マイクロカプセル化アプリケーション用の抽出プラントベースのカプセル

この手順の全体的な目的は、マイクロカプセル化への応用のためのスポロポレニン外壁カプセル（SEC）を抽出するための効率的なプロセスを確立することです。この手法により、食品およびヘルスケア分野への応用において、クリーンなマイクロキャプチャを迅速に提供することが可能になります。この技術の主な利点は、SECの抽出プロセス時間を大幅に短縮し、クリーンで完全な状態のSECを製造できる点にあります。

この手法は、簡略化されたSECの抽出プロセスや詳細な段階的特性評価に関する知見を提供できるだけでなく、さまざまな植物由来バイオマテリアルの基本的な微細構造および形態学的評価の検討にも利用可能です。一般的に、この手法に不慣れな人は、高温下で腐食性の高い酸を用いる従来の8〜10日間にわたる抽出プロセスのため、習得に苦労します。本手順を開始するには、ガラスコンデンサー、水循環システム、およびウォーターバスを備えた還流装置をドラフトチャンバー内に準備してください。

SEC抽出プロセスでは腐食性の高い酸および有機溶媒を使用するため、ゴーグル、白衣、フェイスマスク、および危険通知付きの手袋などの適切な個人用保護具を着用して作業を行ってください。粉塵を飛散させず、火気のない場所で L clavatum 胞子100 gramsを正確に量り取ります。その後、胞子をマグネチックスターラーバーを入れた1LのPTFE製丸底フラスコにゆっくりと移します。

胞子に500 millilitersのacetoneを加え、フラスコを軽く振って均一な懸濁液を作製します。次に、50 degrees Celsiusに設定されたウォーターバスにフラスコを設置し、還流冷却器に接続します。200 RPMで撹拌しながら、懸濁液を6時間還流加熱します。

懸濁液を室温で冷却させた後、真空条件下でろ紙を用いてろ過し、脱脂胞子を大きなガラス製ペトリ皿に回収します。溶媒が蒸発するように穴を開けたアルミニウム箔でペトリ皿を覆い、胞子を室温で乾燥させます。乾燥し脱脂された胞子を1リットルのPTFEフラスコに移した後、85%リン酸溶液を500ミリリットル加えます。

フラスコを70 °Cに設定したウォーターバスに入れ、還流冷却器に接続します。懸濁液を攪拌しながら30時間還流させます。懸濁液が室温まで冷却されたら、500 mLの温脱イオン水で希釈し、ろ紙を用いて吸引ろ過によりSECを回収します。

次に、一連の洗浄を行うため、SECを3リットルのガラスビーカーに移します。ドラフトチャンバー内で、SECに800 mLの熱い脱イオン水を加え、10分間ゆっくりと攪拌します。その後、吸引ろ過を用いて懸濁液をろ過します。

SECを清潔な3Lのガラスビーカーに移します。前述の工程を5回繰り返した後、SECに600 mLの熱アセトンを加え、10分間穏やかに攪拌します。真空ろ過によりSECを回収し、清潔な3Lのガラスビーカーに移します。

適切な溶媒を用いて前述の手順を繰り返した後、洗浄済みのSECを6枚の大きなガラス製ペトリ皿に移し、ドラフト内で室温で24時間乾燥させて、すべての水分を除去します。次に、SECを真空乾燥機に入れ、60 °C、1 mbarの真空条件下で10時間、または恒量になるまで乾燥させます。その後、乾燥させたSECをポリプロピレンボトルに移し、ドライキャビネット内で保管します。

脱イオン水を用いた1.2 mLのウシ血清アルブミン（BSA）溶液を調製し、50 mLポリプロピレンチューブに移します。BSA溶液に150 mgのSECを添加します。混合物を10分間ボルテックスし、均一な溶液にします。

フィルターペーパーでチューブを覆った後、凍結乾燥用フラスコに移し、1 millibarの真空状態で4時間乾燥させます。BSA担持SECが乾燥したら、乳鉢と乳棒を用いて凝集物を除去します。次に、BSA担持SECを50 milliliterチューブに移し、2 milliliterの脱イオン水を加えて残留BSAを除去します。

4,704 ×gで5分間遠心分離し、SECを回収します。終了後、上清を捨てます。脱イオン水を用いて洗浄を繰り返します。

続いて、BSAを充填したSECsが入ったチューブをフィルターペーパーで覆います。その後、SECsをフリーザーに移して1時間静置します。さらに、SECsを24時間凍結乾燥させます。

さらなる特性解析を行うまで、SECをフリーザーで保存します。BSAを充填したSEC 5 mgを、2 mLポリプロピレンチューブに入れます。1.4 mLのPBSを加え、5分間ボルテックスします。

続いて、サスペンションを振幅40%で10秒間×3サイクルのプローブ超音波処理します。処理後、0.45 micronポリエーテルスルホンフィルターを用いて溶液をろ過します。プラセボSECについても同様の操作を行った後、プラセボをブランクとして、BSAをロードしたSECの280 nanometersにおける吸光度を測定します。

最後に、PBS中のBSA標準曲線を用いて、カプセル化されたBSA量を定量します。SEM画像では、独自の微細構造を持つ完全な胞子が示されており、処理前の中切断面像ではミクロンサイズの胞子質細胞小器官が観察されました。胞子の脱脂およびアルカリ処理を行っても、形態学的および構造的な変化は見られませんでした。

酸加水分解後のSEM像では、胞子質物質が消失し、構造が維持されたSECが観察されます。CHN分析では、脱脂およびアルカリ処理を施したSECにおいて、実質的なタンパク質様物質の除去は見られませんでした。タンパク質様物質の大部分は、酸加水分解によって除去されます。

DIPA分析により、最大30時間の酸加水分解後においても、SECが均一なサイズ分布を示すことが明らかになりました。長時間の酸加水分解に伴い、SECの構造的完全性は低下します。SEMおよびDIPAのデータは、脱脂工程後の酸加水分解によって、均一なサイズ分布を持つ完全なSECが生成されたことを示しています。

CLSMデータは、未処理のSECが胞子腔内のスポロプラズム成分に起因する自己蛍光を示すことを示しています。酸分解処理のみを行った後は、すべてのスポロプラズム内容物が除去されます。FITC-BSAで封入した後、SEC内部に緑色蛍光が観察されます。

SEM画像は、BSA担持後もマイクロリッジが維持されていることを示しています。SECへのBSA担持後、直径、円形度、およびアスペクト比に実質的な変化は認められませんでした。封入されたSECからのBSA定量により、SEC 1 gあたり0.170 ± 0.01 gのBSAが担持されており、マイクロカプセル化プロセスの整合性が確認されました。

この簡略化されたSEC抽出プロセスを習得すれば、適切に実施することで48時間で完了させることができます。さまざまな植物胞子や花粉でこの手順を試みる際は、完全でクリーンなカプセルを得るために、構造的形態および元素分析による段階的な評価を行うことが重要です。本手順に続き、アルカリ酵素を用いた他の抽出プロセスを実施し、多様な植物由来カプセルに対する最適化プロセスの実効性を確認することができます。

この技術の開発により、マイクロカプセル化、ドラッグデリバリー、および組織工学の分野の研究者が、次世代のバイオマテリアルとして多様な植物由来のSECを探索することが可能となりました。このビデオを視聴することで、植物の胞子や花粉粒からSECを抽出し、その特性を解析する方法、および薬物やバイオ高分子をSECに封入する方法について十分に理解できるはずです。