Name: ジカウイルス感染細胞培養系とインビトロ予防効果 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぼう、ジカウイルスの哺乳類細胞培養系構築法。Vero細胞を用いたインビトロ感染系で、ウイルス複製メカニズムと病原性を解明し、大規模生産による治療薬・ワクチン開発を支援する技術です。

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ジカウイルス株のPRVABC59を提供してくださった米国疾病管理予防センター（CDC）のアーロン・ブロー博士とブランディ・ラッセル博士に感謝いたします。この原稿の校正をしてくださったイェール大学のNicholas Ten氏に感謝します。この研究は、V.A.のCedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Awardによって支援されました。

注：作業の流れの模式的な概要を図1に示されています。 1.細胞<ol><li>ジカウイルスの産生およびウイルス複製サイクルの分析のためのVero細胞を使用してください。 </li><li>完全な10％ウシ胎児血清（FBS）を含む増殖培地、2mMのL-グルタミン、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100単位/ ml）、および10mM HEPESを準備します。 </li><li> 5％CO 2で37℃で指定の完全増殖培地で培養Vero細胞。 </li></ol> 2.ジカウイルスの生産<ol><li> T-75フラスコ中の0.25％トリプシンを用いて80％の細胞密度でVero細胞を採取し、細胞を数えます。 <ol><li> T-75培養フラスコから培地を吸引し、2mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。 </li><li> 0.25％トリプシンの2ミリリットルを加え、37℃で5分間フラスコをインキュベートします。 </li><li>トリプシンを不活性化するために、増殖培地を含む血清の8ミリリットルを追加します。上下SUSにピペット保留細胞を15mlチューブに細胞を移すと。 </li><li>細胞の10μLを削除し、0.4％トリパンブルーの同量と混合。細胞計数チャンバースライドにプレミックスをロードし、生存細胞は自動細胞カウンターを用いてカウントし得ます。 </li></ol></li><li> T-160フラスコに30ミリリットルボリューム7万個の細胞の合計をシード。 </li><li>翌日、フラスコ当たり10ミリリットルの無血清培地中でジカウイルス接種物（0.1 MOI 0.01）感染症の適切な多重度を準備します。 </li><li> T-160フラスコから使用済み培地を外し、新たに調製したウイルス接種（10ミリリットル）を追加します。 </li><li> 4-6時間、5％CO 2で37℃で接種したフラスコをインキュベートします。静かにすべての時間で横向きにフラスコを傾けることによって、接種物を広げます。 </li><li>インキュベーションの終了時に、各フラスコのために暖かい血清添加増殖培地（30ml）で接種材料を交換してください。その後、次の96時間のためにウイルス培養を続けます。 </li><li>での進行を確認します位相差顕微鏡を使用し、40Xおよび200X倍率での必要に応じた画像（ 図2）を取る細胞単層にウイルスプラークの出現を観察することによりフェクション。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" /> 図2：様々な倍率のVero細胞の単層上ジカウイルスによって形成されたプラーク明視野画像は48 HPIでZikaウイルスプラークを示します。単分子膜上の丸い細胞病巣の存在に注意してください。 （スケールバー= 50μm）は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="8"><li>収穫細胞培養上清を96時間の時点で、細胞破片を除去し、4℃で10分間、300×gで上清を遠心。 </li><li>慎重にペレット化破片や転送トンを乱すことなく上清を除去し15ミリリットルチューブO。 24,000×gで超遠心分離（オプション）は、ウイルス粒子を濃縮するために行うことができます。 </li><li> -80℃で複数のアリコート中のウイルス培養上清を保管してください。 </li></ol> 3.プラークアッセイによってジカウイルスの力価を測定<ol><li> 12ウェルプレートを使用して、2ミリリットルの体積でウェル当たり1×10 5細胞でシードナイーブVero細胞。 </li><li>翌日、無血清培地を使用して、T-160フラスコから採取したウイルス培養上清の10倍連続希釈液を準備します。各ウェルから使用済み培地を取り出して、三重にVero細胞上に準備された接種物の400μlを添加します。 </li><li> 37で接種したフラスコをインキュベート 4-6時間、5％CO 2とC°。優しくごとに1時間で横向きプレートを傾けることによって接種材料を広げます。 </li><li>インキュベーションの終わりに、血清添加培地（ウェル当たり2ml）で接種材料を交換してください。 </li><li> 48時間後の接種では、位相CONTRを用いてウイルス増殖巣を数えますAST顕微鏡。 1ml当たりのプラーク形成単位（P​​FU）のようなウイルス力価を計算します。プラークアッセイのために、図3を参照してください。 </li><li>修正プラークの明確な可視化のために20％エタノール中で調製した4％ホルムアルデヒドで細胞を0.1％クリスタルバイオレット溶液を染色します。 </li></ol> 4. Zikaウイルスゲノム複製アッセイ<ol><li> 12ウェルプレートを使用して、2ミリリットルの容量でウェル当たり1×10 5細胞でシードナイーブVero細胞。