Name: ラットにおける上腕と浅大腿動脈のフロー依存性血管拡張の超音波評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶラットの上腕動脈と浅大腿動脈における血流依存性血管拡張の超音波評価法。侵襲性のない手法で血管内皮機能を測定し、同一個体での経時的な複数回測定が可能です。

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すべての動物のイメージングは、ユタ大学の小動物イメージングコア施設で行われました。
この研究は、国立衛生研究所（R21 AG043952、R01 AG040297、K01 AG046326、K02 AG045339、R01 DK100505）)からの助成金によって部分的に資金提供されました。

すべての動物の手順は、実験動物の管理と使用14用のガイドに準拠し、ユタ大学、ソルトレイクシティ退役軍人医療センター動物実験によって承認されました。 1.動物の準備<ol><li> 100％の酸素中3％のイソフルランを含む麻酔導入室で動物を置きます。それは、外部刺激に応答しなくなるまで誘導室で動物を残します。 </li><li>誘導チャンバーから動物を削除し、心電図（ECG）電極を備えた加熱された診察台の上に置きます。酸素100％の3％イソフルランで麻酔を維持します。上腕と浅大腿動脈FMDを同時に行うことはできません。したがって、各測定のための準備手順は以下のとおりです。 </li></ol> 2.上腕動脈の準備<ol><li>仰臥位動物を置き、左上肢とANの各下肢を拘束外科手術用テープで診察台にimal。 </li><li>上肢の下部が若干プラットフォーム上に（〜0.2センチメートル）に上昇するように、動物の右上肢を抑制する。 </li><li>髪を除去するために、動物の右上肢に脱毛剤（例えば、Nairさん）を適用します。 </li><li>肘に右上肢遠位に位置閉塞カフ（直径標準血管閉塞器内腔10ミリメートル）。膨張/収縮が手足を動かし、超音波画像を乱すように、プラットフォームに閉塞器を休まないでください。 </li><li>超音波のキーボードを使用して、Bモードに超音波マシンを設定します。 </li><li>閉塞カフの近位に、動物の上肢に超音波ゲルの少量を適用します。 </li><li>手動で上肢と定位ホルダーに取り付けられた超高周波リニアアレイトランスデューサを合わせます。上腕動脈は2〜3ミリメートルの深見えるはずです。 </li><li>上腕動脈ではなく、上腕静脈は、されていることを確認するために、画像化され、超音波のキーボードを使用してPW-モードに切り替えます。連続血流を持つことになり、隣接する静脈とは対照的に、動脈は拍動の血流を持っています。 </li></ol> 3.浅大腿動脈の準備<ol><li>位置動物仰臥位とサージカルテープで検査テーブルに上肢と左下肢を拘束。 </li><li>パッド（例えば、折り畳まれた紙タオル）を使用してプラットフォーム上に高い位置（〜0.5〜1センチメートル）に動物の右下肢を拘束。 </li><li>髪を除去するために、動物の右下肢に脱毛剤（例えば、Nairさん）を適用します。脱毛後に大腿静脈は、上部太ももの内側にはっきりと見えるはずです。 </li><li>右足首に閉塞カフ（直径標準血管閉塞器内腔10ミリメートル）近位の位置を決めます。膨張/収縮が下肢を動かし、超音波画像を乱すように、プラットフォームに閉塞器を休まないでください。 </li><li>に超音波マシンを設定しますBモード。 </li><li>閉塞カフの近位に、動物の下肢に超音波ゲルの少量を適用します。 </li><li>手動で皮膚を通して見える大腿静脈、と定位ホルダーに取り付けられた超高周波リニアアレイトランスデューサを合わせます。浅大腿動脈は、1ミリメートルの深&lt;表示されるはずです。 </li><li>浅大腿動脈ではなく、大腿静脈は、画像化されていることを確認するために、PW-モードに切り替えます。連続血流を持つことになり、隣接する静脈とは対照的に、動脈は拍動の血流を持っています。 </li></ol> 4.ベースラインフェーズ<ol><li>それは人間の15で行われることになるのと同じようにBモード画像を、最適化します。両壁に可視化し、内膜 - メディアと容器の横、縦方向の画像が観察されていることを確認。少しできるだけ動脈の限りがキャプチャウィンドウに表示可能であることを保証するために、超音波プローブの配置を調整することにより、画像を最適化します。<ol><li>あるいは、明るさ/コントラスト、焦点域、周波数、ダイナミック・レンジ、及び線密度を変化させることで良好な画像を得るための超音波設定を調整します。そこに超音波画像を最適化するための他の方法があるが、それらの詳細な説明は、このプロトコルの範囲を超えています。 </li></ol></li><li>動脈画像の最適化の後、唯一の直径フレームが収集されることを保証するために、R波の間に撮影した画像のみを表示するには、ECGゲーティングをオンにする心周期の各拡張期部分の間にあります。 注：ECGゲーティングは、生理的な設定オプションの下にECGゲーティングを選択することで、このプロトコルで使用される超音波マシン上で利用可能である、しかし、この機能は、すべての超音波マシンで利用できない場合があります。画像が最適化された後、ECGゲーティングは、より低いフレームレートで画像を得ることが困難であるように、ターンオンされるべきである（すなわち、一度R波あたり）。 ECGゲーティング、ラットおよび高フレームの要求の高い心拍数の組み合わせなし心周期の拡張期部分だけ〜10-20秒のクリップを可能にしますキャプチャするレート。各クリップのデータの面倒な大きさと量は、実質的に分析負担を増大させます。 </li><li>録音Bモードを使用したベースライン・データの60秒。 注：超音波クリップに記録することができるフレーム数に制限があるような超音波装置は常に記録され、ただし、すべての画像は、超音波装置に格納されています。クリップの長さ（すなわち、フレーム数）の設定を調整することができます。クリップあたりのフレーム数の最大値に設定されたことが示唆されています。記録は、クリップ（すなわち、到達したフレームの最大数）の末尾にある場合、記録は継続しますが、クリップは、最新のフレームをキャプチャするロールフォワード。この場合、最大フレームリミットの外で捕獲された以前のフレームはその後削除されます。記録中のこれらの複雑さは、マシン間で異なるが、記録長の調整が必要であり得ます。 </li><li> SWIPW-モードにTCH。内腔の中央にカーソルを置きます。サンプルゲートは、カーソルを参照して自動的に配置されるが、超音波のキーボードを使用して、幅のために調整することができます。 ≤60°の超音波照射角を維持します。 <ol><li>ドップラービーム角度を変えることによって、超音波照射角度を調整します。超音波のキーボードを使用して角度を微調整してください。これらのいずれも測定に適した角度を提供する場合は、手動でより最適な角度に動脈を傾けることによって超音波プローブを調整します。超音波の角度の任意の調整が行われた場合、Bモード画像を取り戻します。 </li></ol></li><li>速度データの10秒を記録します。 </li></ol> 5.オクルージョンフェーズ<ol><li>空気で満たされた10ミリリットル注射器を用いて血管の閉塞器を膨らませます。血管の閉塞器内の空気の圧力を一定に保つために、自分自身にチューブを折ると、折り畳まれたチューブ上にバインダークリップを配置します。 </li><li>によって証明されるように、カフ閉塞を確認するために、PW-モードに切り替え血流速度の大幅な削減。 </li><li>閉塞の午前4時45分分まで、60秒のクリップにBモードと記録データに切り替えます。 </li><li> PW-モードに切り替えます。心拍数および分析のための各超音波クリップの時間の記録を保管してください。 </li></ol> 6.充血相<ol><li> PW-モードで録画中に折り畳まれた管からのバインダークリップを削除することによってカフを解放します。録音の前に5秒とカフリリース後5秒。 </li><li>閉塞後3分まで、60秒のクリップにBモードと記録データに切り替えます。心拍数および分析のための各超音波クリップの時間の記録を保管してください。 </li><li> FMDの完了後診察台から動物を削除し、それが胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで監視します。 </li></ol> 7.解析<ol><li>分析のために、公平を可能にするエッジ検出ソフトウェアを搭載したオフラインコンピュータへのDICOMファイルとしてエクスポートする超音波を抑止します各フレームでの動脈直径のmination。それは非常に時間がかかり、研究者バイアスの対象となるように分析は、超音波マシン上で可能である、しかし、それは、お勧めできません。 </li><li>ベースラインと、閉塞段階の間に60秒のセグメントにおける動脈径データを分析し、充血相中に10秒のセグメントインチ</li><li>自動エッジ検出ソフトウェアのフロー解析機能を用いて血流速度データを分析します。ベースラインと、閉塞段階の間に均一な外観の5以上の連続した波形を測定することにより、平均血流速度を決定します。すぐにカフリリース後に血液速度のための反応性充血の間の平均血流速度を決定します。最高血流速度の波形は、ピーク血流速度と考えられています。 </li></ol>

