ジカウイルス感染細胞培養系と

本研究の全体的な目的は、ジカウイルスの複製を研究するための哺乳類細胞を用いたin vitroジカウイルス感染培養系を確立し、さらにこのin vitroプラットフォームを創薬に活用することです。ジカウイルス感染細胞培養系に関するこの詳細なステップバイステップのプロトコルは、ジカウイルスが媒介する疾患の病原性メカニズムおよびウイルスの毒性の進化を解明するのに役立ちます。本手法の主な利点は、薬剤およびワクチンの開発に向けたジカウイルスの大規模生産が可能になることです。

まず、T75培養フラスコ内で細胞密度が80%に達したVero細胞を回収します。フラスコから培地を吸引し、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。0.25%トリプシンを2 mL加え、37 °Cで5分間インキュベートします。インキュベーション後、血清含有増殖培地を8 mL加えてトリプシンを不活性化させます。次に、細胞を15 mLチューブに移します。続いて、細胞液を10 µL採取し、等量の0.4%トリパンブルーと混合します。調製した混合液を細胞計数用チェンバーのスライドにロードし、自動細胞カウンターを用いて生存細胞数を計測します。合計700万個の細胞を、30 mLの容量でT160フラスコに播種します。翌日、1フラスコあたり10 mLの無血清培養培地を用いて、適切な感染多重度（MOI）のジカウイルス接種液を調製します。

感染の拡大を防ぐため、ウイルスの安全な取り扱いが極めて重要です。

T160フラスコから使用済みの培地を除去し、新鮮に調製したウイルス接種液を10 milliliters全量加えます。接種したフラスコを37 °C、5% CO2条件下で4〜6時間インキュベートします。インキュベーション中、1時間ごとにフラスコを緩やかに傾けて接種液を分散させます。インキュベーション終了後、接種液を温めた血清添加増殖培地30 millilitersに交換します。その後、さらに96時間ウイルス培養を継続します。4日後、位相差顕微鏡を用いて細胞単層上のウイルスプラークの出現を観察し、感染の進行を確認します。必要に応じて、40倍および200倍の倍率で画像を撮影してください。

96時間目に細胞培養上清を回収し、300 ×gで10分間、4°Cで遠心分離して細胞残渣を除去します。遠心分離後、沈殿した残渣を乱さないように注意して上清を回収し、15 mLチューブに移します。

ウイルス培養上清を分注し、-80°Cで保存します。

ウイルスのタイターを測定するには、まず、未感染のVero細胞を12ウェルプレートに、1ウェルあたり1 × 10⁵ cells、液量 2 mLで播種します。翌日、無血清培地を用いてT160フラスコから回収したウイルス培養上清の10倍連続希釈系列を調製します。

タイター測定用のウイルス培養上清の段階希釈液を調製する際は、感染を防ぐため、ウイルスを安全に取り扱ってください。

次に、Vero細胞を含む12ウェルプレートの各ウェルから使用済み培地を除去し、希釈した接種液400 µLをVero細胞に3連で加えます。接種したプレートを組織培養インキュベーターで4〜6時間インキュベートします。

インキュベーション終了後、接種物をウェルあたり2 mLの血清添加培地と交換します。接種から48時間後、位相差顕微鏡を用いて、適切な希釈段階におけるウイルスフォーカス数をカウントします。ウイルス力価をミリリットルあたりのプラーク形成単位（PFU/mL）として算出します。

12ウェルプレート内のVero細胞に高力価および低力価のジカウイルスを接種し、48時間および96時間インキュベートした後、ジカウイルスゲノムの発現を定量PCRで評価し、二本鎖RNAを免疫細胞化学法で評価して、ゲノム複製を解析します。

免疫細胞化学染色では、12ウェルプレートの各ウェルから培地を除去し、各ウェルに1 mLのメタノールを加えます。4 °Cで30分間、細胞を固定します。次に、固定した細胞を1x PBSで3回洗浄します。その後、ブロッキングバッファーを加え、室温で1時間インキュベートします。マウスモノクローナル抗二本鎖RNA抗体J2をブロッキングバッファーで1:100に希釈して細胞に加え、この溶液中で4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、ヤギ抗マウスIgG-594二次抗体をブロッキングバッファーで1:1,000に希釈し、細胞を1x PBSで洗浄した後、これを加え、室温で1時間インキュベートします。細胞を1x PBSで洗浄した後、Hoechst染料を用いて核を染色し、蛍光顕微鏡を用いて100倍の倍率で細胞を観察します。

前述と同様に、ナイーブなVero細胞を12ウェルプレートに播種して6時間後、目的のサイトカインを指定の濃度で生物学的重複（バイオリケート）で添加します。処理から12時間後にジカウイルス感染を行い、感染させない陰性対照ウェルを設けます。感染から4時間後、ウイルス接種液をサイトカイン処理済みの培地に交換し、さらに37 °Cで44時間インキュベートします。感染から48時間後に、位相差顕微鏡を用いてウイルスプラーク数をカウントし、感染細胞の代表的な画像を40倍の倍率で取得します。

このグラフは、RT-qPCRによって測定されたジカウイルスのゲノム量を表しています。PanジェノタイプおよびPRVABC-59株の両方のプライマーにおいて、同等の感度と特異性が示されました。予想通り、C型肝炎ウイルスプライマーでは産物の増幅は認められませんでした。

低力価および高力価の感染細胞における、指定された時点でのジカウイルスの増殖キネティクスを、非感染のモックコントロールと比較してここに示します。免疫細胞化学染色の結果から、感染後48時間では感染細胞が少数のクラスターとして存在しているのに対し、感染後96時間ではほとんどの細胞が感染していることがわかります。このグラフは、ビークルコントロールと比較した、さまざまなサイトカインによるジカウイルスの増殖調節を示しています。

これらの位相差顕微鏡画像は、サイトカイン処理の有無によるジカウイルス感染細胞の状態を示しています。感染細胞によって形成されたウイルスプラークが焦点として観察されます。インターフェロン処理を施したウェルには、ウイルスプラークが形成されていないことに注目してください。

本手順に続き、ウイルス蛋白の局在化や蚊およびヒト細胞における複製を解析するためのジカウイルス高解像度ドメインマッピングなどの他の手法を用いることで、疾患の病原性メカニズムの解明やウイルス毒性の進化といったさらなる課題に取り組むことができます。このビデオを視聴することで、ジカウイルスの複製を研究するための哺乳類細胞を用いたin vitroジカウイルス感染培養系の構築方法と、医薬品およびワクチン開発におけるin vitroプラットフォームの活用方法について、十分に理解できるはずです。