三重で無血清培地を用いて、低および高力価の、次の日、ウイルス接種物（400μL/ウェル0.01および0.1のMOI）を準備します。モック感染のために、無血清培地（400μL/ウェル）のみを使用します。 </li><li> 、手順3.4から3.2を繰り返します。 </li><li> 48および96時間の時点で、RNAおよび免疫細胞化学（ICC）のためのサンプルを収集。 <ol><li>収穫RNAサンプルについては、各ウェルに直接溶解溶液の400μlを添加し、溶解物を収集し、メディアを削除します。 </li><li> ICCのために、メディアおよびトンを削除鶏は、各ウェルに1mlのメタノールを添加することにより細胞を固定し、4℃で30分間プレートをインキュベートします。 </li><li>細胞溶解物から、製造者の指示に従ってRNA単離キットを用いて全RNAを単離します。分光光度計を用いてRNAを定量化します。 </li></ol></li><li>回収RNAからZIKVゲノムコンテンツを決定するために、二段階逆転写定量的PCR（RT-qPCRの）を実行します。 <ol><li> RNAを逆転写するために、最初の0.2ミリリットルチューブ内で単離されたRNAの5μgの、dNTPの1μL（10 mM）の、および1μlのランダムヘキサマー（250 ngの）から成る13μlの反応ミックスを設定します。 65℃で5分間チューブをインキュベートした後、1分間氷の上に置きます。続いて、逆転写酵素を1μl、5×鎖合成バッファー4μlの、0.1 Mジチオスレイトールの1μlを、反応ミックスにRNase阻害剤の1μlを添加します。 50℃、inactivで60分間、続いて25℃でさらに5分間チューブをインキュベート15分間70℃に加熱することにより反応を食べました。 </li><li> 5&#39;-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 &#39;：DNAポリメラーゼおよびジカウイルスのための特定の10mM1μlの個々のプライマーについて[ジカウイルスパン-遺伝子型プライマーを（含む2倍の緑色の色素スーパーミックス12.5μlの得られたcDNAの1μLを使用して定量PCRを実行します; REV：5&#39;-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 &#39;）、ジカウイルスアジア遺伝子型PRVABC59株プライマー（5&#39;-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3&#39;; REV：5&#39;-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 &#39;）]、またはC型肝炎ウイルス（JFH RTQ F：5 「CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R：5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;）、またはのための細胞のハウスキーピング遺伝子GAPDH（5&#39;-CCACCTTTGACGCTGGG-3&#39;; REV：5&#39;-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3 &#39;）、25μlの反応体積です。 </li><li>リアルタイムPCRシステムでは30秒15秒、60°C（40サイクル）の実行条件95°Cを用いてPCRを行います。 </li><li> Zを正規化するために、サイクル閾値（Ct）値に基づいて、GAPDH発現レベルを使用ウイルスゲノムの測定IKA。 GAPDHのそれと比較しZikaゲノムのデルタCT（のΔCt）値を計算し、2 のΔCt値を得ます。そして、指示された時点で、感染及び非感染細胞との間の正規化されたZikaゲノムコンテンツの比率を取ることによって、倍率変化を計算します。 ZIKVゲノムの複製の結果については、 図4を参照してください。 </li></ol></li><li>メタノール固定した細胞を使用してICCを実行します。 <ol><li> （PBS中0.1％のTriton-X 100、3％ヤギ血清、3％BSA）1×PBSで固定した細胞を3回洗浄し、ICCブロッキング緩衝液でブロックします。 </li><li>ブロッキング緩衝液中で100と4℃で一晩インキュベート：1の希釈でマウスモノクローナル抗のdsRNA抗体J2（1μg/ ml）を使用してください。 </li><li> 1×PBSで細胞を洗浄し、1で二次抗体ヤギ抗マウスIgG-594（1μg/ ml）を追加しますブロッキングバッファー1,000希釈し、室温で1時間インキュベートします。 </li><li>ヘキスト染料を使用して、核のために1×PBSおよび染色で細胞を洗浄し、100Xの倍率で蛍光顕微鏡（ 図4）を用いて細胞を観察します。 </li></ol></li></ol> 5.ジカウイルス感染に対するサイトカインライブラリをスクリーニング<ol><li> 12ウェルプレートを使用してあたり1×10 5個の細胞をナイーブVero細胞を播種します。細胞は（6時間後に播種）添付されると、生物学的重複で指示された濃度（2ミリリットル容量/ウェル）で各サイトカインを追加します。車両（PBS）単独の対照を含めます。 </li><li> 12時間後処理では、Zikaウイルス感染（ウェル当たり400μlの0.1のMOI）を行います。感染症（モック）なしの陰性対照ウェルを含めます。 </li><li> 4時間後の感染では、サイトカイン処理されたメディア（2ミリリットル）とのウイルス接種を交換してください。追加の44時間、37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> 48時間の感染後に、位相差顕微鏡を用いてウイルスプラークをカウントし、40倍の倍率（ 図5）で感染させた細胞の代表的な画像を取得します。 </li></ol>