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</ol>

本研究では、FMDの非侵襲的測定は、上腕およびラットの浅大腿動脈に実証されました。ヒト6と同様に、5分間の閉塞期間の後、それによって動脈のその後の血管拡張をもたらし、動脈壁のせん断速度を増加させる血流速度（すなわち、反応性充血）の急激な増加がありました。 FMDは、上腕と浅大腿動脈の両方で観察されました。また、動脈の間FMDに強い関係がありました。ピーク剪断速度は、浅大腿動脈に高かったが、FMDは、せん断速度が動脈との間に強い関係を維持ピークに正常化しました。一緒に、これらの結果は、FMDの非侵襲的測定が正常ラットにおいて行うことができることを示しています。 FMDの測定は、二つの異なる動脈で行ったが、ベースラインからのパーセント変化として発現される場合、FMDの大きさは同様でした。 Howeveベースラインからの絶対変化として発現された場合、その動脈が浅大腿動脈より〜25％、より大きな静止直径を有していたように、R、FMDは、上腕動脈に高かったです。これらの結果は、FMDは、上腕で測定したヒトの研究と同じ被験者17,18における浅大腿...

血管内皮は、ライン動脈の内腔の細胞単層であり、血管機能の重要な調節因子です。血管径の調節をもたらす内皮細胞から放出され、多数の分子が存在します。これらの分子、一酸化窒素（NO）の中で、刺激に応答（せん断応力で例えば、インスリン、アセチルコリン、または変更）1における血管内皮から放出された主要な血管拡張性分子であると思われます。血管内皮では、NOは、NOシンターゼ（eNOSの）を内皮ない酵素によって生成され、続いて、内皮細胞2から放出されます。 NOは、リラクゼーションと増加し、血管径3を引き起こす血管平滑筋に拡散します。 内皮機能不全は、フロー媒介性拡張（FMD）技術4,5を用いて、ヒトにおいて非侵襲的に評価することができます。 FMDは、内皮由来ための機能バイオアッセイを表現することが提案されていますヒトでのNO生物学的利用能は、典型的には約5分肢閉塞6次反応性充血に応じて、上腕や浅大腿動脈で評価されていません。反応性充血はNO 8のリリースをシグナリング、内皮細胞7に形質導入された層状剪断力を増大させます。近年では、NO放出によって開始血管拡張の割合は9,10議論してきたが、FMDは、内皮依存性拡張を示すものであると一貫して心血管イベント11-13を予測することが示されています。 現在までに、研究の数千人は、ヒトにおける内皮機能の非侵襲的測定のためのFMD技術を採用しています。トランスレーショナルリサーチへのフォーカスの最近のシフトを考慮すると、げっ歯類における口蹄疫の非侵襲的測定のためのガイドラインは非常に有益であろう。翻訳アプローチを踏まえ、このプロトコルは、上腕とsupeにFMDの測定のために設立されましたこれらのサイトのようなラットのrficial大腿動脈は、最も一般的にヒトで測定されます。ラットにおける堅牢かつ反復FMD応答におけるこのプロトコルの結果は、しかし、ラットでの口蹄疫の測定は技術的に厳しいですし、他の研究者は、デモビデオずに複製するのは難しいかもしれません。したがって、以下の記事では、上腕とラットの浅大腿動脈における口蹄疫の非侵襲的測定のための方法を紹介します。

<table><tbody><tr><td>Vevo 2100 高解像度マイクロ超音波イメージングシステム</td><td>VisualSonics, トロント, オンタリオ州, CAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroScan 超高周波リニア アレイ トランスデューサー - MS-700 30-70 MHz</td><td>VisualSonics, トロント, オンタリオ州, CAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo イメージング ステーション</td><td>VisualSonics, トロント, オンタリオ州, CAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーマソニック ゲルウォーマー</td><td>Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA</td><td>82-03</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>Signacreme電極クリーム</td><td>Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA</td><td>17-05</td><td></td></tr><tr><td>Transpore surgical tape</td><td>3M, Maplewood, MN, USA</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>脱毛クリーム (e.g., Nair)</td><td>一般供給</td><td></td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>一般供給</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波ジェル</td><td>一般供給</td><td></td><td></td></tr><tr><td>標準血管閉塞器、10 mmルーメン径</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>62-0115</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe with Luer-Loktip</td><td>一般供給</td><td></td><td>閉塞カフ装置に使用</td></tr><tr><td>ペーパークリップ</td><td>一般供給</td><td></td><td>閉塞カフ装置に使用</td></tr> 皮<tr><td>下注射針 &ndash; 18ゲージ&nbsp;</td><td>一般的な供給</td><td></td><td>閉塞カフ装置に使用</td></tr><tr><td>ミディアムバインダークリップ</td><td>一般的な供給</td><td></td><td>閉塞カフ装置に使用</td></tr></tbody></table>

