移動しているという事実を利用しています。 fluctuaのためのいくつかの他の可能なソースもあります。このような結合バインド解除、全細胞膜のリガンド、または運動の、点滅またはフルオロフォア、環境への影響で三重項状態の存在のような蛍光シグナルのン、。これらの推定上の誤差源は、正確な結果12、13を解釈するためにFCS実験を設計する際に考慮される必要があります。一般的に、生体膜における横方向の拡散率は、膜タンパク質の間にタンパク質および細胞骨格間の両方、混雑との相互作用に起因する低いです。歴史的には、膜中のFCSを使用することは、従って、励起焦点14を貫通通過時間中に退色を避けるために必要な光安定性蛍光体の欠如によって妨げられてきました。しかし、今日、適切な光安定性染料のためのオプションがたくさんあります。検出器および他のハードウェアの大幅な改善はまた、蛍光proteの検出を可能にします低輝度のインおよび染料。ここでは、目的のタンパク質は、蛍光タグ化抗体で標識されたマウス初代リンパ球を用いたFCSの適用のための基本的な手順について説明します。拡散係数および分子密度を抽出するために自己相関曲線を適合させる手法も示されています。プロトコルは、簡単に分子の拡散を研究するための技術の以前の経験を持つ免疫学者が続くことを目指しています。しかし、共焦点顕微鏡の基本的な理解が期待されている（参照15を参照して 、この基本的な理解を得るために）。このプロトコルは、比較的容易に他の懸濁細胞、細胞株および初代細胞の両方に適合させることができます。より洗練された分析方法が存在し、より経験豊富なFCSユーザーの場合、そのうちのいくつかは、議論に記載されています。

<table><tbody><tr><td>MACS NK細胞分離キットマウスII</td><td>Miltenyi Biotec NordenAB</td><td>130-096-892</td><td>NK細胞のネガティブセレクション</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>F7524</td><td>熱不活化</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>-</td><td>-</td><td>自社製&nbsp;</td></tr><tr><td>ロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地1640</td><td>PAA The Cell Culture Company&nbsp;</td><td>E15-848</td><td>Transparent</td></tr><tr><td>medium 抗体クローン 2.4G2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>553140</td><td>Fc-receptors.</td></tr><tr><td>抗Ly49A抗体&nbsp;</td><td></td><td></td><td>モノクローナル抗体は自社製で、Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Clone JR9.318</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H-2Dd antibody&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>558915</td><td>社内で MFP488</td></tr><tr><td>Clone 34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>抗体標識用蛍光色素</td></tr>に結合されています。<tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>蒸留水 (1.10)</td></tr> <tr><td>ポリ-L-リジン (20 kDa) で希釈し、ポリエチレングリコール (20 kDa)</td> <td>SuSoS AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td>を PBS (pH 7.4) で 0.5 mg/mL に希釈しました。</td></tr><tr><td>ローダミン 110 塩化</td>物 <td>Sigma-Aldrich</td><td>432202</td><td>既知の拡散係数: 3.3 &times; 10&minus;10 m2/秒 19</sup</td></tr><tr><td>>Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A20006</td><td>既知の拡散係数: 4.4 &times; 10&minus;10 m2/秒 20</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア:Confocor 3</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア:カーブフィッティングツールボックスMatlab</td><td></td><td>バージョンR2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tekチャンバーカバーガラス</td><td>Thermo-scientific&nbsp;</td><td>155411</td><td>8ウェル、1.0ホウケイ酸底部</td></tr></tbody></table>

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

蛍光相関分光法（FCS）は、高い空間及び時間分解能で生体膜内の分子の拡散を研究するための強力な技術です。 FCSは、細胞膜に蛍光標識された分子の分子濃度及び拡散係数を定量化することができます。この技術は、（プロセスは実際の測定時に結果に影響を与えることなく、すなわち、）定常状態における免疫細胞の原形質膜中の分子の分子拡散特性を探索する能力を有します。 FCSは、ほとんどの内因性タンパク質のための典型的なレベルで発現されるタンパク質の拡散を研究するのに適しています。ここでは、一次リンパ球上の細胞膜タンパク質の拡散速度を決定するための簡単かつ堅牢な方法が示されています。抗体染色生細胞と買収後の一般的に存在する観測に測定を実行するための効果的な方法が記載されています。最近の進歩フォト安定した蛍光色素の開発に測定中に広範囲に漂白しない染料を適切なために目的の抗体を結合することにより利用することができます。また、これは、細胞膜に発現したタンパク質の共通の特徴である、ゆっくりと拡散するエンティティの検出を可能にします。生成された自己相関曲線から分子濃度と拡散パラメータを抽出するための分析手順が強調表示されます。要約すると、FCS測定のための基本的なプロトコルが提供されます。それは、共焦点顕微鏡の理解ではなく、このような分子の拡散速度などの動的パラメータを測定するための技術の無い他の以前の経験と免疫学者を続けることができます。

典型的な結果は、膜タンパク質のための400ミリ秒に10ミリ秒の範囲内の通過時間との自己相関曲線を生成します。分子の数は、内因的に発現するタンパク質を約200μmの2あたりに0.5の間で変化することができます。 CPMが予想より低くないことを慎重に確認してください。これは、バックグラウンド信号の影響があることを意味します。経験則として、分析のために受理された細胞上のCPM信号が自由に同一のレーザパワーで抗体を拡散させるためのCPMの33％よりも低くするべきではありません。 CPMは、レーザパワーで直線的に拡張する必要があります。一次免疫細胞表面受容体に対する自己相関曲線は0.001と1秒との間の最も急な部分と、滑らかであることが期待されます。代表的な自己相関曲線とそのタイム・トレースについては、 図2を参照してください。 導入部で簡単に述べたように、再FCSが原因で信号を交絡するために貢献する蛍光変...