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<li>Ozaslan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+therapy+for+acute+hepatitis+C+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy.</a> Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、in vitroでジカウイルスを培養するための合理化されたプロトコルが提示されます。含む、ウイルス培養を拡大するための最適なエンドポイントを識別し、力価を測定し、ゲノムの複製を定量化する重要なステップを提供しました。ジカウイルスは、感染性物質の処理中に、生物学的安全手順が厳密に従うべきであり、人間の病原体である、そう。サル腎臓細胞株、ベロは、様々なウイルス学的アッセイを実証するために使用しました。 Zikaウイルス複製の動態は、様々な組織や種の細胞で異なる場合があります。先に説明したように15の追加の細胞株を使用することができます。ジカウイルスは、感染した胎児3の脳組織から単離された皮質神経前駆細胞14に感染することが示されています。このように、神経細胞にZIKV感染の病態生理を評価するには、追加の細胞特異的な洞察を提供することができます。アフリカやアジアの遺伝子型の神経毒性表現型の違いを調べることができますこの感染培養系を使用して。ここに記載のウイルス製造手順は、非ヒト霊長類またはげっ歯類モデル系におけるin vivo病原性...

ジカウイルス（ZIKV）は、小頭症、貧しい妊娠1,4を成果に関連した重要なヒト病原体です。 ZIKVは、デング熱、西ナイル、セントルイス脳炎ウイルスなどの神経学的欠陥を引き起こす可能性が医学的に関連するフラビウイルスのセットに属します。ウイルス伝播の主なモードに加えて、性行為も5,6報告されている、蚊ベクターネッタイシマカによるものである、と。 ZIKVが原因蚊ベクトルの拡大地理的分布と先天性欠損症との強い相関関係に世界の主要な健康問題となっています。 ZIKVが最初Zika林におけるセンチネルアカゲザルから1947年に単離された、ウガンダ、最初の人間の場合は1952 7,8で報告されました。発熱、発疹、頭痛、結膜炎、および筋肉/関節痛などの軽度の症状を示すZIKVに感染する個人。感染した妊婦は胎児1にZIKVを送信することができます。 ZIKV感染はまた、ギラ ​​ン・バレー症候群、末梢神経自己免疫脱髄障害9に関連しています。 Zikaウイルスゲノムは、長さが約10.8キロベースであるプラスセンス一本鎖RNA分子から成ります。ゲノムの構造は、タンパク質コード領域に隣接する非コード領域（NCR）と、5&#39;NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3&#39;NCRとして編成されています6。単一のポリタンパク質（3419 AA）はコポリマーおよび翻訳後10より小さなペプチドに切断されている翻訳されています。 5&#39;NCRと3&#39;NCR RNAステム - ループ構造の両方は、ウイルスゲノムの翻訳および複製の開始に重要な役割を果たしています。ゲノムの構造部品はキャプシド、膜およびエンベロープタンパク質で構成されています。非構造タンパク質は、ゲノム複製のために重要です。 現在、Zikaウイルス株は、3つの主要な遺伝子型に分類されます。西アフリカ、東アフリカ、そしてアジア6,10-13。それは、後にさらに12を進化させ西アフリカとアジア、に東アフリカ系統普及ことが提案されています。アジアの遺伝子型は、アメリカの現在の集団発生の原因です。ジカウイルスは、蚊及び哺乳動物細胞の両方において培養することができます。一次皮膚線維芽細胞、未熟樹状細胞、皮質神経前駆細胞、およびベロ細胞がZikaウイルス感染10,14,15を受けやすいです。両方のI型およびII型インターフェロンは、皮膚線維芽細胞15でZIKV成長を抑制することが示されています。この研究の目的は、哺乳動物細胞培養系におけるアジア遺伝子型ZIKAウイルス株PRVABC59の産生およびアッセイのための段階的な詳細なプロトコルを提供し、薬剤開発プラットフォームとしてこの感染培養系の有用性を実証することです。このリソースは大幅にさらに私を解明するZikaウイルスおよび神経学的研究コミュニティに利益をもたらす可能性を秘めていますウイルスの病原性のウイルスの病原性と進化のtsのメカニズム。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコ修正されたイーグル」シグ</td><td>マライフサイエンス</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red&nbsp;&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルーステイン 0.4%</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ T10282</td><td></td></tr><tr><td>伯爵夫人 &ndash;自動セルカウンター</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Countess-cell counting&nbsp; chamber slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗dsRNA抗体 J2&nbsp;</td><td>日本語 &サイエンティフィックコンサルティングKft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ IgG アレクサ フロー 594</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ A11020</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio12K Flex リアルタイム PCR システム</td><td>Thermo Fischer</td><td>4471088</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Vero Cell Line&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ジカウイルス株 PRVABC59</td><td>CDC(CDC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-1アルファ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>ペプロテック</td><td>200-01A&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-α</td><td>ペプロテック</td><td>300-01A&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>インターフェロンαA&nbsp;&nbsp;</td><td>R&D Systems</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>インターフェロンベータ</td><td>Peprotech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>インターフェロンガンマ</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5415R</td><td>エッペンドルフ</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5810R</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>ニコン エクリプス Ti 免疫蛍光顕微鏡 ニコン インテンスライト C-HGFI</td><td>ニコン</td><td>訪問ニコン リクエスト</td><td></td></tr></tbody></table>

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

ジカウイルス（ZIKV）は、小頭症、眼の欠陥、および成長障害などの胎児の発育異常にリンクされている新興病原体です。 ZIKVは、 フラビウイルス科のRNAウイルスです。 ZIKVは主に蚊によって送信されるだけでなく、胎児の垂直感染への母体だけでなく、性的接触によって広げることができます。現在までに、ウイルスに感染したものを保護するために利用可能な信頼性の高い治療法やワクチンのオプションがありません。再現性のある、効果的なジカウイルス感染細胞培養系の開発はZIKV複製だけでなく、薬物およびワクチン開発の分子メカニズムを研究するために重要です。この点で、ウイルス産生および増殖の分析のために哺乳動物細胞に基づくインビトロジカウイルス培養系内を記述するプロトコルはここで報告されます。ウイルス力価を測定するための細胞単層およびプラークアッセイにジカウイルスによってプラークの形成の詳細が提示されています。ウイルスゲノムの複製動態二本鎖RNAゲノムreplicatory中間体が決定されます。この培養プラットフォームはZikaウイルス増殖の強力な阻害剤として、インターフェロン-α（IFN-α）、IFN-βおよびIFN-γの識別結果としてのサイトカインの小さなセットのライブラリーに対してスクリーニングするために利用されました。要約すると、in vitroでの感染Zikaウイルス培養系と様々なウイルス学的ア ​​ッセイが大きく、さらにウイルスの病原性とウイルスの病原性の進化のメカニズムの解明に研究コミュニティに利益をもたらす可能性を秘めているこの研究で実証されています。抗ウイルスIFN-αは、さらに感染した妊婦を含む高リスク集団におけるジカウイルス感染症の予防、露光後、予防、および治療の選択肢として評価することができます。

Zikaウイルス株（PRVABC59; GenBank登録番号KU501215）アジア遺伝子型のは、この研究12で使用しました。 80％コンフルエントでVero細胞をデノボ Zikaウイルス感染を調べるために使用しました。ウイルス産生およびその後のウイルス学的特徴付けのために、初期継代（P3）ジカウイルスを用いました。ウイルスプラークは、感染の二日目に観察されました。最初に感染した細胞から放出さZikaウイルス子孫は、単層培養（ 図2）上に表示斑の形成をもたらし、隣接するセルに分散させることができます。 Zikaウイルス感染の細胞変性効果（CPE）は、このような細胞ならびに溶解性の細胞死の丸めや剥離などの形態学的変化によって特徴付けられます。 ウイルス力価を測定するために、T-160フラスコから回収したウイルスを含有する無細胞上清を、10-FOLに供しましたD段階希釈し、12ウ...