ラットにおける上腕と浅大腿動脈のフロー依存性血管拡張の超音波評価

Ultrasound Assessment of Flow-Mediated Dilation of the Brachial and Superficial Femoral Arteries in Rats

動脈の血管拡張が壁のせん断速度の増加に寄与することは、血管内皮機能を示しています。ヒトでは、内皮機能の非侵襲的測定は、通常は上腕動脈または表在性大腿動脈で行われる血流媒介拡張技術を採用することによって達成できます。簡単に言うと、超音波プローブの遠位に配置された血圧カフが収縮上圧まで膨らみ、四肢虚血を引き起こします。閉塞の5分後、カフは収縮し、反応性充血と壁のせん断速度の増加を引き起こし、血管拡張分子が内皮から放出されるのを信号で送り、血管拡張を誘発します。ヒトで血流を介した拡張を行った研究は数千件ありますが、驚くべきことに、生きたラットでこの技術を非侵襲的に実施した研究はありません。近年、トランスレーショナルリサーチに焦点が移っていることを考えると、ラットや他のげっ歯類における血流を介した拡張を非侵襲的に測定するためのガイドラインを確立することは非常に価値があります。次の記事では、ラットの上腕動脈および表在性大腿動脈における流れ媒介性拡張の非侵襲的測定のためのプロトコルが提示されます。

フロー媒介拡張8 Wistarラットの上腕および浅大腿動脈で行いました。ラットの位置決めは、図1に示されています。 浅大腿動脈の代表的な超音波画像は、 図2に示されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54762/54762fig1.jpg" /> 図1. ラットおよび超音波ポジショニング。 上腕（A）の測定および浅大腿（B）動脈FMDのためのラットのポジショニング。上腕の測定（C）および浅大腿（D）動脈FMDのための超音波プローブと閉塞カフの位置決め。 <a href="http://ecsource.jove.com/fil...

ヒトにおける内皮機能の非侵襲的評価は、フロー媒介拡張技法によって決定することができます。研究の数千人がこの技術を使用しているが、何の研究では、ラットで非侵襲的にこのテクニックを行いませんでした。次の資料は、上腕のフロー依存性血管拡張およびラットの浅大腿動脈の非侵襲的測定を説明します。

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of ...

