マイクロカプセル化アプリケーション用の抽出プラントベースのカプセル

この手順の全体的な目標は、マイクロカプセル化アプリケーション用のスポロポレニンExineカプセル(SEC)を抽出するための合理化されたプロセスを確立することです。この方法では、食品やヘルスケアのアプリケーション向けにクリーンなマイクロキャプチャを迅速に提供できます。この手法の主な利点は、SEC抽出プロセス時間を大幅に短縮して、クリーンで無傷のSECを生成できることです。

この方法は、合理化されたSECの抽出プロセスに関する洞察と広範な段階的特性評価を提供できますが、さまざまな植物ベースの生体材料の基本的な微細構造および形態学的評価を探索するためにも使用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、高温で腐食性の高い酸を含む従来の8〜10日間の抽出プロセスのために苦労します。この手順を開始するには、ガラスコンデンサー、水循環システム、およびウォーターバスを備えたヒュームフードに還流セットアップを準備します。

SEC抽出プロセスには腐食性の高い酸と有機溶媒の使用が含まれるため、ゴーグル、白衣、フェイスマスク、危険通知付きの手袋などの適切な個人用保護具を使用してプロセスを実行する必要があります。100グラムのLクラバタム胞子を慎重に計量し、ほこりを発生させたり、発火源から離したりします。次に、胞子を磁気攪拌ロッドを備えた1リットルのPTFE丸底フラスコにゆっくりと移します。

胞子に500ミリリットルのアセトンを加え、フラスコを穏やかに振って均質な懸濁液を形成します。次に、フラスコを摂氏50度にセットし、還流コンデンサーに接続されたウォーターバスに入れます。懸濁液を200RPMで攪拌しながら6時間還流するように加熱します。

懸濁液を室温で冷ました後、真空下で濾紙でろ過し、脱脂した胞子を大きなガラスシャーレに集めます。ペトリ皿を溶媒蒸発用の穴のあるアルミホイルで覆うことにより、胞子を室温で乾燥させます。乾燥して脱脂した乾燥胞子を1リットルのPTFEフラスコに移した後、500ミリリットルの85%リン酸溶液を加えます。

フラスコを摂氏70度に設定されたウォーターバスに入れ、還流コンデンサーに接続します。懸濁液を攪拌しながら30時間逆流するように加熱します。懸濁液が室温まで冷えたら、500ミリリットルの温かい脱イオン水で希釈し、濾紙を使用した真空ろ過によりSECを回収します。

その後、SECを3リットルのガラスビーカーに移し、一連の洗浄を行います。ドラフトに800ミリメートルの高温脱イオン水を加え、10分間静かに攪拌します。次に、濾紙を使用して真空下で懸濁液をろ過します。

SECを清潔な3リットルのガラスビーカーに移します。前の手順を5回繰り返した後、SECに600ミリリットルのホットアセトンを加え、10分間静かに攪拌します。SECを真空下でろ過して収集し、きれいな3リットルのガラスビーカーに移します。

適切な溶剤を使用して前の手順を繰り返した後、きれいなSECを6つの大きなガラスシャーレに移し、室温のドラフトで24時間乾燥させてすべての水分を取り除きます。次に、SECを摂氏60度と1ミリバールの真空オーブンで10時間、または一定の重量になるまで乾燥させます。次に、乾燥させたSECをポリプロピレンボトルに移し、ドライキャビネットに保管します。

1.2ミリリットルのウシ血清アルブミン、またはBSA溶液を脱イオン水に調製し、50ミリリットルのポリプロピレンチューブに移します。.150ミリグラムのSECをBSA溶液に加えます。混合物を10分間ボルテックスして、均質な溶液を形成します。

チューブを濾紙で覆った後、凍結乾燥機フラスコに移し、1ミリバールの真空で4時間乾燥させます。BSAを装填したSECが乾いたら、乳鉢と乳棒で凝集体を取り除きます。次に、BSAを装填したSECを50ミリリットルのチューブに移し、2ミリリットルの脱イオン水を追加して残留BSAを除去します。

4, 704で5分間遠心分離することによりSECを収集します。終了したら、上清を捨てます。脱イオン水で洗浄を繰り返します。

これに続いて、BSAをロードしたSECを含むチューブを濾紙で覆います。その後、SECを冷凍庫に1時間移します。SECを24時間凍結乾燥します。

SECは、さらなる特性評価が行われるまで冷凍庫で保管します。2ミリリットルのポリプロピレンチューブに5ミリグラムのBSA充填SECを使用してください。1.4ミリリットルのPBSを加え、5分間渦巻きます。

これに続いて、懸濁液を40%振幅で10秒間3サイクル超音波処理します。終了したら、0.45ミクロンのポリエーテルスルホンフィルターを使用して溶液をろ過します。プラセボSECで前のステップを実行した後、プラセボをブランクとして使用して、BSA負荷SECの吸収剤を280ナノメートルで測定します。

最後に、PBSのBSA標準曲線を使用して、カプセル化されたBSAの量を定量化します。SEM画像は、ユニークな微細構造を持つ無傷の胞子を示しており、処理前にミクロンスケールのスポロプラズム細胞小器官が断面画像で観察されました。胞子の脱脂とアルカリ処理では、形態学的および構造的変化は観察されませんでした。

酸分解後のSEM画像は、スポロプラズム材料を欠いた無傷のSECを示しています。CHN分析により、脱脂およびアルカリ処理SECでは、実質的なタンパク質性物質の除去は観察されません。タンパク質性物質の大部分は酸分解で除去されます。

DIPA分析は、最大30時間の酸分解後のSECの均一なサイズ分布を示しています。SECの構造的完全性は、酸分解が長引くと低下します。SEMおよびDIPAのデータは、脱脂ステップの後、酸分解により均一なサイズの分布を持つ無傷のSECが生成されたことを示しています。

CLSMデータは、未処理のSECが胞子腔内のスポロプラズム成分により自己蛍光を示すことを示しています。アシドーシスのみの処理後、すべてのスポロプラズム内容物が除去されます。FITC-BSAのカプセル化後、SEC内部で緑色の蛍光が観察されます。

SEM画像は、BSAローディング後の無傷のマイクロリッジを示しています。カプセル化されたSECからのBSA定量化は、マイクロカプセル化プロセスの一貫性と、SECのグラムあたり0.170±0.01グラムのBSA負荷との一貫性を確認します。

この合理化されたSEC抽出プロセスを習得すると、適切に実行されれば48時間で完了できます。この手順をさまざまな植物の胞子や花粉に対して試みる際には、無傷でクリーンなカプセルを実現するために、構造形態学的および元素分析の段階的な評価を覚えておくことが重要です。この手順に続いて、アルカリ酵素を含む他の抽出プロセスを実行して、多様な植物ベースのカプセルに対する最適化されたプロセスの実現可能性を確認できます。

この技術は、その開発後、マイクロカプセル化、薬物送達、および組織工学の分野の研究者が、次世代の生体材料として多様な植物ベースのSECを探求する道を開きました。このビデオを見れば、植物の胞子や花粉粒からSECを抽出して特性評価する方法、および薬物や生体高分子をSECにカプセル化する方法を十分に理解できるはずです。