ジカウイルス(ZIKV)は、新たな病原体であり、胎児の発育異常と小頭症に関連しています。効果的な感染性細胞培養システムの確立は、ZIKVの複製研究だけでなく、ワクチンや医薬品の開発にも重要です。この研究では、ZIKVに関連するさまざまなウイルス学的アッセイが示され、議論されています。

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

本研究の全体的な目的は、ジカウイルスの複製を研究するための哺乳類細胞を用いたin vitroジカウイルス感染培養系を確立し、さらにこのin vitroプラットフォームを創薬に活用することです。ジカウイルス感染細胞培養系に関するこの詳細なステップバイステップのプロトコルは、ジカウイルスが媒介する疾患の病原性メカニズムおよびウイルスの毒性の進化を解明するのに役立ちます。本手法の主な利点は、薬剤およびワクチンの開発に向けたジカウイルスの大規模生産が可能になることです。まず、T75培養フラスコ内で細胞密度が80%に達したVero細胞を回収します。フラスコから培地を吸引し、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。0.25%トリプシンを2 mL加え、37 °Cで5分間インキュベートします。インキュベーション後、血清含有増殖培地を8 mL加えてトリプシンを不活性化させます。次に、細胞を15 mLチューブに移します。続いて、細胞液を10 µL採取し、等量の0.4%トリパンブルーと混合します。調製した混合液を細胞計数用チェンバーのスライドにロードし、自動細胞カウンターを用いて生存細胞数を計測します。合計700万個の細胞を、30 mLの容量でT160フラスコに播種します。翌日、1フラスコあたり10 mLの無血清培養培地を用いて、適切な感染多重度（MOI）のジカウイルス接種液を調製します。感染の拡大を防ぐため、ウイルスの安全な取り扱いが極めて重要です。T160フラスコから使用済みの培地を除去し、新鮮に調製したウイルス接種液を10 milliliters全量加えます。接種したフラスコを37 °C、5% CO2条件下で4〜6時間インキュベートします。インキュベーション中、1時間ごとにフラスコを緩やかに傾けて接種液を分散させます。インキュベーション終了後、接種液を温めた血清添加増殖培地30 millilitersに交換します。その後、さらに96時間ウイルス培養を継続します。4日後、位相差顕微鏡を用いて細胞単層上のウイルスプラークの出現を観察し、感染の進行を確認します。必要に応じて、40倍および200倍の倍率で画像を撮影してください。96時間目に細胞培養上清を回収し、300 ×gで10分間、4°Cで遠心分離して細胞残渣を除去します。遠心分離後、沈殿した残渣を乱さないように注意して上清を回収し、15 mLチューブに移します。ウイルス培養上清を分注し、-80°Cで保存します。ウイルスのタイターを測定するには、まず、未感染のVero細胞を12ウェルプレートに、1ウェルあたり1 × 10⁵ cells、液量 2 mLで播種します。翌日、無血清培地を用いてT160フラスコから回収したウイルス培養上清の10倍連続希釈系列を調製します。タイター測定用のウイルス培養上清の段階希釈液を調製する際は、感染を防ぐため、ウイルスを安全に取り扱ってください。次に、Vero細胞を含む12ウェルプレートの各ウェルから使用済み培地を除去し、希釈した接種液400 µLをVero細胞に3連で加えます。接種したプレートを組織培養インキュベーターで4〜6時間インキュベートします。インキュベーション終了後、接種物をウェルあたり2 mLの血清添加培地と交換します。接種から48時間後、位相差顕微鏡を用いて、適切な希釈段階におけるウイルスフォーカス数をカウントします。ウイルス力価をミリリットルあたりのプラーク形成単位（PFU/mL）として算出します。12ウェルプレート内のVero細胞に高力価および低力価のジカウイルスを接種し、48時間および96時間インキュベートした後、ジカウイルスゲノムの発現を定量PCRで評価し、二本鎖RNAを免疫細胞化学法で評価して、ゲノム複製を解析します。免疫細胞化学染色では、12ウェルプレートの各ウェルから培地を除去し、各ウェルに1 mLのメタノールを加えます。4 °Cで30分間、細胞を固定します。次に、固定した細胞を1x PBSで3回洗浄します。その後、ブロッキングバッファーを加え、室温で1時間インキュベートします。マウスモノクローナル抗二本鎖RNA抗体J2をブロッキングバッファーで1:100に希釈して細胞に加え、この溶液中で4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、ヤギ抗マウスIgG-594二次抗体をブロッキングバッファーで1:1,000に希釈し、細胞を1x PBSで洗浄した後、これを加え、室温で1時間インキュベートします。