蛍光相関分光法(FCS)を用いて初代免疫細胞の膜におけるタンパク質拡散を測定する方法が記載されています。この論文では、蛍光標識のための抗体の使用について説明します。

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

このプロトコルの全体的な目標は、蛍光相関分光法を使用して、初代免疫細胞の膜における標識タンパク質の拡散速度を測定することです。この方法は、より活性な膜受容体ダイナミクスを持つナチュラルキラー細胞の同定など、免疫学および細胞生物学の分野における重要な問題を特定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、生細胞で使用されるため、分子の動きに自然な状態を正確に反映することです。この技術の意味は、分子拡散などのさまざまなナチュラルキラー細胞形質が、効率をよりよく予測できる機能に関連している場合、癌の免疫療法にまで及びます。この方法は、免疫細胞の分子運動に関する洞察を提供しますが、あらゆる分野の他の初代細胞や細胞株にも適用できます。ソフトウェアをエキスパートモードで開き、[新しい画像をスキャンする]オプションを選択します。共焦点レーザー走査型顕微鏡で40倍水対物レンズを選択します。「Acquire」タブで、「Config」ボタンと「Scan」ボタンを押して、「Configuration Control」と「Scan Control」を開きます。「ConfoCor」タブで「Measure」を押し、「Measurement」ウィンドウを開きます。次に、FCS測定値を保存するフォルダを作成します。新しい画像データベースを開始するには、[ファイル] タブの [新規] をクリックします。ハロゲンランプを点灯します。レーザーボタンを使用して、蛍光色素を励起するための関連するレーザーをオンにします。次に、[Configuration Control] ウィンドウでイメージ キャプチャの設定を指定します。これには、励起レーザー、励起および発光フィルター、光路、および使用中の検出器が含まれます。同様に、「Measurement」ウィンドウに移動し、「System Configuration」タブでFCS設定を調整します。FCS録音の検出チャンネルをアクティブにするには、緑のチャンネルをCh 1、赤のチャンネルをCh 2に切り替えます。レーザーが安定する間(最大30分かかる場合があります)、ピンホールを調整します。まず、ポリ-L-リジンでコーティングされた8ウェルチャンバーカバーガラススライドの1つのウェルに、50マイクロリットルの色素滴を中央に置きます。隣接するウェルは、キャリブレーションがスライドに依存するため、セル測定に使用されます。40X水対物レンズに蒸留水を一滴垂らし、スライドを配置します。次に、Visを押して可視光源を選択し、蛍光色素滴の中心位置に焦点を合わせます。ソフトウェアの「測定」ウィンドウで、「アクイジション」タブを選択し、「ポジション」で現在の位置を切り替えます。次に、同じウィンドウの[システム構成]タブに戻り、緑色のレーザーのパワーを高または飽和に設定します。信号の安定性をテストするには、[開始] を押して新しいウィンドウを開き、[時間トレース] と [自動相関] 曲線を表示します。蛍光シグナルが高く安定していること、およびy軸がキロヘルツ範囲の変動を示していることを確認します。値が低いのは、不正確な焦点合わせまたは色素の劣化が原因である可能性があります。次に、[測定]ウィンドウで、[O調整]ボタンを選択します。次に、正しい検出チャネルを選択し、自動調整Xを押します。結果の曲線の上限が欠落しているか、中央に配置されていない場合は、[粗い]オプションをマークし、[自動調整X]を再度押します。X方向を調整した後、自動調整Yを押してY方向についても同じことを行います。粗い選択を解除し、両方が明確な最大値と安定した値になるまで自動調整を押してXとYを交互に調整します。細胞が2つの異なる蛍光色素で標識されている場合は、隣接するチャンバーに赤色の蛍光色素溶液を一滴加えます。次に、2番目のチャネルを調整します。赤色レーザーを高出力に設定し、安定性校正手順を繰り返します。次に、フォーカスを介して自由に拡散する蛍光色素の通過時間を測定します。そして、ステージを使用して、焦点内にある細胞膜の面積を計算します。まず、調整手順を慎重に実行することにより、溶液の液滴に焦点を当てます。次に、測定ウィンドウの「アクイジション」タブに移動し、アクイジション時間を30秒に設定し、3回繰り返します。レーザー出力を飽和状態近くに設定し、[開始]を押して測定を行います。測定が完了したら、分子またはCPMあたりのカウントを記録します。次に、新しい測定を行い、レーザー出力を繰り返し削減します。この電力範囲内で、今後のセル測定の予想電力を含めます。次に、CPM値がレーザー出力に比例してスケーリングしていることを確認します。スケールの残りの部分が線形であれば、最高電力での飽和は許容されます。新たに標識した蛍光抗体を初めて使用する場合は、自由拡散抗体のFCS測定を行い、予想されるCPMを定量化します。