この手順の全体的な目的は、上腕動脈および浅大腿動脈の流れによる拡張（FMD）を測定することで、生存しているラットの血管内皮機能を非侵襲的に評価することです。ここに記載する方法では、動物への器具装着や犠牲処置を行うことなく動脈および内皮機能の評価が可能となり、これにより研究者は同一のラットを用いて介入期間中に経時的な複数回の測定を行うことができます。一般的に、このプロトコルに不慣れな方は、超音波イメージングが困難であるため苦労することがあり、特にラットの場合は動脈の解剖学的サイズが小さいため、より困難となります。動物を麻酔した後、検査台の上に背臥位で固定し、眼軟膏を塗布します。外科用テープを用いて、左右の上肢および下肢をそれぞれ台に固定します。次に、除毛クリームを右前肢に使用して皮膚を露出させます。同じ肢に、10 mmの標準的な血管閉塞カフを装着します。閉塞装置を動作させると肢が動き、イメージングを損なう可能性があるため、使用されるまで閉塞装置はオフにしたままにしてください。次に、超音波診断装置をBモードに設定します。次に、上腕動脈の上に少量の超音波用ゼリーを塗布します。ステレオタキシスホルダーに取り付けた超高周波リニアアレイプローブを、上肢に合わせて手動で調整します。上腕動脈は約3～5mmの深さに視認できるはずです。静脈ではなく動脈をイメージングしていることを確認するため、PWモードに切り替えます。隣接する静脈の流れが持続的であるのに対し、動脈では拍動性の血流が認められます。動物を前と同様に準備しますが、今回は右後肢を挙上させます。次に、除毛クリームを塗布して拭き取り、肉眼で確認できる大腿静脈の位置を確認します。この準備において、閉塞カフを右足首の近位に装着しますが、カフをプラットフォームの上に置かないようにしてください。その後、超音波診断装置をBモードに設定します。閉塞カフの近位側に少量の超音波用ゼリーを塗布し、ステレオタキシスホルダーに装着した超高周波リニアアレイプローブを大腿静脈に合わせて手動で調整します。大腿浅動脈が深さ約1〜2 mmで確認できるはずです。PWモードを使用して、それが大腿静脈ではないことを確認してください。動脈は、血流が連続的である隣接する静脈とは異なり、拍動性の血流を有しています。Bモード画像を最適化するには、まず血管の水平方向の縦断像が観察されていることを確認してください。次に、超音波プローブの配置をわずかに調整し、動脈の視認性を最大限に高めます。その他の標準的な最適化戦略も使用可能です。画像を最適化した後、ECGゲーティングオプションを有効にし、R波の間にキャプチャされた画像のみが表示されるようにします。次に、各心周期の各拡張期に、直径フレームが1つだけ収集されることを確認してください。ECGゲーティングを行わない場合、ラットの高い心拍数と拡張期径を捉えるための高いフレームレートの組み合わせにより、クリップの長さは10〜20秒に制限されます。クリップの数とデータ量が増えると、解析の負荷が大幅に増加します。そこで、クリップの録画時間を、1クリップあたりの最大フレーム数に設定するか、少なくともラットの1分間あたりの心拍数より10〜20フレーム長く設定してください。次に、Bモードで60秒間のベースラインデータを記録します。続いて、PWモードに切り替えます。その後、カーソルをルーメンの中央に配置します。サンプルゲートはカーソルを基準に自動的に配置されるため、超音波診断装置のキーボードを使用して幅を調整します。次に、ドップラービームの角度を変更し、その後キーボードで微調整を行って、入射角を60度以下に調整します。さらに調整が必要な場合は、プローブを傾けてより最適な角度に設定してください。次にPWモードで、超音波照射角度を正しく設定した状態で、クリップの記録時間を10秒に設定し、10秒間の血流速度データを記録します。まず、空気で満たした10 milliliterシリンジを用いて血管閉塞装置を膨らませます。その後、チューブを折り曲げ、バインダークリップで空気を封じ込めます。PWモードで、カフの閉塞を確認します。血流速度が明らかに低下しているはずです。その後、Bモードに切り替え、クリップの長さを60秒に設定します。閉塞後4分45秒が経過するまでデータを記録します。各記録の開始時と終了時の心拍数、および各記録の合計時間を記録してください。4分45秒経過後、PWモードに切り替え、5秒間記録します。次に、カフを解除し、解除前後の5秒間を記録します。カフ解除中に超音波モードを切り替えると、画像がずれる場合があるため、直ちに超音波プローブを調整する必要があります。この手順を練習することで、効率と習熟度を向上させることができます。次に、Bモードに切り替え、60秒間のクリップで3分間データを記録します。各クリップの開始時に、心拍数と時間を記録してください。テスト終了後、動物を検査台から下ろし、胸腹臥位を維持できる十分な意識が回復するまで観察します。記述された手順を用いて、8匹のListerラットの上腕動脈および浅大腿動脈におけるFMDを検討した。解析の結果、ベースラインからの変化率として表すと、上腕動脈と浅大腿動脈の間で同様の血管拡張反応が認められた。ベースラインからの絶対変化量は上腕動脈で有意に高く、これはおそらく血管間の顕著なサイズの違いによるものであると考えられる。それにもかかわらず、上腕動脈と浅大腿動脈のFMDをベースラインからの変化率または絶対変化量として表すと、両者の間には強い線形関係が認められました。また、ベースライン期、閉塞期、および血流再開期に他の心血管変数も測定しました。剪断刺激で標準化した後、ピーク剪断率に対する血管拡張能は、浅大腿動脈よりも上腕動脈においてより高い値を示しました。これは、最大ずり速度で正規化した後のベースラインからの絶対変化として表したFMDについても同様でした。しかし、最大ずり速度で正規化したパーセントFMDと絶対FMDの間には強い線形関係が認められました。習得すれば、この手順は20分から30分で完了できます。この手法を実施する際は、時間を正確に管理し、同一の撮像部位を維持することが重要です。私たちは、ヒトでの研究に基づいたこの手法をラットで実施できるよう適応させました。ヒトでの開発後、この手法は心血管生理学の研究者が、動脈および内皮機能の関連性と、それが臨床的な心血管疾患にどのように関与しているかを探究する道を切り開きました。

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Medicine

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ラットにおける上腕と浅大腿動脈のフロー依存性血管拡張の超音波評価

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