細胞を1x PBSで洗浄した後、Hoechst染料を用いて核を染色し、蛍光顕微鏡を用いて100倍の倍率で細胞を観察します。前述と同様に、ナイーブなVero細胞を12ウェルプレートに播種して6時間後、目的のサイトカインを指定の濃度で生物学的重複（バイオリケート）で添加します。処理から12時間後にジカウイルス感染を行い、感染させない陰性対照ウェルを設けます。感染から4時間後、ウイルス接種液をサイトカイン処理済みの培地に交換し、さらに37 °Cで44時間インキュベートします。感染から48時間後に、位相差顕微鏡を用いてウイルスプラーク数をカウントし、感染細胞の代表的な画像を40倍の倍率で取得します。このグラフは、RT-qPCRによって測定されたジカウイルスのゲノム量を表しています。PanジェノタイプおよびPRVABC-59株の両方のプライマーにおいて、同等の感度と特異性が示されました。予想通り、C型肝炎ウイルスプライマーでは産物の増幅は認められませんでした。低力価および高力価の感染細胞における、指定された時点でのジカウイルスの増殖キネティクスを、非感染のモックコントロールと比較してここに示します。免疫細胞化学染色の結果から、感染後48時間では感染細胞が少数のクラスターとして存在しているのに対し、感染後96時間ではほとんどの細胞が感染していることがわかります。このグラフは、ビークルコントロールと比較した、さまざまなサイトカインによるジカウイルスの増殖調節を示しています。これらの位相差顕微鏡画像は、サイトカイン処理の有無によるジカウイルス感染細胞の状態を示しています。感染細胞によって形成されたウイルスプラークが焦点として観察されます。インターフェロン処理を施したウェルには、ウイルスプラークが形成されていないことに注目してください。本手順に続き、ウイルス蛋白の局在化や蚊およびヒト細胞における複製を解析するためのジカウイルス高解像度ドメインマッピングなどの他の手法を用いることで、疾患の病原性メカニズムの解明やウイルス毒性の進化といったさらなる課題に取り組むことができます。このビデオを視聴することで、ジカウイルスの複製を研究するための哺乳類細胞を用いたin vitroジカウイルス感染培養系の構築方法と、医薬品およびワクチン開発におけるin vitroプラットフォームの活用方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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ウイルス感染の抗体依存性増強を調べるためのin vitroアッセイ

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ジカウイルス増殖の強力な阻害剤としてのインターフェロンをスクリーニングするためのIn vitroアッセイ

このビデオでは、ヒト胎児の神経幹細胞にジカウイルスを感染させる手順を実演しています。感染した細胞は、さらなる研究に使用できます。...

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脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

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ジカ ウイルス (ZIKV) のための Ifnar1-/-マウスのモデルの immunoprivileged 器官の抗原特異的 T 細胞応答を評価するためのプロトコルを説明します。このメソッドは、有効性評価の貴重なも ZIKV...

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ここでは、ヒト細胞におけるジカウイルスの感染と複製をリアルタイムで研究するための非常に簡単で簡単な方法として、細胞ベースの電気インピーダンス(CEI)の使用を示します。さらに、CEIアッセイは抗ウイルス化合物の評価に有用である。...

ジカウイルス阻害剤をリアルタイムで評価するための細胞ベースの電気インピーダンスプラットフォーム

学ぼう、ジカウイルスの哺乳類細胞培養系構築法。Vero細胞を用いたインビトロ感染系で、ウイルス複製メカニズムと病原性を解明し、大規模生産による治療薬・ワクチン開発を支援する技術です。

ジカウイルス感染細胞培養系と

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