また、遊離抗体にはPEG Poly-L-Lysineでコーティングされたウェルを使用することが重要です。この手順では、チャンバー付きスライドにポリエチレングリコールにグラフトされた200マイクロリットルのPoly-L-Lysineをコーティングします。溶液を室温で1時間接着させます。ストック溶液は最大2週間冷蔵できます。また、粉末ストックは冷凍庫に保管する必要があります。後で、液体を取り除き、チャンバーを風乾させます。顕微鏡で、抗体をPBSで1ミリリットルあたり1〜10マイクログラムに希釈します。遊離蛍光色素について前のセクションで説明したように、遊離抗体の通過時間の測定に進みます。細胞内で測定するには、PBS中の125マイクロリットルの細胞と、抗体標識細胞懸濁液からの1%FCSを加えます。そして、150マイクロリットルの透明なロズウェルパークメモリアルインスティテュートミディアム1640をPLLコーティングされたスライドガラスの空の井戸に入れます。細胞を暗所で測定温度で少なくとも20分間インキュベートしてから、細胞が接着して平衡化できるようにします。高速XYスキャンでイメージングを開始し、細胞の観察に必要な可能な限り低いレーザー出力を見つけます。次に、膜が明確に定義されている平均的な明るさの丸いセルに画像を配置します。細胞質に蛍光シグナルがないことが重要です。セルが画像の大部分を覆うまで拡大します。次に、細胞膜の上部に焦点を合わせます。細胞の中心から始めて、画像の中心が均一な蛍光を発する小さな丸い領域を示すまで上に移動します。焦点を慎重に配置することが重要です。焦点がメンブレンにない場合、検出される蛍光は蛍光標識されたメンブレン受容体から来ません。したがって、結果は彼らの行動を反映していません。次に、[Measurement]ウィンドウの[Acquisition]タブで、[Crosshair]をアクティブにしてFCS測定の位置を選択します。次に、繰り返し回数を 6 から 10 に設定し、[測定時間] を繰り返しあたり 10 秒に設定します。次に、[測定]ウィンドウの[システム構成]タブに戻り、FCS測定のレーザー出力を1〜10マイクロワットに下げます。次に、[スタート]を押します。最初の10秒間に強度トレースが30%以上低下した場合、セルは過度に漂白されているため、別のセルを低い電力で測定する必要があります。信号が失われた場合は、フォーカスをZ方向に調整して測定を再開してください。測定が完了したら、スキャン制御ウィンドウでセルがまだ中央に配置されていることを確認して、メンブレンが測定されたことを確認します。セルが移動した場合は、データを破棄します。次に、[自動相関]ウィンドウに移動し、ズーム操作、漂白、大きなクラスター、またはその他のアーティファクトを含む個々の繰り返しを手動で削除します。右クリックして「削除」を選択し、アーティファクトを削除します。実際の成果物を選択するには、練習が必要です。繰り返しの削除は簡単なプロセスですが、削除すべきものと削除すべきでないものを知るために、繰り返しを正しく評価する必要があります。次に、最終ファイルをFCS形式で保存します。アーティファクトの削除後に少なくとも 4 回の繰り返しが残っているセルのみを、さらなる分析のために保持します。典型的な膜受容体の自己相関曲線は滑らかで、通過時間は10〜400ミリ秒の範囲です。最も急な傾斜部分の始点と終点の両方(拡散を表す)が表されるように、フィット領域を設定します。2次元の自由拡散のモデルを使用してデータを適合させ、曲線の最も深く傾斜した部分に注意を払います。残差に見られるタウスケールでの1秒前後の小さな変動は許容されます。曲線の適合度が悪いが、セルに明らかな問題 (移動、漂白、クラスターなど) がない場合は、モデルの開始値または上限と下限を変更する必要がある可能性があります。モデルが自己相関曲線にうまく適合したら、変数パラメータの値を抽出します。分子の数は、内因性発現タンパク質の場合、1平方ミクロンあたり0.5から約200の間で変化します。細胞測定によるCPM値が、自由拡散抗体から記録されたCPM値の33%以上であることを確認してください。このビデオを見れば、蛍光相関分光法を使用してタンパク質の拡散速度を測定する方法について十分に理解できるはずです。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば5〜6時間で実行できます。この手順を試みるときは、測定開始の約20分前まで細胞を氷上に置いておくことが重要です。サンプルを2時間以上測定しないでください。この手順に続いて、拡散速度が特定のタンパク質の発現レベルとどのように相関するかなど、追加の質問に答えるために、イメージングなどの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、分子生物学と免疫学の分野の研究者が生細胞内のタンパク質のダイナミクスを探求する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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